Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo. Mención: Tecnología de los Alimentos

Orientador: Marcos Akira d'Ávila / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica / Made available in DSpace on 2018-08-22T03:44:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salles_TaisHelenaCosta_M.pdf: 2536678 bytes, checksum: 358cfaf694adc91a715f58aabead529d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A eletrofiação é reconhecida como uma técnica eficiente para a fabricação de microfibras e nanofibras de polímero, devido à sua versatilidade e potencial para aplicações em diversos campos. As aplicações notáveis incluem engenharia tecidual, biossensores, filtração, curativos, liberação controlada de fármacos e imobilização de enzimas. As nanofibras são geradas através da aplicação de um campo elétrico em uma solução polimérica. As fibras fiadas por este processo oferecem várias vantagens, como elevada área de superfície em relação ao volume, alta porosidade e a capacidade de manipular a composição de nanofibras, a fim de obter as propriedades e funções desejadas. Neste trabalho, a eletrofiação de blendas de gelatina com polivinilpirrolidona (PVP) para a fabricação de nanofibras foi investigada. Os polímeros foram fiados a partir de soluções contendo diversas concentrações de água e ácido acético. As soluções foram fiadas a uma tensão positiva de 29,0-29,2 kV, uma distância da ponta da agulha ao coletor de 10 cm, e uma vazão de 1 mL / h. Todas as soluções foram avaliadas quanto ao pH, condutividade elétrica, tensão superficial e viscosidade. Foram investigados os efeitos da concentração de ácido acético nas propriedades das soluções que por sua vez, influenciaram no processo de obtenção de fibras por eletrofiação. Foi observado que há uma correlação entre a concentração de ácido acético e a formação de fibras desse sistema, assim como a influência no diâmetro final das fibras. No presente estudo, uma matriz de nanofibras uniformes com diâmetro aproximado de 519, 355 e 154 nm foram produzidas via eletrofiação. A morfologia das membranas foi avaliada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Foi realizada a análise térmica termogravimétrica (TGA) e avaliação de citotoxicidade, visando futuras aplicações em engenharia tecidual / Abstract: The electrospinning is recognized as an efficient technique for the fabrication of polymeric microfibers and nanofibers due to its versatility and potential for applications in many fields. Notable applications include tissue engineering, biosensors, filtration, wound dressings, controlled drug release and enzyme immobilization. The nanofibers are generated by applying an electric field in a polymer solution. The fibers spun by this process offers several advantages such as high surface area relative to volume, high porosity and the ability to manipulate the composition of nanofibers in order to obtain the desired properties and functions desired. In this work, the electrospinning blends of gelatin with polyvinylpyrrolidone (PVP) to fabrication nanofibers were investigated. The polymers were electrospun from solutions containing various concentrations of water and acetic acid. The solutions were electrospun at a positive voltage of 29.0 to 29.2 kV, a distance from the needle tip to the collector of 10 cm and a flow rate of 1 mL / h. All solutions were analyzed as your pH, electrical conductivity, surface tension and viscosity. We investigated the effects of acetic acid concentration on the properties of the solutions, on the other hand, influenced the process of obtaining fibers by electrospinning. It was observed that there was a correlation between the concentration of acetic acid and formation of fibers of that system, as well the influence on the final diameter of the fibers. In the present study, a matrix of nanofibers uniform with diameters of approximately 519, 355 and 154 nm had been produced by electrospinning. The morphology of the membranes was evaluated by Scanning Electron Microscopy (SEM). We made thermal analysis (TGA) and assessment of cytotoxicity, aiming future applications in tissue engineering / Mestrado / Materiais e Processos de Fabricação / Mestra em Engenharia Mecânica

A formação do biofilme nas áreas subgengivais pode levar a respostas vasculares e celulares, as quais podem resultar na doença periodontal, portanto, periodontite crônica são a inflamação crônica e progressiva, caracterizada clinicamente por inflamação gengival, sangramento à sondagem, diminuição da resistência dos tecidos periodontais à sondagem, perda de inserção gengival e osso alveolar. Em estudos de lesões que ocorrem no processo alveolar, é observado que estas muitas vezes cicatrizam com o tecido fibroso, em vez do tecido ósseo. A regeneração tecidual guiada (RTG) é um dos tratamentos para reconstituição de novo tecido, o qual utiliza membranas como barreira de proteção física da área defeituosa. Esta barreira previne a invasão de outros tecidos e permite repovoamento seletivo da superfície da raiz pelas células do ligamento periodontal e osso alveolar, capazes de promover a regeneração de tecidos de suporte perdidos como resultado de uma doença periodontal progressiva. Neste contexto, vários tipos de barreiras físicas têm sido sugeridos para uso em RTG e, as membranas biodegradáveis são de grande interesse, devido a essas evitarem o segundo procedimento cirúrgico para remoção da barreira. Assim, no presente estudo membranas de quitosana/gelatina com e sem glicerina foram desenvolvidas e o efeito do agente reticulante (glutaraldeído - GTA) foi analisado por dois métodos: imersão e vapor. O intumescimento das membranas foi realizada in vitro em tampão fosfato a 36°C e as membranas foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho (FTIR). No espectro de FTIR obtido a partir das membranas de quitosana/gelatina as bandas características de ambos os polímeros foram observados, indicando que houve interação entre a quitosana e a gelatina. Nos espectros obtidos a partir de membranas reticuladas, foi observado um deslocamento da banda a 1654 cm-1, sugerindo efeitos do GTA. Nos resultados do ensaio de intumescimento foram observados que no início do processo a absorção de massa ocorreu rapidamente, atingindo o equilíbrio em 15 minutos. Observou-se também que para as membranas de quitosana/gelatina a taxa de intumescimento diminui com o aumento da concentração de GTA e isso foi mais pronunciado para as membranas sem glicerina (em ambos os métodos de reticulação). Ademais foi observado que o método de reticulação por imersão confere as membranas menor grau de intumescimento, quando comparada com os resultados obtidos através da reticulação por vapor. Entretanto, as membranas reticuladas por vapor são mais resistentes à fragmentação, mostrando-se superiores no ponto de vista morfológico, podendo apresentar melhor estabilidade biológica. Dentre as condições estudadas, as membranas de quitosana/gelatina/glicerina reticuladas por vapor apresentaram características como flexibilidade e facilidade de manuseio, sugerindo que estas membranas podem apresentar boas características para uso em RTG. / The biofilm buildup within the sub gingival areas can lead to vascular and cellular responses, which can result in periodontal disease. Chronic periodontitis are chronic inflammation and progressive, clinically characterized by gingival inflammation, bleeding on probing, decreased resistance of the periodontal tissues on probing, gingival attachment loss and alveolar bone. In studies of lesions occurring in the alveolar process, it is observed that these often heal with fibrous tissue rather than bone. The guided tissue regeneration (GTR) is one of the treatments to replenish new tissue using a membrane as a barrier of physical protection of the defective area by preventing the invasion of other tissues and allowing repopulation selective root surface by cells of the periodontal ligament and alveolar bone, capable of promoting the regeneration of supporting tissues lost as a result of progressive periodontal disease. In this context, various types of physical barriers have been suggested for use in GTR and the biodegradable membranes are of great interest, due to avoid second surgical procedure for removal the barrier. Thus, in this study, chitosan/gelatin membranes, with and without glycerin were developed and the effect of cross-linked (glutaraldehyde) was analyzed by two methods: immersion and vapour. The swelling of these membranes was performed in vitro in saline at 36°C and the membranes were characterized by FTIR spectroscopy. In the FTIR spectrum obtained from chitosan/gelatin membrane bands features of both polymers were observed, indicating interaction between chitosan and gelatin. In the spectra obtained from membranes crosslinked, was observed a shift of the band at 1409 cm-1 to 1380 cm-1 associated with angular deformations of C-H, suggesting effect of glutaraldehyde. In the curves of swelling were observed that at the beginning the process of mass absorption occurred rapidly, reaching equilibrium in approximately 15 minutes. It was also observed that for chitosan/gelatin membranes the percentage of swelling decreases with increasing concentration of glutaraldehyde and this was more pronounced for membranes without glycerin (for both crosslinked methods). In addition it was noted that the immersion method immersion gives a lower degree of swelling, when compared with the results obtained by vapour crosslinking. However, vapour crosslinked membranes are more resistant to fragmentation, showing up higher in the morphological point of view, and may have better biological stability. Furthermore the membranes chitosan/gelatin/glycerin vapour crosslinked are flexible and ease of handling, suggesting that these these membranes have good characteristics for use in GTR.

Estudos do titânio e suas ligas, como biomateriais, visam melhorar problemas relacionados com a interface osso-implante que podem determinar a qualidade, o tempo de reparação óssea e, por conseguinte o sucesso clínico do implante. O objetivo deste estudo foi avaliar, em ratos, a osteointegração de implantes macroporosos produzidos pelo método da metalurgia do pó (MP), com adição controlada de gelatina. Foram utilizadas, como grupo controle, amostras de titânio comercialmente puro (Ticp) e amostras da liga Ti-13Nb-13Zr obtida pelo processo de MP, sinterizadas a 1150°C / 14 horas (10-5 mBar). Para a obtenção das amostras porosas, foi adicionado até 15% em peso de gelatina aos pós metálicos (Ti, Nb e Zr), as amostras foram tratadas termicamente em forno a vácuo (10-2 mBar) a 300°C / 90 min e sinterizadas. Foi feita a caracterização física dos pós metálicos, da liga sinterizada e amostras porosas. A caracterização biológica iniciou-se pelo teste in vitro de citotoxicidade, de acordo com a norma ISO- 10993-5 (1993), que permitiu a utilização dos implantes em teste in vivo. A avaliação da osteointegração foi realizada em ratos Wistar, macho, em um período de 28 dias. As análises morfológicas, microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV), avaliaram qualitativamente a osteointegração. Como conclusão, a metodologia inédita do processo de MP modificado pela adição de gelatina, propiciou com êxito a obtenção de implantes metálicos porosos. A gelatina por ser um colágeno, não interferiu na característica final de não-citotoxicidade dos implantes. O tamanho dos poros obtidos por esta técnica permitiu a nutrição e manutenção necessária para a sobrevivência das células, comprovando que os poros e canais formaram uma rede de alta interconectividade comprovando assim o aspecto de osteointegração e osteocondução da liga porosa. / Studies of titanium and its alloys commonly used as biomaterials, aim to improve bone-implant interface related problems which may determine the quality, the bone repairing time and therefore the clinical success of the implant. The goal of this study was to evaluate, in rats, osteointegration of macroporous implants produced by powder metallurgy (PM) method, with controlled addition of gelatin. Were used as control group, samples of commercially pure titanium (cpTi) and samples of the Ti-13Nb-13Zr alloy obtained by the PM process, sintered at 1150ºC / 14 hours (10-5 mBar). To obtaining the porous samples, at most 15% in weight of gelatin was added to metallic powders (Ti, Nb and Zr), the samples were thermally treated in vacuum oven (10-2 mBar) at 300°C / 90 min, and sintered. Physical characterization of metallic powders, sintered alloy and porous samples were made. The biological characterization began by in vitro cytotoxicity essay according with norm ISO-10993-5 (1993), which allowed uses the implants for in vivo testing. The osteointegration evaluation was performed in Wistar rats, males, for 28 days period. The morphological analyses, optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM), evaluated qualitatively the osteointegration. Concluding, the unpublished new methodology of PM process modified by addition of gelatin, propitiate with success the obtaining of porous metallic implants. The gelatin as a collagen did not interfered in the final non-cytotoxic implant characteristic. Porous size obtained by this technique allowed the nourishing and necessary maintenance to cell survival, proving that the pores and channels formed a high interconnectable network showing thus the osteointegration and osteoconduction feature of the porous alloy.

Estudos do titânio e suas ligas, como biomateriais, visam melhorar problemas relacionados com a interface osso-implante que podem determinar a qualidade, o tempo de reparação óssea e, por conseguinte o sucesso clínico do implante. O objetivo deste estudo foi avaliar, em ratos, a osteointegração de implantes macroporosos produzidos pelo método da metalurgia do pó (MP), com adição controlada de gelatina. Foram utilizadas, como grupo controle, amostras de titânio comercialmente puro (Ticp) e amostras da liga Ti-13Nb-13Zr obtida pelo processo de MP, sinterizadas a 1150°C / 14 horas (10-5 mBar). Para a obtenção das amostras porosas, foi adicionado até 15% em peso de gelatina aos pós metálicos (Ti, Nb e Zr), as amostras foram tratadas termicamente em forno a vácuo (10-2 mBar) a 300°C / 90 min e sinterizadas. Foi feita a caracterização física dos pós metálicos, da liga sinterizada e amostras porosas. A caracterização biológica iniciou-se pelo teste in vitro de citotoxicidade, de acordo com a norma ISO- 10993-5 (1993), que permitiu a utilização dos implantes em teste in vivo. A avaliação da osteointegração foi realizada em ratos Wistar, macho, em um período de 28 dias. As análises morfológicas, microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV), avaliaram qualitativamente a osteointegração. Como conclusão, a metodologia inédita do processo de MP modificado pela adição de gelatina, propiciou com êxito a obtenção de implantes metálicos porosos. A gelatina por ser um colágeno, não interferiu na característica final de não-citotoxicidade dos implantes. O tamanho dos poros obtidos por esta técnica permitiu a nutrição e manutenção necessária para a sobrevivência das células, comprovando que os poros e canais formaram uma rede de alta interconectividade comprovando assim o aspecto de osteointegração e osteocondução da liga porosa. / Studies of titanium and its alloys commonly used as biomaterials, aim to improve bone-implant interface related problems which may determine the quality, the bone repairing time and therefore the clinical success of the implant. The goal of this study was to evaluate, in rats, osteointegration of macroporous implants produced by powder metallurgy (PM) method, with controlled addition of gelatin. Were used as control group, samples of commercially pure titanium (cpTi) and samples of the Ti-13Nb-13Zr alloy obtained by the PM process, sintered at 1150ºC / 14 hours (10-5 mBar). To obtaining the porous samples, at most 15% in weight of gelatin was added to metallic powders (Ti, Nb and Zr), the samples were thermally treated in vacuum oven (10-2 mBar) at 300°C / 90 min, and sintered. Physical characterization of metallic powders, sintered alloy and porous samples were made. The biological characterization began by in vitro cytotoxicity essay according with norm ISO-10993-5 (1993), which allowed uses the implants for in vivo testing. The osteointegration evaluation was performed in Wistar rats, males, for 28 days period. The morphological analyses, optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM), evaluated qualitatively the osteointegration. Concluding, the unpublished new methodology of PM process modified by addition of gelatin, propitiate with success the obtaining of porous metallic implants. The gelatin as a collagen did not interfered in the final non-cytotoxic implant characteristic. Porous size obtained by this technique allowed the nourishing and necessary maintenance to cell survival, proving that the pores and channels formed a high interconnectable network showing thus the osteointegration and osteoconduction feature of the porous alloy.

Neste trabalho foi padronizado o método de obtenção da solução Fricke gel desenvolvida no IPEN. Foram comparados os resultados obtidos para diferentes qualidades do gel utilizado na preparação das soluções e a influência da concentração de gelatina na resposta das soluções dosimétricas. Testes de desempenho tais como: resposta em função da dose, limites mínimo e máximo de detecção, reprodutibilidade da resposta, entre outros, foram realizados utilizando diferentes tipos de radiação e empregando as técnicas de espectrofotometria de Absorção Óptica (AO) e Ressonância Magnética (RM). Os intervalos de dose determinados para radiação gama do Co 60 e fótons de 6 MeV estão entre 0,4 e 30,0 Gy e entre 0,5 e 100,0 Gy , empregando as técnicas de AO e RM, respectivamente. Um estudo de difusão dos íons férricos na solução foi realizado para a determinação do intervalo de tempo ótimo entre a irradiação e a avaliação das amostras; as imagens por RM podem ser obtidas com boa nitidez até 2,5 horas após a irradiação. Também foi desenvolvido um simulador esférico constituído de solução Fricke gel preparada com 5% de gelatina 270 Bloom (qualidade nacional), para a avaliação tridimensional de dose empregando a técnica de Imageamento por Ressonância Magnética (IRM). A solução Fricke gel preparada com gelatina 270 Bloom , que, além do baixo custo, pode ser adquirida facilmente no mercado nacional, apresenta resultados satisfatórios quanto à facilidade de manuseio, sensibilidade, reprodutibilidade da resposta e consistência. Os resultados obtidos confirmam sua aplicabilidade na dosimetria tridimensional pela técnica de IRM. / This study standardized the method for obtaining the Fricke gel solution developed at IPEN. The results for different gel qualities used in the preparation of solutions and the influence of the gelatin concentration in the response of dosimetric solutions were compared. Type tests such as: dose response dependence, minimum and maximum detection limits, response reproducibility, among others, were carried out using different radiation types and the Optical Absorption (OA) spectrophotometry and Magnetic Resonance (MR) techniques. The useful dose ranges for Co 60 gamma radiation and 6 MeV photons are 0,4 to 30,0 Gy and 0,5 to 100,0 Gy , using OA and MR techniques, respectively. A study of ferric ions diffusion in solution was performed to determine the optimum time interval between irradiation and samples evaluation; until 2,5 hours after irradiation to obtain sharp MR images. A spherical simulator consisting of Fricke gel solution prepared with 5% by weight 270 Bloom gelatine (national quality) was developed to be used to three-dimensional dose assessment using the Magnetic Resonance Imaging (MRI) technique. The Fricke gel solution prepared with 270 Bloom gelatine, that, in addition to low cost, can be easily acquired on the national market, presents satisfactory results on the ease of handling, sensitivity, response reproducibility and consistency. The results confirm their applicability in the threedimensional dosimetry using MRI technique.

Neste trabalho foi padronizado o método de obtenção da solução Fricke gel desenvolvida no IPEN. Foram comparados os resultados obtidos para diferentes qualidades do gel utilizado na preparação das soluções e a influência da concentração de gelatina na resposta das soluções dosimétricas. Testes de desempenho tais como: resposta em função da dose, limites mínimo e máximo de detecção, reprodutibilidade da resposta, entre outros, foram realizados utilizando diferentes tipos de radiação e empregando as técnicas de espectrofotometria de Absorção Óptica (AO) e Ressonância Magnética (RM). Os intervalos de dose determinados para radiação gama do Co 60 e fótons de 6 MeV estão entre 0,4 e 30,0 Gy e entre 0,5 e 100,0 Gy , empregando as técnicas de AO e RM, respectivamente. Um estudo de difusão dos íons férricos na solução foi realizado para a determinação do intervalo de tempo ótimo entre a irradiação e a avaliação das amostras; as imagens por RM podem ser obtidas com boa nitidez até 2,5 horas após a irradiação. Também foi desenvolvido um simulador esférico constituído de solução Fricke gel preparada com 5% de gelatina 270 Bloom (qualidade nacional), para a avaliação tridimensional de dose empregando a técnica de Imageamento por Ressonância Magnética (IRM). A solução Fricke gel preparada com gelatina 270 Bloom , que, além do baixo custo, pode ser adquirida facilmente no mercado nacional, apresenta resultados satisfatórios quanto à facilidade de manuseio, sensibilidade, reprodutibilidade da resposta e consistência. Os resultados obtidos confirmam sua aplicabilidade na dosimetria tridimensional pela técnica de IRM. / This study standardized the method for obtaining the Fricke gel solution developed at IPEN. The results for different gel qualities used in the preparation of solutions and the influence of the gelatin concentration in the response of dosimetric solutions were compared. Type tests such as: dose response dependence, minimum and maximum detection limits, response reproducibility, among others, were carried out using different radiation types and the Optical Absorption (OA) spectrophotometry and Magnetic Resonance (MR) techniques. The useful dose ranges for Co 60 gamma radiation and 6 MeV photons are 0,4 to 30,0 Gy and 0,5 to 100,0 Gy , using OA and MR techniques, respectively. A study of ferric ions diffusion in solution was performed to determine the optimum time interval between irradiation and samples evaluation; until 2,5 hours after irradiation to obtain sharp MR images. A spherical simulator consisting of Fricke gel solution prepared with 5% by weight 270 Bloom gelatine (national quality) was developed to be used to three-dimensional dose assessment using the Magnetic Resonance Imaging (MRI) technique. The Fricke gel solution prepared with 270 Bloom gelatine, that, in addition to low cost, can be easily acquired on the national market, presents satisfactory results on the ease of handling, sensitivity, response reproducibility and consistency. The results confirm their applicability in the threedimensional dosimetry using MRI technique.

Tesis por compendio / [ES] La criopreservación de semen de peces es una técnica que puede aumentar la eficiencia de la reproducción en cautiverio de especies de peces de agua dulce y marinas. A lo largo de las últimas décadas, se han establecido protocolos para criopreservación de semen de diversas especies de peces. Sin embargo, el foco principal de los pescadores ha sido en tener éxito en el congelamiento y descongelamiento de los espermatozoides, no llevando en cuenta el período en que los gametos se quedan expuestos a la solución crioprotectora en un momento previo a la fertilización. Esta exposición de los espermatozoides a las soluciones crioprotectoras después del descongelamiento puede ser perjudicial a la calidad de los gametos, ya que pueden ser tóxicos. La mayoría de los protocolos establecidos utilizan recipientes de plástico ultrarresistentes para almacenar el semen durante el proceso de criopreservación. Estos recipientes normalmente no se reutilizan, generando residuos altamente contaminantes al medio ambiente. Así, el objetivo principal de la tesis fue crear y probar métodos de bajo costo que potencialicen el uso de los espermatozoides descongelados de peces y torne el proceso de criopreservación de semen menos contaminante al medio ambiente. Los experimentos de los capítulos 1 y 2 se llevaron a cabo en Brasil. Utilizamos el jundiá gris Rhamdia quelen, especie considerada modelo experimental para peces nativos de América del Sur. En el capítulo 1, probamos el uso de la dilución de semen descongelado para disminuir la toxicidad de la solución crioprotectora. La técnica se utiliza comúnmente en protocolos de criopreservación de semen de mamíferos, pero nunca antes se había aplicado al semen descongelado de peces suramericanos. Muestras de semen descongelado de R. quelen se diluyeron en un diluyente salino (NaCl al 1,1% - 325 mOsm kg-1; pH 7,6). Después, observamos que los espermatozoides de muestras diluidas mostraron mayores velocidades, rectitud, progresión y frecuencia de batido flagelar que las muestras no diluidas. La dilución del semen descongelado también proporcionó mayores tasas de fertilización y eclosión que el grupo no diluido. De esta manera, la dilución de semen descongelado de R. quelen resultó ser una metodología sencilla, económica y eficiente que debe incluirse en el protocolo de criopreservación del semen de la especie. En los capítulos 2 y 3 desarrollamos y probamos la metodología para el uso de cápsulas de gelatina biodegradables (colágeno) y cápsulas de hipromelosa biodegradables (HPMC) como recipiente alternativo al uso de pajuelas de plástico en la criopreservación de semen de peces. En el segundo capítulo observamos que las cápsulas biodegradables mantuvieron los parámetros cinéticos y la capacidad reproductiva del esperma de R. quelen así como las pajuelas de plástico.Los procedimientos experimentales del capítulo 3 se llevaron a cabo en España. En este capítulo aplicamos la metodología desarrollada en el capítulo 2 para la criopreservación del semen de anguila europea Anguilla anguilla, dorada Sparus aurata y lubina Dicentrarchus labrax. En estas tres especies, las cápsulas biodegradables conservaron los parámetros cinéticos y la integridad de la membrana de los espermatozoides, así como las pajuelas de plástico. Además, observamos que el daño al ADN en muestras de semen de anguila europea y lubina europea criopreservadas en cápsulas y pajuelas no difirió. Sin embargo, las muestras de semen de dorada mostraron mayor daño en el ADN que las criopreservadas en pajuelas. Aunque, el nivel de daño que observamos en las muestras almacenadas en las cápsulas se considera bajo, por lo que pueden no comprometer el desarrollo embrionario. Evaluamos los resultados y concluimos que las cápsulas de gelatina biodegradables y las cápsulas de HPMC biodegradables pueden utilizarse como recipientes alternativos al uso de pajuelas de plástico para la criopreservación de semen de las cuatro especies de peces. / [CA] La criopreservació de l'esperma de peixos és una tècnica que pot augmentar l'eficiència de la reproducció en captivitat d'espècies de peixos d'aigua dolça i marins. Al llarg de les dècades passades, s'han establert protocols per a la criopreservació de l'esperma de diverses espècies de peixos. No obstant això, el focus principal dels pescadors ha estat tenir èxit en la congelació i descongelació dels espermatozoides, sense tenir en compte el temps en què els gamets queden exposats a la solució crioprotectora abans de la fecundació. Aquesta exposició dels espermatozoides a les solucions crioprotectores després de la descongelació pot ser perjudicial per a la qualitat dels gàmetes, ja que poden ser tòxics. La majoria dels protocols establerts utilitzen recipients de plàstic ultrarresistents per emmagatzemar l'esperma durant el procés de criopreservació. Aquests recipients normalment no es reutilitzen, generant residus altament contaminants per al medi ambient. Així, l'objectiu principal de la tesi va ser criar i provar mètodes de baix cost que potenciïn l'ús dels espermatozoides descongelats de peixos i facin que el procés de criopreservació de l'esperma sigui menys contaminant per al medi ambient. Els experiments dels capítols 1 i 2 es van dur a terme a Brasil. Vam utilitzar el jundia gris Rhamdia quelen, una espècie considerada com a model experimental per a peixos natius d'Amèrica del Sud. En el capítol 1, vam provar l'ús de la dilució de l'esperma descongelat per reduir la toxicitat de la solució crioprotectora. Aquesta tècnica s'utilitza comúment en protocols de criopreservació de l'esperma de mamífers, però mai abans s'havia aplicat a l'esperma descongelat de peixos sud-americans. Mostres d'esperma descongelat de R. quelen es van diluir en un diluent salí (NaCl al 1,1% - 325 mOsm kg-1; pH 7,6). Després, vam observar que els espermatozoides de mostres diluïdes mostraven majors velocitats, rectitud, progressió i freqüència de batuda flagel·lar que les mostres no diluïdes. La dilució de l'esperma descongelat també va proporcionar majors taxes de fecundació i eclosió que el grup no diluït. D'aquesta manera, la dilució de l'esperma descongelat de R. quelen va resultar ser una metodologia senzilla, econòmica i eficient que ha d'incloure's en el protocol de criopreservació de l'esperma de l'espècie. En els capítols 2 i 3 vam desenvolupar i provar la metodologia per a l'ús de càpsules de gelatina biodegradables (col·lagen) i càpsules d'hipromelosa biodegradables (HPMC) com a recipient alternatiu a l'ús de canuts de plàstic en la criopreservació de l'esperma de peixos. En el segon capítol vam observar que les càpsules biodegradables mantenien els paràmetres cinètics i la capacitat reproductiva de l'esperma de R. quelen així com els canuts de plàstic. Els procediments experimentals del capítol 3 es van dur a terme a Espanya. En aquest capítol vam aplicar la metodologia desenvolupada al capítol 2 per a la criopreservació de l'esperma d'anguila europea Anguilla anguilla, daurada Sparus aurata i llobarro Dicentrarchus labrax. En aquestes tres espècies, les càpsules biodegradables van conservar els paràmetres cinètics i la integritat de la membrana dels espermatozoides, així com els canuts de plàstic. A més, vam observar que el dany a l'ADN en mostres d'esperma d'anguila europea i llobarro europeu criopreservades en càpsules i canuts no es va diferir. No obstant això, les mostres d'esperma de daurada van mostrar més dany a l'ADN que les criopreservades en canuts. Tot i això, el nivell de dany que vam observar a les mostres emmagatzemades en càpsules es considera baix, pel que poden no comprometre el desenvolupament embrionari. Vam avaluar els resultats i vam concloure que les càpsules de gelatina biodegradables i les càpsules d'HPMC biodegradables es poden utilitzar com a recipients alternatius a l'ús de canuts de plàstic per a la criopreservació de l'esperma de les quatre espècies de peixos. / [EN] Fish sperm cryopreservation is a technique that can increase the reproduction in captive efficiency of freshwater and marine fishes.Over the last few decades, protocols for sperm cryopreservation from many fishes have been established. However, the researchers' main focus was successfully freezing and thawing sperm, neglecting the period in which the gametes remain in contact with the cryoprotective solution until fertilization. Exposure of sperm to cryoprotectant solutions after thawing can be harmful to the quality of the gametes since they can be toxic. The majority of the established protocols use ultra-resistant plastic containers to store sperm during the cryopreservation process. These containers usually are not reused, generating highly polluting waste for the environment. Furthermore, in some countries, the containers usually used are sold by a few industries, which makes acquisition difficult and increases the product's price. Thus, the main objective of the thesis was to create and test low-cost methodologies that enhance the use of fish post-thaw sperm and make the sperm cryopreservation process more environmentally friendly. The experiments in the Chapters 1 and 2 were developed in Brazil. We used the South American silver catfish Rhamdia quelen, a species considered an experimental model for native South American fishes. In Chapter 1, we tested the use of post-thawing dilution to reduce the toxicity of the cryoprotectant solution. This technique is commonly used in mammalian sperm cryopreservation protocols but has never before been applied to post-thaw sperm of South American fishes. South American silver catfish post-thaw sperm samples were diluted in a saline extender (1.1% NaCl - 325 mOsm kg-1; pH 7.6). The post-thaw sperm diluted samples showed higher velocities, straightness, progression, and flagellar beat frequency than the cells of undiluted samples (control). The post-thawing dilution also provided higher fertilization and hatching rates than the control group. Thus, the post-thawing sperm dilution proved to be a simple, cheap, and efficient methodology that should be included in the silver catfish sperm cryopreservation protocol. In Chapters 2 and 3, we developed, tested, and described the methodology for using biodegradable gelatin (collagen) and hypromellose (HPMC) capsules as an alternative container to plastic straws in the fish sperm cryopreservation. In the second chapter, we observed that the biodegradable capsules maintained the kinetic parameters and reproductive capacity of South American silver catfish sperm just as effectively as plastic straws. The experimental procedures in Chapter 3 were carried out in Spain. We apply the methodology developed in Chapter 2 to the cryopreservation of sperm from European eel Anguilla anguilla, gilthead seabream Sparus aurata, and European sea bass Dicentrarchus labrax. In these three species, biodegradable capsules preserved the sperm kinetic parameters and membrane integrity just as effectively plastic straws. We observed that DNA damage in European eel and European sea bass sperm samples cryopreserved in capsules and straws did not differ. On the other hand, gilthead seabream sperm samples showed higher DNA damage than those cryopreserved in straws. However, the damage level observed in samples stored in capsules is considered low, thus, may not compromise embryonic development. We observed the results and concluded that biodegradable gelatin and HPMC capsules could be used as alternative containers to plastic straws for sperm cryopreservation from the tfour aquaculture fishes. / This study was supported by MICINN with funding from European Union NextGenerationEU (PRTR-C17.I1) and by Generalitat Valenciana (THINKINAZUL/2021/012;THINKINAZUL/2021/024;THINKINAZUL/2021/042) including the contract of FF-G.WAG-L has a Margarita Salas postdoctoral contract (RD 289/2021. UAB) by the Spanish Ministry of Universities. LF has a PhD contract from Generalitat Valenciana (GRISOLIAP/2020/063). TSF (141717/2019-0 and 200285/2021-1) and MPS (200452/2022-3) have fellowships from Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq). / De Souza França, T. (2024). Development and Application of Low-Cost and Environment-Friendly Techniques for Fish Sperm Cryopreservation [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204486 / Compendio

O crescente interesse na utilização de biomateriais para reparação óssea levou a inúmeros estudos envolvendo formação de diversos produtos, neste sentido, os compósitos obtidos utilizando-se gelatina (G), quitosana (QS) e hidroxiapatita (HA) destacam-se por serem bioativos e bioabsorvíveis, além de apresentarem elevada similaridade com o tecido a ser reparado. Barreiras físicas formadas por tais materiais são extremamente importantes para a odontologia, e o seguinte trabalho tem como objetivo a preparação de membranas de G/QS/HA a partir de um método de co-precipitação in situ da HA na matriz polimérica para sua utilização em regeneração tecidual guiada (RTG). As membranas contendo razões de 20/80, 50/50 e 80/20 de G/QS com 0,3M de HA foram preparadas com pequena adição de glicerina (0,5% v/v) e suas características morfológicas e físico-químicas foram analisadas por meio de técnicas como espectroscopia no infravermelho (IV), difração de raios X (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia por energia dispersiva (EDS) e análise termogravimétrica (ATG). Além disso, foram realizados ensaios de intumescimento e ensaios de citotoxicidade in vitro com cultura de células para verificar a possibilidade de utilização das membranas confeccionadas. O processo de precipitação in situ foi eficaz para formação das mambranas. Além disso, as amostras reticuladas por GTA apresentaram melhores resultados de intumescimento, ao passo que as membranas reticuladas por TPP não se mostraram citotóxicas. / The increasing growth in the usage of bio-composites in bone repair has led to several studies involving the formation of several products. In this sense, composites obtained with gelatin (G), chitosan (QS) and hydroxyapatite (HA) stand out since they are bioactive and biodegradable, besides showing high similarity with the tissue to be repaired. Physical barriers made by such materials are extremely important in orthopedics, and the present work aims to craft G/QS/HA membranes by an in situ co-precipitation method of HA in the polymeric matrix to use them with a treatment called guided bone regeneration (RTG). The membranes containing 20/80, 50/50 and 80/20 weigh percent of G/QS with 0,3M of HA were prepared with a small amount of glycerin (0,5% v/v) and its morphological and physicochemical properties were analyzed by infrared spectroscopy (IV), X-ray diffraction (DRX), scanning electron microscopy (MEV), electron energy loss spectroscopy (EDS) and thermo gravimetric analysis (ATG). On top of that, swelling essays and in vitro cytotoxicity with cell culture were be carried out to check the availability and possible uses of the crafted membranes. The in situ precipitation method was effective to form the membranes. The samples crosslinked with GTA showed better swelling results, however the TPP method yielded non-cytotoxic membranes.

Um dos maiores desafios da ortopedia é recuperar o tecido ósseo que tenha sido perdido por motivo de doença ou acidente. Na busca de substitutos para os enxertos, tem-se utilizado comumente biomateriais, para recuperação desse tecido. A quitosana é um polímero biocompatível, biodegradável e juntamente com a gelatina, que é produto da desnaturação do colágeno, possuem uso potencial no área de regeneração de tecidos ósseos. O objetivo deste trabalho é a preparação, caracterização de hidrogéis de quitosana:gelatina mineralizados, em diferentes proporções (1:0,5; 1:1 e 1:2) e estudar a liberação controlada de gentamicina utilizando como suporte o hidrogel mineralizado. A quitosana foi obtida a partir da desacetilação parcial da quitina oriunda de gládios de lula e a gelatina utilizada é a comercial Sigma®. Os hidrogéis foram mineralizados pelo método de imersão alternada em soluções de CaCl2 0,2 mol L-1 pH=7,4 e de Na2HPO4 0,12 mol L-1 pH=9,0. A mineralização foi caracterizada por espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), análise termogravimétrica (TG), microscopia eletrônica de varredura (MEV), dispersão de raios-X (EDS), difração de raios-X (DRX) e cinética de absorção em PBS. Nas análises de TG e MEV pode-se observar a ocorrência de mineralização homogênea no hidrogel, aproximadamente 60% (m/m) em todas as proporções. Nos espectros de FTIR, EDS e DRX, observou-se que o sal de fosfato de cálcio formado durante o processo de mineralização alternada corresponde à hidroxiapatita. Quanto ao estudo de absorção em PBS, os hidrogéis mineralizados apresentam menor intumescimento que os não-mineralizados. Estudou-se o comportamento da liberação in vitro (em PBS, pH 7,4) de gentamicina no hidrogel mineralizado de quitosana/gelatina (1:1) quando se altera a temperatura da liberação (25°C e 37°C). A gentamicina foi incorporada ao hidrogel mineralizado através da imersão em uma solução com concentração de 30 mg ml-1 de gentamicina. O estudo de liberação foi realizado em duas temperaturas 25°C e 37°C. A quantidade de fármaco liberado após 24 horas não é afetada pela alteração na temperatura, mas a velocidade da liberação nas duas primeiras horas é maior a 37°C do que a 25°C. O mecanismo de liberação da gentamicina foi ajustado para o modelo Korsmeyer-Peppas sugerindo que segue a difusão Fickiana. / The replacement of bone tissue lost due to illness or accident is a great challenge in orthopedic area. Biomaterials have been commonly used to prepare new materials for substitution of lost tissue. Chitosan is a biocompatible and biodegradable polymer and its association with gelatin has potential application in bone tissue regeneration. The objective of this study is to describe the preparation and characterization of mineralized hydrogels of chitosan/gelatin prepared with different ratios (1:0.5, 1:1 and 1:2) and the controlled release of gentamicin using the mineralized hydrogel as a support. Chitosan was obtained from the partial deacetylation of squid pens and gelatin was commercial (Sigma ®). The mineralization process was carried out by the alternate soaking method. Hydrogels were soaked in 0.2 mol L-1 CaCl2 buffered with 0.05 mol L-1 Tris buffer (pH 7.4) at 25°C for 30 min, taken out of the Ca2+ solution, rinsed with deionized water and then soaked in 0.12 mol L-1 Na2HPO4 solution buffered with 0.05 mol L-1 Tris buffer (pH 9.0) for 30 min, taken out of the PO43- solution and rinsed with deionized water. The alternate soaking cycle was repeated 6 times to obtain the mineralized matrices which were then rinsed with water, frozen and lyophilized. Mineralized hydrogels were characterized by infrared spectroscopy (FTIR), thermogravimetric analysis (TG), scanning electron microscopy (SEM), Energy Dispersive Spectroscopy (EDS), X-ray diffraction (XRD) and kinetic absorption in PBS. SEM results showed an homogeneous mineralization, and for all hydrogels a quantity of approximately 60% (w/w) of mineralization was determined by TG. FTIR, EDS and XRD indicated that phosphate calcium deposited during mineralization process was hydroxyapatite. Mineralized hydrogels had lower swelling values in comparison with non-mineralized, as observed by absorption in PBS. Release of gentamicin in mineralized hydrogel was performed at 25°C and 37°C. Gentamicin was incorporated in the mineralized hydrogel by immersion in a gentamicin solution with a concentration of 30 mg ml-1. The change in release temperature showed that the quantity of drug delivery was not affected after 24 hours. However, the release rate in the first hour is higher at 37°C. The release mechanism of gentamicin was adjusted to the Korsmeyer-Peppas model suggesting that drug release is mostly controlled by a diffusion process.