O uso da tecnologia de DNA recombinante abre portas para um estudo detalhado da estrutura e função de proteínas, e a produção de proteínas recombinantes em sistema procarioto apresenta várias vantagens. A presente tese propõe a expressão heteróloga das proteínas aSFP, proteína ácida do fluido seminal bovino de 14 kDa, e osteopontina (OPN) de 55 kDa, relacionadas à congelabilidade do sêmen. Foram construídas bibliotecas de cDNA de vesícula seminal, próstata e glândula bulbouretral. Oligonucleotideos iniciadores foram sintetizados baseados nas seqüências disponíveis no GenBank (aSFP: número de acesso NM_174616, OPN: número de acesso M66236). Os amplicons resultantes das reações de PCR foram clonados em pET23a(+). Os plasmidios pET-aSFP e pET-OPN foram transformados em linhagens eletrocompetentes de E. coli BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. Para expressão das proteínas recombinantes foram testadas diferentes concentrações de indutor de expressão IPTG, e diferentes tempos e temperaturas de indução. A expressão recombinante foi avaliada por SDS-PAGE, usando como controle cultivo não induzido. Das cinco linhagens transformadas com pET-aSFP, somente E. coli BL21 pLysS induzida com 0,5 mM de IPTG por 3 horas a 37°C apresentou uma banda de aproximadamente 15 kDa, compatível com o tamanho esperado de aSFPr-6xHis. Por cromatografia de afinidade com metal imobilizado em condições desnaturantes foi possível um rendimento de purificação de 2,5mg/mL de aSFPr-6xHis por 10 mL de cultura bacteriana. Contudo, a expressão de OPNr-6xHis, também obtida com a linhagem de E. coli BL21 pLysS, foi de baixa eficiência, o que não permitiu sua purificação. A produção recombinante de proteínas do plasma seminal é uma das mais novas ferramentas para o estudo de suas funções. O aperfeiçoamento dos processos de expressão e purificação é fundamental no desenvolvimento desta biotecnologia, que possui grande potencial terapêutico e diagnóstico. / The use of recombinant DNA technology makes possible a deeper investigation on protein structure and function. Also the production of recombinant proteins has several advantages. The present thesis presents the recombinant expression of the 14 kDa acidic seminal fluid protein (aSFP) and osteopontin (55 kDa), both associated with bovine semen freezability. cDNA libraries from prostate, seminal vesicle and bulbouretral gland were constructed, and primers were designed based on data available on Genebank (aSFP: access number NM_174616; OPN: access number M66236). Amplicons of the target genes were cloned into pET23a(+), and the constructs pET-aSFP and pET-OPN were transformed into electrocompetent E. coli strains: BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. For the expression trials, different concentrations of IPTG were tested, as well several different expression induction conditions. The recombinant expression was analyzed by SDS-PAGE and western blotting. The best expression for aSFPr-6xHis (15 kDa) was obtained with the strain BL21 pLysS, induced with 0.5 mM IPTG in 3 hours at 37°C. The target protein was purified by immobilized metal ion chromatography in denaturing conditions with a yield of 2.5 mg/mL per 10 mL of bacterial culture. The recombinant expression of OPNr-6xHis was also possible with the pLysS strain, however in a lower efficiency. The low amount of recombinant OPN did not allow its purification. The production of seminal plasma recombinant proteins is a new tool for the study of its functions. The improvement of expression and purification processes is important for this biotechnology which has a great potential for therapeutic and diagnose applications.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001-02-21Bitstream added on 2014-06-13T21:07:59Z : No. of bitstreams: 1 lima_jfs_dr_rcla.pdf: 2743915 bytes, checksum: 1c051fa4de489a04cb215276b7d9ad67 (MD5) / Foram coletados exemplares roedores de pequenos porte em diversas localidades do estado do Tocantins, distribuídas em 3 tipos de região de acordo a vegetação predominante: Norte sob a influência da Floresta Amazônica, Centro-Sul e Leste sob influência do Cerrado e Médio Araguaia constituído pelo complexo da Ilha do Bananal. As preparações cromossômicas foram submetidas à coloração convencional, assim como às técnicas de bandas G, C e RON. Diferenciação cromossômica foi produzida nos cromossomos de alguns indivíduos, após tratamento das células com brometo de etídio. Foram cariotipados um total de 102 exemplares distribuídos em 9 gêneros e 12 espécies: Bolomys lasiurus (2n=34 e NA=34), Calomys tener (2n=66 e NA=66), Calomys sp.n. (2n=46 e NA=66), Nectomys rattus (2n=52, 53 e NA=52, 54), Oligoryzomys flavescens (2n=64 e NA=66), Oligoryzomys sp.n. (2n=70 e NA=76), Oryzomys megacephalus (Cariótipo A com 2n=54 e NA=62; Cariótipo B com 2n=52/53 e NA=58/60), Oryzomys gr. subflavus (2n=46 e NA=56), Rhipidomys macrurus (2n=44 e NA=48), pertencentes à família Cricetidae; Proechimys roberti (2n=30 e NA=54), Trichomys apereoides (2n=30 e NA=54), pertencentes à família Echimyidae; e Rattus rattus (2n=38 e NA=58), pertencente a família Muridae. Da espécie Oecomys gr. concolor, não obtivemos preparações cromossômicas. A grande maioria das espécies tem ocorrência relatada para as regiões Norte e Centro-Oeste do Brasil e a respectiva cariologia já é conhecida. Observa-se que os cariótipos encontrados são, de maneira geral, similares ou idênticos àqueles descritos na literatura, com raros casos de polimorfismos cromossômicos. Alguns exemplares da / Small rodents were collected at different sites in the state of Tocantins, distributed into three types of region according to the predominant vegetation: North, under the influence of the Amazon Forest, Mid-South and East under the influence of the Cerrado, and Middle Araguaia consisting of the complex of Bananal Island. The chromosomal preparations were submitted to conventional staining, as well as to G, C and NOR banding techniques. Chromosome differentiation was produced in the chromosomes of some individuals, after cell treatment with ethidium bromide. A total of 102 specimens were karyotyped, and they were distributed into 9 genera and 12 species: Bolomys lasiurus (2n=34 and NA=34), Calomys tener (2n=66 and NA=66), Calomys sp.n. (2n=46 and NA=66), Nectomys rattus (2n=52, 53 and NA=52, 54), Oligoryzomys flavescens (2n=64 and NA=66), Oligoryzomys sp.n. (2n=70 and NA=76), Oryzomys megacephalus (Karyotype A with 2n=54 and NA=62; Karyotype B with 2n=52/53 and NA=58/60), Oryzomys gr subflavus (2n=46 and NA=56), and Rhipidomys macrurus (2n=44 and NA=48), belonging to the family Cricetidae; Proechimys roberti (2n=30 and NA=54) and Trichomys apereoides (2n=30 and NA=54), belonging to the family Echimyidae, and Rattus rattus (2n=38 and NA=58), belonging to the family Muridae. Chromosome preparation from Oecomys gr. concolor were not obtained. The majority of the species have been reported to occur in the Northern and Mid-Western regions of Brazil and their karyology is already known. The...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-30Bitstream added on 2014-08-13T18:01:11Z : No. of bitstreams: 1 000736106.pdf: 1310930 bytes, checksum: 28ecc16bb9798a305ffacdd9b95396fe (MD5) / O Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) é uma região do genoma com um denso agrupamento de genes que apresentam alto grau de polimorfismo. Os genes do MHC estão divididos em regiões que apresentam similaridades funcionais, contendo genes da classe I, II e III, sendo que em bovídeos a classe II é subdividida em dois agrupamentos denominados IIa e IIb. Genes da classe II do MHC têm chamado muito a atenção, se tratando de animais de produção, diante da necessidade de melhorar métodos de controle de doenças, por meio do desenvolvimento de novas vacinas e seleção de animais resistentes. Desta forma, o presente trabalho visou à realização de um estudo da diversidade alélica do gene DRB3 em três raças de búfalo de rio criadas no Brasil (Mediterrâneo, Jafarabadi e Murrah) utilizando a técnica de PCR-RFLP. As amostras de DNA foram extraídas de bulbo folicular de 24 animais da raça Mediterrâneo, 23 animais da raça Jafarabadi e 18 animais da raça Murrah. As reações de PCR foram realizadas com volume total de 30 μl e o produto de PCR obtido foi digerido com três enzimas de restrição: RsaI, HaeIII e PstI. Os pares de iniciadores de PCR produziram produto de PCR de aproximadamente 300 bp de tamanho. A digestão com a enzima de restrição RsaI apresentou oito alelos, com tamanhos aproximados: O (300 bp), RsaI-A (230+70 bp), RsaI-B (180+120 bp), RsaI-C (130+90+70 bp), RsaI-D (140+90+70 bp), RsaI-E (120+70+60 bp), RsaI-F (120+110+70 bp) e RsaI-G (110+70+60+55 bp), sendo cinco alelos (O, RsaI-A, RsaI-B, RsaI-C, RsaI-E) na raça Mediterrâneo, quatro alelos (O, RsaI-A, RsaI-F e RsaI-G) na raça Jafarabadi e três alelos (O, RsaI-A e RsaI-D) na raça Murrah. Em todos os produtos de PCR, das três raças, o genótipo homozigoto para o alelo O foi o mais frequente (300bp/300bp). Com a enzima de restrição HaeIII foram observados quatro alelos, com tamanhos aproximados ... / The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a genome region with have a dense clusters of genes that showing a high degree of polymorphism. The genes of the MHC are divided in regions that show similar functions, and contain genes of the classe I, II and III. The class II, in bovides is subdivided in two clusters called IIa and IIb. Much attention has been given to class II genes, especially to the livestock, because the production animal has a need of more efficient methods to control diseases through the development of vaccines and selection of resistant animals. Therefore, the present work aimed study the allelic diversity of the DRB3 gene in three breeds of river buffaloes raised in Brazil (Mediterranean, Jafarabadi and Murrah) by PCR-RFLP. DNA samples were extracted from follicle bulb of 24 Mediterranean, 23 Jafarabadi and 18 Murrah buffaloes breeds. The PCR reactions have 30 μl of volume and the PCR product was digested with three restriction enzymes: RsaI, HaeIII and PstI. The primers pairs produced a PCR product with 300 bp size proximally. Digestion with the restriction enzyme RsaI presented eight alleles, with proximally sizes: O (300 bp), RsaI-A (230+70 bp), RsaI-B (180+120 bp), RsaI-C (130+90+70 bp), RsaI-D (140+90+70 bp), RsaI-E (120+70+60 bp), RsaI-F (120+110+70 bp) and RsaI-G (110+70+60+55 bp), and were five alleles (O, RsaI-A, RsaI-B, RsaI-C and RsaI-E) in the Mediterranean breed, four alleles (O, RsaI-A, RsaI-F and RsaI-G) in the Jafarabadi breed and three alleles (O, RsaIA and RsaI-D) in the Murrah breed. In all of the PCR products, of the three breeds, the homozygote genotype for the allele O was the most frequent (300bp/300bp). Digestion with the HaeIII restriction enzyme produced four alleles, with proximally sizes: HaeIII-A (220+80 bp), HaeIII-B (170+80+50 bp), HaeIII-C (210+80 bp) and HaeIII-D (170+130 bp), where the Mediterranean breed presented the four alleles ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-02Bitstream added on 2014-06-13T19:43:41Z : No. of bitstreams: 1 ayres_dr_dr_jabo.pdf: 831838 bytes, checksum: e4cae8bab8f98b5467c6670c4f6be10b (MD5) / Com o objetivo de investigar a variação genética para característica resistência a carrapato e encontrar o modelo mais adequado para avaliação genética desta característica, foram utilizados dados de contagem de carrapato (CC) por infestação natural em bovinos cruzados Hereford x Nelore. Primeiramente os dados de CC obtidos de rebanhos localizados nos estados de Rio Grande do Sul (RS), Paraná (PR), Mato Grosso do Sul (MS) e São Paulo (SP) foram transformados para log10(CC+1) e agrupados em duas regiões, definidas por análise de agrupamento. Cada grupo foi considerado como uma característica diferente e com a utilização de um modelo bi-característica foram estimados os componentes de (co)variância e ainda avaliada a ocorrência de interação genótipo x ambiente para a característica. As estimativas de herdabilidade observadas para resistência à infestação por carrapatos foram baixas sugerindo que exista a possibilidade de seleção para animais resistentes a carrapato, porém com um lento progresso genético. Foi observada alta correlação genética para a característica contagem de carrapatos entre os dois grupos e não foi observada interação genótipo x ambiente para esta característica na população de estudo. Posteriormente, foi realizado um estudo comparativo quanto à habilidade preditiva e o ajuste de diferentes modelos para avaliação da característica contagem de carrapatos. Para isso foram utilizados três diferentes modelos de avaliação: linear com a utilização da transformação logarítmica das observações (MLOG); linear sem a transformação das observações (MLIN) e o linear generalizado Poisson com adição de um termo residual (MPOI). Foi utilizada validação cruzada para comparar a habilidade preditiva dos modelos. Uma discreta superioridade quanto à qualidade de ajuste... / Aiming to investigate the genetic variation of tick resistance and to find the Best fitting model for this trait, data of tick counting (TC) by natural infestation in Hereford Nellore cattle were used. Firstly, the data of TC obtained from herds located in the states of Rio Grande do Sul (RS), Parana (PR), Mato Grosso do Sul (MS) e São Paulo (SP) were transformed into log10(CC+1) and grouped into two regions, defined by cluster analysis. Each group was considered as a different trait, and by using a two-trait model, the covariance components were estimated, and also, the occurrence of genotype x environment interaction was evaluated for the trait. Estimates of heritability observed for TC were low, suggesting that there is a possibility of selecting animal that are resistant to tick infestation, however, with a low genetic progress. High genetic correlation for TC between both groups was estimated, and no genotype x environment interaction was observed for this trait in this population. After, a comparative study was performed regarding the predictive ability and the fitting of different models for the evaluation of TC. For that, three different evaluation models were used: linear with the use of logarithmic transformation of the data (MLOG); linear without the use of logarithmic transformation of the data (MLIN), and linear generalized Poisson with the addition of a residual term (MPOI). Cross validation was performed to compare the predictive ability of the models. A discreet superiority regarding the adjustment quality and the predictive ability were showed by the model MPOI. Correlations between observed and predicted TC were almost equal in all models and the highest rank correlation between EBVs was observed between... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-14Bitstream added on 2015-03-03T12:06:49Z : No. of bitstreams: 1 000810899.pdf: 268181 bytes, checksum: 6ad3d008125d4cbb91861fe84019a265 (MD5) / É de extrema importância saber a natureza das variâncias e como essas afetam as característias produtivas e estimativas. Foram utilizadas aproximadamente 3500 bufálas em lactação, predominantemente da raça Murrah, genotipadas através do chip “Illumina Infinium bovine HD bead Chip” , obtidos do banco de dados do campus de Jaboticabal da UNESP, para se avaliar a produção de leite acumulada aos 305 dias(PL), produção de proteína(PPRO) e produção de gordura(PGOR) neste animais, estimando-se parâmetros de herdabilidade e variâncias Foi utilizado um modelo misto com duas propostas distintas, uma tradicional e outra onde é considerada a heterogeneidade das variâncias, tanto aditiva quanto residual, dividindo os animais em dois grupos de acordo com o nível de produção. Dentro de ambos os modelos, foram utilizadas informações de genotipagem. As estimativas de herdabilidade foram moderadas e dentro do que se encontra na literatura para todos os modelos, entretanto nos modelos onde se considera a heterogeneidade das variâncias foram encontradas diferentes estimativas. As herdabilidades encontradas para os modelos tradicionais foram de 0,22(sem genômica) e 0,23(com genômica) para PL, 0,32(sem genômica) e 0,30(com genômica) para PGOR e 0,27(sem genômica) e 0,34(com genômica) para PPRO. Ao se considerar heterogeneidade residual, as herdabilidades para os níveis alto e baixo de produção foram, respectivamente: 0,28 e 0,17 para PL, 0,28 e 0,35 para PGOR e 0,30 e 0,42 para PPRO. Quando também se considerou a heterogeneidade aditiva, as herdabilidades para os níveis alto e baixo de produção, respectivamente, foram de: 0,38 e 0,25 para PL, 0,29 e 0,31 para PGORD e 0,33 e ... / Is extreme important knowing the variability natures and how those affect production characteristics and population estimations like heritability and correlations. It was used in this research proximally 3500 buffaloes in lactation, most being murrah, genotyped with IlluminaInfiniumbovineHDbeadChip, taken from the database of Jaboticabal Campus, UNESP for the evaluation of milk yield at 305 days(MY), protein yield(PY) and fat yield(F), estimating heritability and variances effects on it. It was used a mixed model with two different approaches, one where doesn’t account the heterogeneity of variances, and another where is accounted these variances, both residual and additive, splitting the animals in two groups for production levels. In both models were included genomic informations. And by replacing the relationship matrix with matrix H, including genomic informations, the same results were studied but in models accounting genomic information. The heritability found, all of them, were moderate and between the intervals estimated in other studies. However in the models where different variances are in consideration, were found different heritabilitys for all characteristics. For the tradicional models the heritabilities found, without and with genomic information, were: 0.22 and 0.23 for MY, 0.32 and 0.30 for FY and 0.27 and 0.34 for PY. When take in account only the residual heterogeneity, the heritability for high and low level of production, were: 0.28 and 0.17 for MY, 0.28 and 0.35 for FY and 0.30 and 0.42 for PY. When the additive heterogeneity was also taken in account, the heritabilitys for high and low level of production were: 0.28 and 0.17 for MY, 0.29 and 0.31 for FY and 0.33 and 0.37 for PY. By the results of this studies is possible to concluded that taking in account ...

O uso da tecnologia de DNA recombinante abre portas para um estudo detalhado da estrutura e função de proteínas, e a produção de proteínas recombinantes em sistema procarioto apresenta várias vantagens. A presente tese propõe a expressão heteróloga das proteínas aSFP, proteína ácida do fluido seminal bovino de 14 kDa, e osteopontina (OPN) de 55 kDa, relacionadas à congelabilidade do sêmen. Foram construídas bibliotecas de cDNA de vesícula seminal, próstata e glândula bulbouretral. Oligonucleotideos iniciadores foram sintetizados baseados nas seqüências disponíveis no GenBank (aSFP: número de acesso NM_174616, OPN: número de acesso M66236). Os amplicons resultantes das reações de PCR foram clonados em pET23a(+). Os plasmidios pET-aSFP e pET-OPN foram transformados em linhagens eletrocompetentes de E. coli BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. Para expressão das proteínas recombinantes foram testadas diferentes concentrações de indutor de expressão IPTG, e diferentes tempos e temperaturas de indução. A expressão recombinante foi avaliada por SDS-PAGE, usando como controle cultivo não induzido. Das cinco linhagens transformadas com pET-aSFP, somente E. coli BL21 pLysS induzida com 0,5 mM de IPTG por 3 horas a 37°C apresentou uma banda de aproximadamente 15 kDa, compatível com o tamanho esperado de aSFPr-6xHis. Por cromatografia de afinidade com metal imobilizado em condições desnaturantes foi possível um rendimento de purificação de 2,5mg/mL de aSFPr-6xHis por 10 mL de cultura bacteriana. Contudo, a expressão de OPNr-6xHis, também obtida com a linhagem de E. coli BL21 pLysS, foi de baixa eficiência, o que não permitiu sua purificação. A produção recombinante de proteínas do plasma seminal é uma das mais novas ferramentas para o estudo de suas funções. O aperfeiçoamento dos processos de expressão e purificação é fundamental no desenvolvimento desta biotecnologia, que possui grande potencial terapêutico e diagnóstico. / The use of recombinant DNA technology makes possible a deeper investigation on protein structure and function. Also the production of recombinant proteins has several advantages. The present thesis presents the recombinant expression of the 14 kDa acidic seminal fluid protein (aSFP) and osteopontin (55 kDa), both associated with bovine semen freezability. cDNA libraries from prostate, seminal vesicle and bulbouretral gland were constructed, and primers were designed based on data available on Genebank (aSFP: access number NM_174616; OPN: access number M66236). Amplicons of the target genes were cloned into pET23a(+), and the constructs pET-aSFP and pET-OPN were transformed into electrocompetent E. coli strains: BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. For the expression trials, different concentrations of IPTG were tested, as well several different expression induction conditions. The recombinant expression was analyzed by SDS-PAGE and western blotting. The best expression for aSFPr-6xHis (15 kDa) was obtained with the strain BL21 pLysS, induced with 0.5 mM IPTG in 3 hours at 37°C. The target protein was purified by immobilized metal ion chromatography in denaturing conditions with a yield of 2.5 mg/mL per 10 mL of bacterial culture. The recombinant expression of OPNr-6xHis was also possible with the pLysS strain, however in a lower efficiency. The low amount of recombinant OPN did not allow its purification. The production of seminal plasma recombinant proteins is a new tool for the study of its functions. The improvement of expression and purification processes is important for this biotechnology which has a great potential for therapeutic and diagnose applications.

Objetivou-se no presente trabalho obter índices de diversidade genética para o SNP (single nucleotide polymorphism) 8514 do íntron quatro do gene OPN e analisar a associação entre esse polimorfismo e a produção de leite em animais participantes do Teste de Progênie da raça girolando, por meio da análise das variáveis de produção de leite em até 305 dias (P305) e capacidade prevista de transmissão (PTA) de leite. Para o estudo de diversidade genética, foram analisados 87 touros e 347 vacas (n = 434) e para a análise de associação foram avaliados 32 touros e 159 vacas (n = 204), os quais apresentavam dados fenotípicos disponíveis. Para amplificação dessa região gênica, foram utilizados os primers descritos para a raça holandesa e a diferenciação dos alelos C/T desse SNP foi obtida por meio da técnica de PCRRFLP. As frequências dos genótipos encontradas foram TT (52,53%), CT (38,71%) e CC (8,76%) e as frequências alélicas de T (71,9%) e C (28,1%) estando de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg (p > 0,05). Foi estimado um baixo nível de endogamia (Fis = 0,043), o que sugere que a população apresenta mais indivíduos homozigotos para o alelo T devido à provável herança deste alelo o da raça zebuína e não pela prática de endogamia realizada no rebanho. O estudo de associação entre o gene OPN e a produção de leite não detectou associação com as variáveis analisadas, P305 e PTA. Os resultados deste trabalho estão de acordo com os observados na raça holandesa, na qual não foi observado efeito aditivo dos alelos desse SNP com a produção de leite. Outros estudos devem ser conduzidos para se inferir com maior precisão a importância desse gene na produção de leite na raça girolando. / The objective of the present work to obtain indices of genetic diversity for the SNP (single nucleotide polymorphism) of the 8514 intron four of OPN gene and analyze the association between this polymorphism and milk production in animals participating in the Progeny Test Girolando through analysis of the yield of milk in 305 days (P305) and predicted transmitting ability (PTA) of milk. For the study of genetic diversity, we analyzed 87 bulls and 347 cows (n=434) and the association analysis were evaluated 32 bulls and 159 cows (n=204), which showed phenotypic data available. For amplification of this gene region, we used the primers described for the Holstein and differentiation of alleles C/T SNP that was obtained by PCR-RFLP. The frequencies of TT genotypes were found (52.53%), CT (38.71%) and CC (8.76%) and allele frequencies of T (71.9%) and C (28.1%) being according to the Hardy-Weinberg equilibrium (p>0.05). We estimated a low level of inbreeding (Fis=0.043), suggesting that the population has more individuals homozygous for the T allele likely due to the inheritance of this allele of the zebu breed and not held by the practice of inbreeding in the herd. The study of association between the OPN gene and milk production did not detect association with variables, P305 and PTA. These results are consistent with those observed in Holstein, which was not observed additive effect of alleles of this SNP with milk production. Other studies should be conducted to infer more precisely the importance of this gene in milk production in girolando breed.

Com o objetivo de estimar parâmetros genéticos para as produções no dia do controle e para seis medidas para a persistência nas produções de leite, de gordura e de proteína, de vacas da raça Holandesa, do Estado de Minas Gerais, foram usados 56.508, 35.091 e 8.326 registros, de 7.015, 4.476 e 1.114 vacas, filhas de 6.089, 3.875 e 984 mães e 359, 246 e 90 touros, respectivamente para as produções no dia do controle, de leite, de gordura e de proteína. Foram ajustados modelos de regressão aleatória usando-se polinômios de Legendre com a ordem de 3 a 6. As herdabilidades variaram de 0,14 a 0,31, 0,03 a 0,21 e 0,09 a 0,33 para as produções de leite, de gordura e de proteína, respectivamente. As correlações genéticas variaram de 0,02 a 1,00, 0,34 a 1,00 e 0,42 a 1,00 e as correlações de ambiente permanente variaram de 0,02 a 0,99, -0,34 a 0,99 e -0,10 a 0,99, respectivamente para as produções de leite, de gordura e de proteína. As estimativas de herdabilidade para as persistências nas produções de leite, de gordura e de proteína variaram, respectivamente, de 0,04 a 0,32, 0,00 a 0,23 e 0,00 a 0,27. Os valores de correlações genéticas entre as medidas de persistência e as produções totais de leite, de gordura e de proteína variaram de -0,38 a 0,54, -0,39 a 0,97 e -0,78 a 0,67, respectivamente. Os modelos ajustados por polinômios de Legendre de maior ordem foram os mais adequados para as três características produtivas e a medida PS2 foi a mais apropriada para avaliação para a persistência das produções de leite, de gordura e de proteína, para animais da raça Holandesa em Minas Gerais. / With the objective to estimate genetic parameters for the test-day yields and for six measures for the persistencies for milk, fat and protein yields from the cows of the Holstein breeds, in the State of Minas Gerais, were used 56,508, 35,091 and 8,326 records, from 7,015, 4,476 and 1,114 cows, sired by 6,089, 3,875 and 984 dams and 359, 246 and 90 bulls, respectively for milk, fat and protein test-day yields. Random regression models were adjusted by using Legendre polynomial with order from 3 to 6. The heritabilities ranged from 0.14 to 0.31, 0.03 to 0.21 and 0.09 to 0.33 for the milk, fat and protein yields, respectively. The genetic correlations ranged from 0.02 to 1.00, 0.34 to 1.00 and 0.42 to 1.00 and the permanent environmental correlations ranged from 0.02 to 0.99, -0.34 to 0.99 and -0.10 to 0.99, respectively for milk, fat and protein yields. The heritability estimates for the persistencies in the milk, fat and protein yields ranged, respectively, from 0.04 to 0.32, 0.00 to 0.23 and 0.00 to 0.27. The values of the genetic correlations among persistency measures and total milk, fat and protein yields ranged from -0.38 to 0.54, -0.39 to 0.97 and -0.78 to 0.67, respectively. The models adjusted for Legendre polynomials of higher order were the most adequated for the three productive traits and the PS2 measure was the most appropriated for evaluation for the persistencies for milk, fat and protein yields, for the animals of Holstein breed in the State of Minas Gerais.

O uso da tecnologia de DNA recombinante abre portas para um estudo detalhado da estrutura e função de proteínas, e a produção de proteínas recombinantes em sistema procarioto apresenta várias vantagens. A presente tese propõe a expressão heteróloga das proteínas aSFP, proteína ácida do fluido seminal bovino de 14 kDa, e osteopontina (OPN) de 55 kDa, relacionadas à congelabilidade do sêmen. Foram construídas bibliotecas de cDNA de vesícula seminal, próstata e glândula bulbouretral. Oligonucleotideos iniciadores foram sintetizados baseados nas seqüências disponíveis no GenBank (aSFP: número de acesso NM_174616, OPN: número de acesso M66236). Os amplicons resultantes das reações de PCR foram clonados em pET23a(+). Os plasmidios pET-aSFP e pET-OPN foram transformados em linhagens eletrocompetentes de E. coli BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. Para expressão das proteínas recombinantes foram testadas diferentes concentrações de indutor de expressão IPTG, e diferentes tempos e temperaturas de indução. A expressão recombinante foi avaliada por SDS-PAGE, usando como controle cultivo não induzido. Das cinco linhagens transformadas com pET-aSFP, somente E. coli BL21 pLysS induzida com 0,5 mM de IPTG por 3 horas a 37°C apresentou uma banda de aproximadamente 15 kDa, compatível com o tamanho esperado de aSFPr-6xHis. Por cromatografia de afinidade com metal imobilizado em condições desnaturantes foi possível um rendimento de purificação de 2,5mg/mL de aSFPr-6xHis por 10 mL de cultura bacteriana. Contudo, a expressão de OPNr-6xHis, também obtida com a linhagem de E. coli BL21 pLysS, foi de baixa eficiência, o que não permitiu sua purificação. A produção recombinante de proteínas do plasma seminal é uma das mais novas ferramentas para o estudo de suas funções. O aperfeiçoamento dos processos de expressão e purificação é fundamental no desenvolvimento desta biotecnologia, que possui grande potencial terapêutico e diagnóstico. / The use of recombinant DNA technology makes possible a deeper investigation on protein structure and function. Also the production of recombinant proteins has several advantages. The present thesis presents the recombinant expression of the 14 kDa acidic seminal fluid protein (aSFP) and osteopontin (55 kDa), both associated with bovine semen freezability. cDNA libraries from prostate, seminal vesicle and bulbouretral gland were constructed, and primers were designed based on data available on Genebank (aSFP: access number NM_174616; OPN: access number M66236). Amplicons of the target genes were cloned into pET23a(+), and the constructs pET-aSFP and pET-OPN were transformed into electrocompetent E. coli strains: BL21, BL21 (DE3), BL21 Star, BL21 Codon Plus e BL21 pLysS. For the expression trials, different concentrations of IPTG were tested, as well several different expression induction conditions. The recombinant expression was analyzed by SDS-PAGE and western blotting. The best expression for aSFPr-6xHis (15 kDa) was obtained with the strain BL21 pLysS, induced with 0.5 mM IPTG in 3 hours at 37°C. The target protein was purified by immobilized metal ion chromatography in denaturing conditions with a yield of 2.5 mg/mL per 10 mL of bacterial culture. The recombinant expression of OPNr-6xHis was also possible with the pLysS strain, however in a lower efficiency. The low amount of recombinant OPN did not allow its purification. The production of seminal plasma recombinant proteins is a new tool for the study of its functions. The improvement of expression and purification processes is important for this biotechnology which has a great potential for therapeutic and diagnose applications.

Objetivou-se com este estudo estimar parâmetros genéticos e fenotípicos para medidas de longevidade relacionadas à vida produtiva ou vida no rebanho, sobrevivência no rebanho até determinado tempo, e para características lineares de tipo, além de avaliar a possibilidade de reduzir a dimensionalidade, por meio da análise de fatores, do conjunto original de características lineares de tipo, a fim de indicar quais são as mais importantes para a seleção da longevidade e produção de leite até 305 dias na primeira lactação, em vacas da raça holandesa. Os componentes de (co)variância para as características lineares de tipo e para as medidas de longevidade relacionadas a vida produtiva e ou vida no rebanho foram obtidos pelo método da máxima verossimilhança restrita, sob modelo animal linear, e para a sobrevivência no rebanho pela abordagem bayesiana, considerando-se um modelo animal não-linear (limiar). A associação dos fatores extraídos sobre as medidas de longevidade e a produção de leite em até 305 dias na primeira lactação foi realizada com o procedimento GLM do SAS. As herdabilidades para as medidas de longevidade relacionadas a vida produtiva e ou vida no rebanho e sobrevivência no rebanho variaram de 0,05 a 0,09, e 0,05 a 0,18, respectivamente. Para as características lineares de tipo, as herdabilidades foram maiores, variando de 0,08 a 0,39. As correlações genéticas entre as medidas de longevidade relacionadas à vida produtiva ou a vida no rebanho e as medidas de sobrevivência com as características lineares de tipo, variaram de -0,39 a 0,31, e -0,36 a 0,41, respectivamente. A seleção direta para a longevidade pode conduzir a pequenas respostas a seleção. As características profundidade do úbere, colocação das tetas posteriores, textura do úbere, altura do úbere, qualidade óssea, largura torácica e profundidade corporal, apresentaram as correlações genéticas mais elevadas com as medidas de longevidade, podendo ser utilizadas como características auxiliares para a seleção da longevidade. A análise de fatores extraiu dois fatores com autovalores maiores que um, o primeiro englobou basicamente as características relacionadas ao úbere, teta e qualidade óssea, e o segundo a estrutura da vaca. Uma futura seleção com base nas características do fator 1 pode condicionar em maior permanecia das vacas no rebanho e maior produção de leite na primeira lactação. / The objective of this study was to estimate genetic and phenotypic parameters for measures of longevity related to productive life and or herd life, survival in the herd until certain time, and to linear type traits, and reduce the dimensionality by means of factor analysis, of the original set of linear type traits in order to indicate which are the most important for the selection of longevity and milk production until 305 days in first lactation in Holstein cows. The components of (co) variance for linear type traits and to measures of longevity related to productive life or herd life were obtained by restricted likelihood maximum method, with a linear animal model, and survival in the herd with Bayesian methodology considering an animal model non-linear (threshold). The relationship of the factors about measures of longevity and milk production until 305 days in first lactation was performed with the GLM procedure of SAS. The heritability for measures of longevity related to productive life or herd life, and survival in the herd ranged from 0.05 to 0.09, and 0.05 to 0.18, respectively. For linear type traits, heritability was higher, ranging from 0.08 to 0.39. Genetic correlations between linear type traits with measures of longevity related to productive life and survival measures ranged from -0.39 to 0.31, and -0.36 to 0 41, respectively. The traits of the udder depth, fore teat placement, udder texture, rear udder height, bone quality, chest width and body depth showed highest genetic correlations with measures of longevity can be used as auxiliary traits for the selection of longevity. Factor analysis extracted two factors with eigenvalues greater than one, the first, basically encompassed the traits related to the udder, teats and bone quality, and the second factor, cow structure. Indirect selection based on the traits of the 1 factor can contribute to higher permanence of the cows in the herd and toward milk production increase in first lactation.