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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23374号 / 医博第4743号 / 新制||医||1051(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 藤田 恭之, 教授 椛島 健治, 教授 斎藤 通紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

GATA4 est un facteur de transcription essentiel pour le développement et la fonction de plusieurs tissus, incluant les gonades. GATA4 est exprimé sous forme de deux transcrits majeurs présentant des premiers exons distincts non codants, soient l’exon 1a et l’exon 1b. J’ai proposé que l’utilisation de différents promoteurs soit un mécanisme important dans la régulation spatiotemporelle de l’expression de GATA4. Des expériences d’hybridation in situ ont révélé que les transcrits Gata4 1a et 1b sont bien présents au niveau des cellules somatiques du testicule et de l’ovaire au cours du développement. Les résultats in vitro nous ont suggéré que le promoteur 1b est régulé positivement par GATA4. Toutefois, les résultats in vivo ont révélé que le promoteur Gata4 1b est assujetti à une autorégulation négative. Les expériences de co-transfection ont démontré que GATA4 régule sa propre expression en réprimant l’activité transcriptionnelle du promoteur Gata4 1b en interagissant avec FOG2.

Les facteurs de transcription GATA tirent leur nom de leur capacité à se lier à la séquence consensus WGATAR sur les promoteurs de leur gènes cibles. Le facteur GATA4, joue un rôle décisif dans le développement de multiples organes comme le cœur, le tractus digestif, et les gonades. Malgré son rôle central au cours du développement, le mécanisme d'action de GATA4 et son mode de régulation dans différents tissus, et plus particulièrement les gonades, reste mal compris. Le principal objectif du travail rapporté dans cette thèse a été de mieux caractériser comment GATA4 acquiert sa spécificité d'action pour réguler ses gènes cibles gonadiques. Un de ces mécanismes est la coopération avec différents partenaires transcriptionnels. Le facteur WT1 a été identifié comme un nouveau partenaire pour GATA4 dans la régulation de l'expression de SRY et de MIS/AMH, deux gènes fondamentaux de la détermination et la différenciation du sexe. Le récepteur nucléaire LRH-1/NR5A2 a lui aussi été identifié comme partenaire de GATA4 dans la régulation du gène HSD3B2 humain codant pour une enzyme cruciale de la stéroïdogenèse. Un mode de régulation alternatif est la modification post-traductionelle du facteur GATA4 lui-même, le processus le plus étudié étant la phosphorylation. Dans les cellules gonadiques, GATA4 est sujet à la phosphorylation par la protéine kinase A. Toutefois, GATA4 est aussi une cible pour la MAP kinase sur une série distincte de résidus serine. Ainsi, la phosphorylation sélective de GATA4 en réponse à différents stimuli et impliquant différentes voies de signalisation apparaît comme un mécanisme clé de la régulation de l'activité de GATA4 dans les cellules gonadiques. Enfin, l'interruption des interactions entre GATA4 et ses partenaires transcriptionnels est liée à des maladies chez l'homme. En effet, une mutation du gène GATA4 humain (hG296S) empêche son interaction avec TBX5, ce qui est à l'origine de défauts cardiaques congénitaux. Contrairement au cœur, la mutation ne semble pas avoir d'effet sur la capacité de GATA4 à coopérer avec ses partenaires transcriptionels gonadiques. Ainsi, bien que préjudiciable à la fonction cardiaque, cette mutation n'est pas supposée à provoquer des effets sur la reproduction chez l'homme. / The GATA family of transcription factors is named for the consensus nucleotide sequence (WGATAR) that they bind in the promoter region of target genes. One member of this family, GATA4, plays a prominent role in the development of multiple ventrally-located organs such as the heart, digestive tract, and gonads. Despite this pivotal developmental role, the mechanism of action of GATA4 and its regulation in different tissues, especially the gonads, remains poorly understood. The main objective of the work presented in this thesis was to better understand how GATA4 acquires its specificity of action to regulate gonadal target genes. One mechanism is through cooperative interactions with different transcriptional partners. WT1 was identified as a novel partner for GATA4 in the regulation of sex-determining region Y (SRY) and Mullerian inhibiting substance (MIS/AMH), two critical genes involved in the mammalian sex determination and differentiation pathway. The nuclear receptor LRH-1/NR5A2 was also identified as a new transcriptional partner for GATA4 in the regulation of the human 3(3- hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene (HSD3B2) involved in steroidogenesis. An alternate mechanism for regulating GATA4 activity is via post-translational modifications of the factor itself. The most studied has been the role of phosphorylation. In gonadal cells, GATA4 is a target for phosphorylation by protein kinase A (PKA). GATA4, however, was also found to be a target for MAP kinasemediated phosphorylation on a distinct set of serine residues. Thus, selective phosphorylation of GATA4 in response to different stimuli and involving different signaling pathways appears to be a key mechanism for regulating GATA4 activity within gonadal cells. Finally, disruption of cooperative interactions between GATA4 and its transcriptional partners has also been linked to human disease. Indeed, a human GATA4 mutation (hG296S) has been reported to abrogate its interaction with TBX5, resulting in congenital heart defects. Unlike the heart, the mutation was found to have no effect on the ability of GATA4 to cooperate with its major gonadal transcriptional partners. Thus, although detrimental to heart function, the hG296S mutation would not be expected to cause human reproductive defects.

Le facteur de transcription GATA4 est un puissant régulateur du développement cardiaque, gonadique et digestif. Bien qu'un grand nombre de ses gènes cibles soient connus, les mécanismes contrôlant son expression et son activité demeurent incertains. GATA4 est phosphorylé par la PKA en réponse à l'AMPc en serine 261 et des MAPK en serine 105. L'objectif de mon projet de maîtrise est donc de définir l'importance de ces sites de phosphorylations et plus particulièrement par les MAPK sur l'activité transcriptionnelle de GATA4 sur certains promoteurs cibles. Les résultats de transfection transitoire au phosphate de calcium montrent que la stimulation par les MAPK potentialise l'activité transcriptionnelle de GATA4 sur les promoteurs Star, Inha et Cypl9. Cette stimulation potentialise également la coopération de GATA4 avec ses partenaires transcriptionnels comme LRH1 et SF1 sur le promoteur Inha. Ceci a permits de mettre en évidence l'importance des MAPK dans la régulation de l'activité transcriptionnelle de GATA4 sur certains promoteurs cibles.

Die Rolle von GATA4 für die Entwicklung einer Hypertrophie und seine Regulation in Abhängigkeit von der Last sind im menschlichen Herzen im Gegensatz zu den zahlreichen tierexperimentellen Ansätzen bislang nicht gezielt untersucht worden. Die vorliegende Arbeit sollte zeigen, wie biomechanische Last im menschlichen Herzen die Expression von GATA4 und seine Phosphorylierung an einer aktivierenden Phosphorylierungsstelle (Serin-105) reguliert. Hierfür wurde der Einfluss eines chronischen Lastzustandes, hervorgerufen durch eine Aortenstenose, ebenso wie der eines akuten Lastzustandes durch Steigerung der Vor- und Nachlast von Muskelstreifen im Organbad auf die Expression von GATA4 untersucht. Die Muskelstreifen stammten dabei sowohl aus gesundem Myokard (Vorhofmyokard bei normaler Pumpfunktion) als auch aus vorgeschädigtem Myokard (insuffizientes Ventrikelmyokard). Im ersten Teil wurde dargestellt, dass eine chronische Nachlasterhöhung zu einer signifikanten Zunahme der mRNA- und Proteinexpression sowie der Phosphorylierung von GATA4 führte. Während die mRNA- und Proteinexpression in vivo lastabhängig reguliert zu sein scheinen, zeigte die GATA4-Phosphorylierung eine signifikante Korrelation mit der kardialen Pumpfunktion. Die messbare Aktivitätssteigerung durch Phosphorylierung unterstützt dabei die Idee von GATA4 als Mediator ventrikulärer Hypertrophie zum Erhalt der kardialen Pumpfunktion. Unter der Auswirkung akuter Last stellte sich hingegen ein heterogenes Bild dar. Eine Steigerung der Gesamtexpression war nicht nachzuweisen, aber ein signifikanter Dehnungseffekt im suffizienten atrialen Myokard, welcher offensichtlich durch eine Abschwächung einer zeitabhängigen Proteindegradation zu Stande kommt. Die Abnahme der GATA4-Expression über die Zeit war unter Einwirkung akuter Last deutlich vermindert aber noch vorhanden. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist daran eindeutig beteiligt, da durch den Ubiquitin-Isopeptidase-Inhibitor Δ12-PGJ2 der Abbau von GATA4 vermindert werden konnte.

Les surrénales sont des glandes endocrines permettant la réponse au stress de l’organisme. Alors que la medulla produit des catécholamines, la corticosurrénale sécrète des minéralocorticoïdes au niveau de la zone glomérulée, et des glucocorticoïdes grâce aux cellules de la zone fasciculée. Ces hormones sont notamment impliquées dans l’homéostasie hydrominérale, la réponse immunitaire et la maturation pulmonaire au cours de la vie fœtale. Les insuffisances surrénaliennes peuvent donc être très délétère en absence de traitement. Pour maintenir l’intégrité tissulaire au cours de la vie et pour mieux répondre aux variations des besoins de l’organisme, le cortex surrénalien est en renouvellement cellulaire constant. Des expériences de lignage ont mis en évidence que ce renouvellement repose sur le recrutement de cellules progénitrices capsulaires et situées dans la partie externe du cortex. Lorsqu’ils sont mobilisés, ces progéniteurs se différencient en cellules de la zone glomérulée, qui vont alors migrer de façon centripète le long du cortex et se différencier en cellules de la zone fasciculée après une conversion de lignage, au cours de leur migration. Cette conversion de lignage est orchestrée via un équilibre entre l’activation des voies Wnt/β-caténine, imposant une identité glomérulée, et PKA, permettant une différenciation fasciculée. Les facteurs épigénétiques jouent de nombreux rôles essentiels, du développement embryonnaire jusqu’à la tumorigenèse, en passant par l’homéostasie des tissus. Nous avons montré que la méthyltransférase EZH2 était le facteur épigénétique le plus surexprimé dans les carcinomes corticosurrénaliens et que cette surexpression était associée à l’agressivité de ces cancers. EZH2 est la sous-unité catalytique du complexe multi-protéique PRC2 qui permet, entre autres, la répression de la transcription de ses gènes cibles en posant la marque H3K27me3. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les potentiels rôles physiologiques de EZH2 dans la surrénale, qui n’avaient jusque là, jamais été recherchés.En développant un modèle murin d’invalidation génétique de Ezh2 dans le cortex surrénalien, dès l’émergence de l’ébauche surrénalienne au cours du développement embryonnaire, nous avons pu mettre en évidence une hypoplasie corticosurrénalienne, résultant d’une forte atrophie de la zone fasciculée, et associé à une insuffisance primaire en glucocorticoïdes. Nos analyses nous ont permis de démontrer le rôle original et inattendu de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA, en réprimant l’expression d’inhibiteurs de cette voie comme les phosphodiestérases (PDE) et la sous-unité régulatrice Prkar1b. EZH2 régule ainsi la zonation fonctionnelle du cortex surrénalien via son activité histone méthyltransférase. A l’inverse, on n’observe pas d’altération marquée de la voie Wnt/β-caténine, suggérant que Ezh2 n’est pas essentiel au contrôle de cette voie dans la surrénale. Nous avons également pu mettre en évidence une dédifférenciation de cellules corticales qui retrouvent, suite à la perte de Ezh2, une identité progénitrice en exprimant des marqueurs adréno-gonadique tels que Gata4 et Wt1. Cette dédifférenciation est un phénomène naturel que l’on retrouve avec le vieillissement et qui pourrait être associée avec la diminution progressive de l’expression de Ezh2 dans les cellules stéroïdogènes. L’ensemble de ces résultats, met en évidence une nouvelle fonction de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA et de l’homéostasie de la glande surrénale. / Adrenals are endocrine glands allowing the stress response of the organism. While the medulla produces catecholamines, the adrenal cortex secretes mineralocorticoids in the glomerular zone, and glucocorticoids through cells in the fasciculated zone. These hormones are notably involved in hydromineral homeostasis, the immune response and pulmonary maturation during fetal life. Adrenal insufficiency can therefore be very deleterious in the absence of treatment. To maintain tissue integrity over the course of life and to better respond to the changing needs of the body, the adrenal cortex is in constant cell renewal. Lineage experiments have shown that this renewal is based on the recruitment of capsular progenitor cells and progenitors located in the outer part of the cortex. When mobilized, these progenitors differentiate into cells of the glomerular zone, which then migrate centripetally along the cortex and differentiate into cells of the fasciculated zone after lineage conversion, during their migration. This lineage conversion is orchestrated via a balance between the activation of the Wnt/β-catenin pathway, imposing a glomerular identity, and PKA pathway, allowing fasciculated differentiation. Epigenetic factors play many important roles, from embryonic development to tumorigenesis, passing by tissue homeostasis. We have shown that methyltransferase EZH2 is the most overexpressed epigenetic factor in adrenocortical carcinomas and this overexpression is associated with cancer agressivity. EZH2 is the catalytic subunit of the multiprotein complex PRC2 that allow, among others things, the repression of the transcription of its target genes by posing the mark H3K27me3. The aim of my thesis was to indentify the putative physiological roles of EZH2 in the adrenal, never investigated yet.By developing a murine model of genetic invalidation of Ezh2 in the adrenal cortex, from the emergence of the adrenal anlagen during embryonic development, we have been able to demonstrate adrenocortical hypoplasia, resulting from a strong atrophy of the zona fasciculata, and associated with primary glucocorticoid insufficiency. Our analyses allowed us to demonstate the original and unexpected role of EZH2 in the controle of the PKA pathway, by repressing expression of this pathway inhibitors such as phosphodiesterases (PDE) and regulatory subunit Prkar1b. EZH2 thus regulate functionel zonation of adrenal cortex via its histone methyltransferase activity. On the contrary, we don’t observe marked alteration of the Wnt/β-catenin pathway, suggesting EZH2 is not essential for the control of this pathway in the adrenal. We could also show a dedifferenciation of cortical cells which, after the loss of Ezh2, exhibit progenitors identity by expressing adreno-gonadal marks as Gata4 and Wt1. This dedifferenciation is a natural phenomenon that appear with ageing and could be associated with processive decrease of Ezh2 expression in steroidogenic cells. All of these results, highlights a new function of Ezh2 in the control of the PKA signaling pathway and in the homeostasis of the adrenal gland.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in humans throughout the world and “congenital heart defects” (CHDs) are the major cause of infant mortality and morbidity. GATA4 is one of the most critical and intensely studied cardiac transcription factor. It is important for proliferation of cardiomyocytes as well as their survival and adaptive response. The focus of the following thesis was to identify GATA4 mediators and cofactors in cardiac growth. The first part focused on cyclin D2 (CycD2), a growth inducible cell cycle protein. We identified Ccnd2 (gene encoding CycD2) as a direct transcriptional target of GATA4 in postnatal cardiomyocytes and Ccnd2 cardiomyocyte specific overexpression in Gata4 heterozygote mice was able to rescue their heart size and function. We further uncovered a novel regulatory loop between GATA4 and CycD2. CycD2 enhanced GATA4 activation of its target promoters. GATA4 was able to physically interact with CycD2 and its cyclin dependent kinase CDK4 suggesting that GATA4 recruits CycD2/CDK4 to its target promoters. Together, our data uncover a role of CycD2 in the developing and postnatal heart and provide novel insight for the potential of targeting the cell cycle in cardiac therapy. The second part of the project focused on KLF13, a cell specific cofactor of GATA4. KLF13 is a member of the Krϋppel-like transcription factors that are important regulators of cell proliferation and differentiation. Klf13 is highly enriched in the developing heart where it is found in both myocardial and endocardial cells. To determine its role in the mammalian heart, we deleted the Klf13 gene in transgenic mice. Klf13-/- mice were born at 50% reduced frequency and presented with variable cardiac phenotypes. Epithelial-mesenchymal transformation (EMT) was affected in these mice and reduced cell proliferation was evident in the AV cushion. These data uncover a role for a new class of transcription factors in heart formation and point to KLF13 as a regulator of endocardial cell proliferation and a potential CHD causing gene. Future discovery of more cardiac regulators and understanding the molecular basis of CHDs is essential for preventions of these defects and possible development of therapeutic approaches for myocardial repair.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in humans throughout the world and “congenital heart defects” (CHDs) are the major cause of infant mortality and morbidity. GATA4 is one of the most critical and intensely studied cardiac transcription factor. It is important for proliferation of cardiomyocytes as well as their survival and adaptive response. The focus of the following thesis was to identify GATA4 mediators and cofactors in cardiac growth. The first part focused on cyclin D2 (CycD2), a growth inducible cell cycle protein. We identified Ccnd2 (gene encoding CycD2) as a direct transcriptional target of GATA4 in postnatal cardiomyocytes and Ccnd2 cardiomyocyte specific overexpression in Gata4 heterozygote mice was able to rescue their heart size and function. We further uncovered a novel regulatory loop between GATA4 and CycD2. CycD2 enhanced GATA4 activation of its target promoters. GATA4 was able to physically interact with CycD2 and its cyclin dependent kinase CDK4 suggesting that GATA4 recruits CycD2/CDK4 to its target promoters. Together, our data uncover a role of CycD2 in the developing and postnatal heart and provide novel insight for the potential of targeting the cell cycle in cardiac therapy. The second part of the project focused on KLF13, a cell specific cofactor of GATA4. KLF13 is a member of the Krϋppel-like transcription factors that are important regulators of cell proliferation and differentiation. Klf13 is highly enriched in the developing heart where it is found in both myocardial and endocardial cells. To determine its role in the mammalian heart, we deleted the Klf13 gene in transgenic mice. Klf13-/- mice were born at 50% reduced frequency and presented with variable cardiac phenotypes. Epithelial-mesenchymal transformation (EMT) was affected in these mice and reduced cell proliferation was evident in the AV cushion. These data uncover a role for a new class of transcription factors in heart formation and point to KLF13 as a regulator of endocardial cell proliferation and a potential CHD causing gene. Future discovery of more cardiac regulators and understanding the molecular basis of CHDs is essential for preventions of these defects and possible development of therapeutic approaches for myocardial repair.

Thesis (Ph.D. in Molecular Biology) -- University of Colorado Denver, 2007. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 160-175). Free to UCD affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;