Atualmente a cultura da cana de açúcar tem ganhado destaque no cenário mundial devido a seu potencial uso na produção de bioenergia o qual poderia ser beneficiado desenvolvendo-se cultivares com aumento da produtividade de biomassa por unidade de área, o que é por sua vez, determinada pela arquitetura da planta. A brotação lateral é um dos principais fatores que regulam a arquitetura dos vegetais. Recentemente, esta fase do desenvolvimento tem sido estudada intensivamente em plantas consideradas modelo, elucidando em parte as vias genéticas, ambientais e hormonais que regulam este processo. Dentro desta vias, microRNAs, uma classe de pequenos RNAs não codantes que modula pós-transcricionalmente a expressão de genes endógenos, parecem ser importantes reguladores. Em cana de açúcar, a brotação lateral é importante para a arquitetura dos ramos laterais, germinação de gemas e perfilhamento. Entretanto, devido a sua complexidade genética e ausência de mutantes defectivos na brotação lateral, estudos nesta área ao nível molecular são limitados. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos estudar em cana de açúcar a via microRNA156/fatores de transcrição do tipo SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPL), a qual é associada à regulação do perfilhamento, bem como caracterizar molecularmente o processo de emergência de gemas axilares. Ferramentas computacionais usando o banco publico de ESTs TIGR gene índex permitiram identificar e classificar no genoma de cana de açúcar, diferentes genes associados ao processo de brotação lateral e resposta hormonal. Entres estes, seis genes SPL regulados pelo miR156 foram identificados, sendo um deles (SsSPL1) homólogo a SPLs envolvidas diretamente na regulação do perfilhamento. A expressão da SsSPL1 foi monitorada em diferentes tecidos e órgãos, juntamente com o miR156. Os dados sugerem que a SsPL1, é regulada negativamente pelo miR156, sendo esta via também conservada em cana de açúcar. Foram geradas plantas transgênicas da cultivar RB85486 com o gene endógeno SsmiR156a/b o qual codifica um precursor conservado do miR156 e parece estar associado com a evolução da arquitetura em monocotiledôneas. O acúmulo do miR156 foi avaliado em plantas transformadas via RT-qPCR encontrando variabilidade na sua expressão. Bibliotecas de pequenos RNAs foram geradas em gemas dormentes e em desenvolvimento, permitindo identificar membros de 26 famílias de miRNAs. A expressão de quatro deles, de seus genes-alvo e de outros genes selecionados foi monitorada em gemas dormentes e com 2 e 5 dias após o plantio. Interessantemente, o miR159 foi o mais expresso em gemas axilares de cana e parece ser um fator chave na emergência da gema, já que, segundo os resultados obtidos, esse miRNA parece modular a expressão do seu gene alvo SsGAMyB, o qual é um fator de transcrição implicado na ativação de genes de resposta a giberelina. Durante esta fase inicial do desenvolvimento também foi observado alterações na expressão de genes associados com processos de transdução de sinal associados aos fitohormônios auxina e etileno. Os resultados obtidos indicam que a emergência de gemas laterais é um processo dinâmico em que fitohormônios, fatores de transcrição e microRNAs participam conjuntamente para promover o crescimento e 12 desenvolvimento da nova plântula de cana de açúcar. / Sugarcane is an economically important biofuel crop that recently has become a target for improvement of sustainable biomaterial production due to its high biomass productivity and built-in containment features. Therefore, studies aiming to improve the production of biomass per area are among the most important issues in sugarcane production. Plant biomass is defined, at least in part, by its shoot architecture. Although shoot architecture (branching/tillering) is to some extend influenced by environmental factors, it is determined mainly by the plants genetic program. This includes developmental programs that are regulated by a complex network of genetic pathways that integrate endogenous and environmental cues. Several transcription factors as well as microRNAs are likely part of this network. In this study, we started to investigate the roles of the genetic pathway regulated by the microRNA156 and its targets, the transcription factors SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPLs) in sugarcane branching/tillering. We identified six members of the SPL family that were further classified into four subfamilies. In both dicots and monocots, these SPLs are key regulators of the plant shoot architecture. We monitored the expression patterns of SsmiR156 e SsSPL1 in distinct sugarcane tissues/organs. Our observations suggest that miR156 regulates posttranscriptionally SsSPL1 mainly in leaf tissues. We generated transgenic sugarcane plants overexpressing the monocot-specific sugarcane miR156 precursor SsMIR156b/c via biolistic method. This precursor is thought to be important for the evolution of grass shoot architecture. Although we observed higher accumulation of mature SsmiR156b/c in leaf tissues of some transgenic plants as compared with tissues from non-transgenic plants, we could not detect any significant changes in their vegetative architecture. Using deep sequencing approaches, we have generated two small RNA libraries from dormant and outgrown sugarcane lateral buds. Preliminary analyses indicate that a select group of small RNAs are expressed in lateral buds, including over 200 repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs) and 25 conserved microRNAs (miRNAs). Amongst the miRNAs, miR159 was the most sequenced in the two libraries. We evaluated miR159 accumulation pattern in addition to other selected miRNAs via qRT-PCR in dormant and developing buds. The majority of the evaluated miRNAs accumulate differentially during bud development, though with distinct expression patterns. Interestingly, miR159 accumulates at high levels in dormant buds, but scarcely in developing buds. Conversely, the experimentally confirmed miR159 target, a sugarcane GAMyB-like gene (SsGAMyB), is lowly expressed in dormant buds while its transcripts accumulate at higher levels in developing buds. GAMyB-like genes encode R2R3 MYB domain transcription factors that have been implicated in gibberellin (GA) and abscisic acid (ABA) signaling in germinating seeds. Our data suggest miR159 regulates GAMyB-like genes during sugarcane bud outgrowth. Similarly, SsSPL1 is regulated posttranscriptionally by the miR529, though this gene has sites for both miR529 and miR156. Auxin and ethylene-associated regulatory pathways are affected during sugarcane bud development. Taken together,our data indicate that sugarcane bud outgrowth from rhizomes is a complex developmental process involving hormones, transcription factors as well as microRNAs and other regulatory RNAs.

A conversão da proteína prion celular normal (PrPc), cuja função ainda esta sob investigação, para a forma infecciosa (PrPsc) é a causa de algumas doenças neurodegenerativas em humanos e animais. Vários estudos têm sido realizados e mostram que PrPc pode participar de processos normais como memória, estresse oxidativo, neuritogênese e outros. Portanto, a elucidação dos processos de regulação de sua expressão é importante tanto para definir uma estratégia para controlar a infecção quanto para entender melhor a função fisiológica de PrPc. Este trabalho tem por objetivo avaliar a expressão do gene de PrPc, a partir da regulação da atividade de seu promotor frente a drogas que foram eleitas de acordo com a composição dos elementos de resposta a fatores de transcrição nele contidos. Para isto o promotor foi clonado em um vetor contendo o gene \"reporter\" de luciferase, células C6 e PC-12 foram transfectadas e clones com expressão estável de luciferase foram selecionados. Os resultados dos tratamentos dos clones celulares mostram que éster de forbol (TPA) e AMPc induzem a atividade do promotor de 1,5 a 3 vezes, ácido retinóico (RA) diminui esta atividade em cerca de 50% enquanto que NGF e Dexametasona não têm efeito. A dependência da conformação da cromatina na regulação deste gene também foi testada utilizando-se Tricostatina A (TSA), esta droga foi capaz de aumentar de 10 a 4.000 vezes a atividade do promotor, o que foi seguida tanto pela indução de expressão do RNAm quanto da proteína PrPc. Este efeito parece não ser generalizado a todos os promotores uma vez que esta droga não alterou expressão de GAPDH e de β-actina. Quando TPA e AMPc foram associados à TSA uma potencialização do efeito indutor destas drogas foi observada e a associação de RA e TSA mostrou que RA reduz a indução gerada por TSA. Estes novos dados indicam que a regulação de PrPc é extremamente dependente da conformação da cromatina. / Conversion of the cellular normal prion protein (PrPc), whose physiological function is still under investigation, to an infectious form called prion is the cause of some neurodegenerative diseases. Therefore, the elucidation of PrPc gene regulation is important both to define a strategy to control the infection and to better understand PrPc function. We cloned the rat PrPc gene promoter region into a luciferase reporter vector, transfected C6 and PC-12 cells and isolated clones with stable luciferase expression. The phorbol ester TPA and cAMP induced promoter activity by 1.5 to 3 times, retinoic acid decreased it by 50% while NGF and dexamethasone had no effect. We also tested the dependence of chromatin conformation for PrPc promoter activity using Trichostatin A (TSA), which was able to highly increase not only promoter activity but also PrPc rnRNA and protein leveIs. Moreover, the TSA effect seems to be restricted since any alteration was observed regarding GAPDH (Glyiceraldehyde 3-phosphate desydrogenase) and β-actin expression. When cAMP, TPA or retinoic acid were associated with TSA a potentiation of their primary effects was observed. These new data indicate that PrPc gene regulation is highly dependent on disruption of chromatin fiber assembly what permits assess of trascription factors.

Fatores sigma de carência de ferro, representados por FecI de E. coli, direcionam a transcrição de genes de transporte de sideróforos (quelantes de ferro), e são geralmente regulados por fatores antissigma (FecR), que liberam o fator sigma após ligação do sideróforo no receptor de membrana externa (FecA). Caulobacter crescentus possui quatro genes para fatores sigma desta família. Ensaios de expressão gênica e crescimento indicaram que estes genes não respondem à disponibilidade de ferro. Em microarranjos de cDNA, apenas o gene fecA2 foi induzido em DfecR2 comparado à linhagem parental, sugerindo que este é o único gene alvo do fator sigma FecI2. Já DfecR4 mostrou indução em mais de 50 genes, alguns envolvidos na utilização de fontes alternativas de carbono. Ensaios fenotípicos com DfecI4 sugeriram que este gene é importante para o crescimento em g-ciclodextrina ou ácido caproico. Os resultados sugerem que o fator sigma FecI2 é bem específico, enquanto FecI4 parece regular uma resposta geral relacionada a compostos carbônicos, e não à homeostase de ferro. / Iron starvation sigma factors, whose prototype is E. coli FecI, direct transcription of genes involved in siderophore (iron chelators) transport, being usually regulated by anti-sigma factors (FecR), which release the sigma factor after siderophore binding to the outer membrane receptor (FecA). Caulobacter crescentus possesses four genes encoding FecI-like sigma factors. Gene expression and growth assays indicated that these genes do not respond to iron availability. In cDNA microarrays, only the fecA2 gene was induced in DfecR2 relative to the wild-type strain, suggesting that this is the only target gene of the FecI2 sigma factor. However, in DfecR4 there was induction of over 50 genes, some of them involved in utilization of alternative carbon sources. Phenotypic microarrays with the DfecI4 strain showed that this gene is important for growth in g-cyclodextrin or caproic acid. The results suggest that the FecI2 sigma factor is very specific, whereas FecI4 seems to regulate a more general response, related to carbon compounds rather than iron homeostasis.

O choque frio em bactérias causa a indução de proteínas de choque frio de baixo peso molecular (CSPs), que desestabilizam estruturas secundárias do mRNA, permitindo sua tradução. Caulobacter crescentus possui quatro genes codificando CSPs: cspA e cspB são induzidos sob choque frio, e cspC e cspD, na fase estacionária. Neste trabalho, foi determinada uma nova seqüência para o gene cspC, revelando que a proteína CspC possui dois domínios CSD, como CspD. O mutante nulo para cspC apresentou sensibilidade em baixa temperatura e menor viabilidade em fase estacionária, com alterações na morfologia. A região regulatória foi mapeada por fusões de transcrição, e uma região ativadora da expressão foi identificada, mostrando uma regulação transcricional. Algumas condições nutricionais que disparam a indução do gene foram determinadas, indicando que sua expressão é influenciada pela ausência de glicose no meio, mas não pela ausência de nitrogênio. Este perfil de indução não depende da região ativadora, que, por sua vez, é necessária para os máximos níveis de expressão. / The cold shock response in bacteria involves the expression of cold shock proteins (CSPs), which destabilize secondary structures on mRNAs, allowing their translation. Caulobacter crescentus possesses four genes encoding CSPs: cspA and cspB are induced upon cold shock, while cspC and cspD are induced at stationary phase. In this work, a new sequence for the coding region of the cspC gene was determined, revealing that CspC contains two cold shock domains, like CspD. A null cspC mutant was sensitive to low temperature, presented reduced viability at stationary phase, and altered morphology. The regulatory region of cspC was mapped by transcriptional fusions, identifying a region responsible for activation of cspC expression, suggesting a transcriptional regulation. Some nutritional conditions triggering cspC induction were determined, indicating that its expression is influenced by glucose starvation, but not by nitrogen starvation. This expression profile was not dependent on the activation region, which, in turn, was required for maximum levels of expression.

Para elucidar as vias genéticas controlando a formação das câmaras cardíacas, foi analisada a regulação do promotor atrial-específico do gene de codorna que codifica a isoforma lenta da cadeia pesada de miosina (slow myosin heavy chain 3 -SMyHC3). Em camundongos transgênicos, a expressão atrial-específica dos 840 pb do promotor SMyHC3 fundido ao gene repórter da fosfatase alcalina (HAP), SMyHC3-HAP, é controlada pelos 72 pb mais distais deste promotor. Este fragmento contém sítios putativos para ligação a receptores nucleares os quais foram denominados ECRRN (elemento complexo de resposta a receptores nucleares), definidos por modelagem molecular. Tratamento de embriões SMyHC3-HAP com ácido retinoico (AR) expande o domínio atrial de expressão do transgene, enquanto que a inibição da via de sinalização por AR reduz o domínio de expressão do transgene. Ensaios de gel shift revelam que os receptores de AR, RAR/RXR se ligam fracamente a esse promotor. Também, esses receptores não ativam o promotor SMyHC3 em experimentos de transfecção transiente, mesmo na presença de coativadores, tais como p300, CBP e GRIP1. Isso sugere a participação indireta de AR na regulação deste marcador atrial. Ensaios de transfecção celular demonstram que COUPTF2 é capaz de ativar o promotor SMyHC3 e, siRNA contra COUPTF2 inibe esta transativação. Embriões tratados com AR apresentam um aumento geral da expressão de COUPTF2, reforçando a idéia de que AR age indiretamente ativando este gene. Estudos de bioinformática revelam que o ECRRN está presente na região 3 do gene AMHC1 de galinha e alinhamentos indicam que pode se tratar de um elemento móvel que pode ter sido adquirido por um evento de exaptação. Em resumo, COUPTF2 e AR controlam a expressão do promotor SMyHC3, porém a natureza da relação entre os 2 elementos necessita ser elucidada. / To elucidate the genetic pathways controlling cardiac chamber formation, the atrial specific gene promoter SMyHC3 was analyzed. In transgenic mice, the atrial specific expression an 840 bp of the SMyHC3 promoter was linked to reporter gene human alkaline phosphatase (HAP), SMyHC3-HAP. By directed mutagenesis and deletion analysis we identified the more distal 72 bp of the promoter as responsible of the atrial expression. This fragment contains putative binding sites to nuclear receptors, the CNRRE (complex nuclear receptor response element), defined by molecular modeling. RA (retinoic acid) treatment in SMyHC3-HAP embryos expands the atrial domain. However, the RA effectors, RXR/RAR bind with low affinity to the SMyHC3 promoter. These receptors are not able to activate the promoter even in the presence of coactivators such as p300, CBP and GRIP1. These results suggest that RA acts indirectly to regulate this atrial marker. Cell transient transfection shows that COUPTF2 activate the SMyHC3 promoter, and COUPTF2 siRNA inhibits the transactivation of the SMyHC3 promoter. Treatment of embryos with RA increases the COUPTF2 expression reinforcing the idea that this receptor could be regulatedindirectly by RA. Bioinformatic studies revealed that CNRRE is present in the 3 region of the ortholog chicken AMHC1 gene. Alignments indicate that this CNRRE could have been acquired by an exaptation event. In conclusion, the SMyHC3 promoter seems to be controlled by RA and COUPTF2 governing atrial expression. However the nature of relationships between RA and COUPTF2 need to be elucidated.

Em bactérias, os fatores sigma alternativos permitem a rápida adaptação da célula a alterações no ambiente. Dentre estes, os fatores sigma ECF (função extra-itoplasmática) caracterizam-se pelo envolvimento na resposta a sinais da região extra-citoplasmática da célula. O sequenciamento do genoma de Caulobacter crescentus indicou a presença de 13 ORFs codificando fatores ECF. Este trabalho descreve a caracterização de cepas mutantes em cinco genes que codificam fatores sigma ECF de C. crescentus, sendo eles sigL, sigM, sigN, sigU e sigF. A regulação da expressão destes genes em respostas a diferentes estresses foi também analisada, pelo uso de fusões de transcrição de suas regiões promotoras ao gene reporter lacZ. Todos os mutantes mostraram-se viáveis, sendo também tão resistentes quanto a cepa parental a uma série de estresses ambientais testados, indicando que estes genes não são essenciais. Verificou-se, porém, que os mutantes nos genes sigL e sigM são mais sensíveis ao choque térmico extremo (48°C). A caracterização da cepa mutante em sigF mostrou que este gene é essencial para a resistência da célula a estresse oxidativo durante a fase estacionária. A análise da expressão de sigF indicou um controle pós-transcricional, com o acúmulo da proteína SigF durante esta fase do crescimento, sem um aumento na transcrição do gene. Oito genes regulados por &#963;F durante a fase estacionária foram identificados em experimentos de \"microarray\", incluindo os genes de resposta a estresse oxidativo, sodA e msrA. A análise da atividade do promotor de sigU mostrou sua indução na entrada na fase estacionária e após estresse salino e osmótico. No entanto, o mutante nulo em sigU não se apresentou mais sensível que a cepa parental a esses estresses. Os resultados aqui descritos permitiram identificar a importância de alguns dos fatores ECF de C. crescentus na resposta a estresses nesta bactéria. / Alternative sigma factors permit the rapid adaptation to environmental changes in bacteria. Among them, members of the ECF subfamily (extrac</i<ytoplasmic function) are characterized by their involvement in responses to changes in the extracytoplasmic compartment of the cell. Analysis of the complete genome sequence of Caulobacter crescentus has led to the identification of 13 ORFs encoding putative sigma factors of the ECF subclass. The present work describes the characterization of mutant strains in five genes encoding ECF sigma factors from C. crescentus, named sigL, sigM, sigN, sigU and sigF. The expression of these genes in response to distinct stress conditions was also investigated, using transcriptional fusions of their promoter regions to the lacZ reporter gene. The five mutants strains obtained were viable and did not show increased sensitivity, when compared to the parental strain, to a series of environmental stress conditions, indicating that these genes are not essential. However, the sigL and sigM mutant strains were shown to be more sensitive to extreme heat shock (48°C). Furthermore, the characterization of the sigF mutant strain demonstrated that this gene is essential for oxidative stress survival during stationary phase. Analysis of sigF expression indicated a post-transcriptional control, with an increase in the levels of SigF protein during this growth phase, without changes in the transcription rate of the gene. Eight genes regulated by &#963;F during stationary phase were identified in microarray experiments, including the oxidative stress response genes sodA and msrA. Analysis of sigU promoter activity in response to distinct stress conditions showed induction upon entry into stationary phase and during saline and osmotic stress. Nevertheless, the sigU null mutant did not show increased sensitivity to these stresses. The results described here identified the importance of some of the C. crescentus ECF sigma factors in the response to stresses in this bacterium.

P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). O gene kerV foi revelado numa busca por mutantes atenuados em virulência em uma biblioteca de mutantes por transposons da linhagem PA14 (Rahme et al., 1997). A caracterização da linhagem D12, mutante em kerV, confirmou sua virulência atenuada (Apidianakis et al., 2005 e An et al., 2009) e resultados do transcriptoma mostraram alteração na expressão de mais de 500 genes, sendo alguns relacionados com o sistema de \"quorum sensing\" (Rahme et al, dados não publicados). O gene kerV está próximo à montante ao gene gloB, envolvido em detoxificação de metilglioxal, e à jusante aos genes rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas na replicação e reparo do DNA. Este trabalho teve como objetivo estudar a função molecular do produto de kerV e a expressão dos genes do lócus kerV-rnhA-dnaQ. Análises de bioinformática indicam que a proteína KerV é uma metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. A expressão heteróloga desta proteína em E. coli, mostrou que ela é expressa de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroEL/GroES em baixas temperaturas ou quando fusionada a MBP ou GST. A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroEL sugerindo que para atingir sua conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. MBP-KerV purificado foi usado para ensaios \"in vitro\" de atividade de metiltransferase e ligação a SAM, que não foram conclusivos, pois não há certeza do seu correto estado de enovelamento. Ensaios de duplo-híbrido mostraram que KerV não interage com os produtos de rnhA e dnaQ, sugerindo que KerV não está diretamente relacionado com suas funções. A freqüência de mutação na linhagem D12 está levemente aumentada (aproximadamente quatro vezes), o que sugere que KerV não está diretamente envolvida no reparo de DNA do tipo ´mismatch repair`. Os ensaios usados para detectar metilação do DNA, proteínas e rRNAs não revelaram que KerV estaria envolvido com a metilação destes substratos. Os inícios de transcrição dos genes kerV, rnhA e dnaQ foram determinados. A deleção de kerV causa um efeito polar na transcrição do gene rnhA, que não se reflete nos níveis da proteína. A deleção também afeta a expressão de dnaQ, sugerindo que KerV seja importante para sua regulação. Os ensaios de complementação da virulência em modelos invertebrados e de células epiteliais de pulmão mostram que apenas a presença dos três genes e seus produtos em níveis normais são capazes de reverter a maioria dos fenótipos atenuados. KerV se mostrou essencial para a inibição da translocação de NF-kB para o núcleo das células, comprovando que esta proteína é relevante para a virulência de PA14, contribuindo com o silenciamento da resposta imune do hospedeiro. O conjunto dos resultados indicam uma complexa inter-relação entre a expressão dos genes kerV, rnhA e dnaQ e seu papel na biologia de P. aeruginosa. / P. aeruginosa PA14 is a burn isolate multi-host pathogen strain. The screening for virulence attenuated mutants in a PA14 transposon mutant library revealed the kerV gene (Rahme et al., 1997). The characterization of D12 strain, a kerV mutant, confirmed the attenuated virulence phenotype (Apidianakis et al., 2005 and An et al., 2009) and transcriptome analysis showed the expression of more than 500 genes are affected in D12, some of these genes are related with quorum sensing (Rahme et al, unpublished data). kerV is upstream of the gloB gene, related with methylglioxal detoxification and downstream of the rnhA and dnaQ genes, both related with DNA replication and repair. The purpose of this work was to study the molecular function of KerV product and the expression of kerV-rnhA-dnaQ locus. Bioinformatics analysis indicated that KerV is a SAM dependent methyltransferase that have a conserved SAM binding domain with architecture compatible with classic alternating &#946;-stranded and &#945;-helical regions. KerV does not show any other conserved motif that could indicate its methylation substrate. Heterologous expression in E. coli showed that KerV is partially soluble only when co-expressed with GroeL/GroES chaperones at low temperatures or when KerV is in fusion with MBP or GST tag. During the purification process KerV was copurified with GroEL chaperone suggesting that this association may be required for the correct folding of KerV. Methyltransferase activity and SAM binding assays were done with purified MBPKerV and the results were not conclusive since the proper conformation of MBP-KerV cannot be verified. Yeast two-hybrid assays indicated that RNaseH and DnaQ are not interaction partners of KerV, suggesting that their functions are not directly related. The mutation frequency of D12 strain increased only about four times in relation to PA14, suggesting that KerV is not directly involved with DNA mismatch repair. The assays to detect methylation in DNA, RNAs and proteins do not show that KerV is involved with methylation of these substrates. The transcription start sites of kerV, rnhA and dnaQ genes were mapped through 5\'-RACE- and primer extension experiments. The kerV deletion causes a polar effect on the transcription of rnhA gene, which is not reflected on RNaseH protein levels. The kerV deletion also affects dnaQ expression, suggesting that KerV is important for its regulation.The virulence complementation assays in flies and lung epithelial cells showed that the fully rescue of the wild type phenotype was achieved only when the entire locus is present. KerV was essential to inhibit the NF-kB nucleus translocation, demonstrating that KerV is relevant to PA14 virulence, contributing for the silencing of host immune system. Altogether, these data showed a complex inter-relation among kerV, rnhA and dnaQ genes and its role in P. aeruginosa biology

Ces dernières années des études ont montré le rôle de la méthylation dans la régulation transcriptionnelle. Au cours de cette thèse, nous avons exposé des cellules hépatiques à plusieurs stimuli pour en évaluer l'effet au niveau du méthylome. Nous avons précisément étudié des facteurs clés dans le carcinome hépatocellulaire que sont le virus de l'hépatite B, le TGFbeta et au cours de la différenciation des hépatocytes. Au cours de ces expositions, nous avons observé que la méthylation était remanié spécifiquement dans certaines régions. En effet nous n'avons pas observé de nombreux changements dans les régions promotrices mais dans les régions intragéniques. Nous avons ensuite identifié l'impact des changements de méthylation dans ces régions. Nous avons ainsi pu observer qu'au cours de la différenciation hépatique une déméthylation du corps du gène HNF4A au sein d'un promoteur alternatif était corrélé à l'expression d'un autre isoforme de ce gène sous le contrôle de ce promoteur alternatif. Enfin nous avons utilisé l'outil d'édition CRISPR pour modifier les régions intragéniques. Nous avons ainsi inséré des mutations au sein d'un enhancer intronique du gène TRRAP. Nous avons alors observé que cette région semblait être nécessaire à la surexpression du gène au cours du traitement mais également au niveau de la réponse au TGFbeta. En conclusion nous avons identifié les régions intragéniques comme des régions épigénétiquement dynamiques en réponse aux facteurs environnementaux tels que l'inflammation et l'infection par HBV. Nous avons également identifié pour ces régions un potentiel rôle dans la régulation transcriptionnelle ainsi que dans les événements d'épissage alternatif / Hepatitis B virus (HBV) and chronic inflammation are well known risk factors for several chronic liver pathologies and cancer. We firstly studied the ability of HBV to modify the host methylome, using naturally infected primary human hepatocytes, and bead array. As a result, we identified non- random changes in gene expression and DNA methylation occurring specifically upon HBV infection. Moreover, a set of differentially methylated sites appeared early and were stable. These HBV-induced DNA methylation changes were defined by a specific chromatin context characterized by CpG-poor regions outside of gene promoters. During liver inJury, hepatic progenitor cells (HPC) are essential for tissue regeneration. Because of its role in determining cellular fate, DNA methylation may have an important role during the process of HPC differentiation. We therefore assessed DNA methylation during HPC differentiation. We found a progressive demethylation of HNF4A alternative promoter strongly associated with higher expression of another isoforms of HNF4A. Finally, TGFbeta is linked to a change in DNA methylation profiles. Using genome-wide strategy we observed a specific pattern of DNA methylation changes in response to TGFbeta treatment. Indeed, the observed changes were, as for HBV-induced changes, enriched in intragenic regions. In order to study the role of these regions, we used CRISPR/Cas 9 strategy on the intragenic enhancer of the TRRAP gene. This disruption was likely to suppress TGFbeta response at TRRAP expression level as well as the complete response to this cytokine. These data support a higher dynamicity of intragenic regions in response to the different stimuli we used at methylation level in liver cells. Moreover, these results support a role of intragenic methylation in cellular

La moule de Méditerranée Mytilus galloprovincialis (Mollusque Bivalve), est un animal important tant au niveau écologique qu'économique. Comme tous les invertébrés, elle ne possède qu'un système d'immunité innée pour lutter contre les infections. Cependant, étant constamment exposée à une grande variété de microorganismes invasifs et potentiellement pathogènes, et existant depuis plus de 500 millions d'années, son système immunitaire paraît très efficace. C'est afin de mieux comprendre comment celui-ci fonctionne, que ces travaux concernant la structure des peptides impliqués dans la réponse immunitaire, ainsi que leur régulation, ont été entrepris. Ils ont permis (i) de déterminer que le niveau d'expression constitutive des gènes liés à l'immunité, ainsi que la nature et l'intensité de la régulation de leur expression, sont fortement dépendant de la saison et de l'origine géographique des moules ; (ii) de confirmer le rôle essentiel de la structure tridimensionnelle des peptides antimicrobiens (AMP) dans les activités biologiques ; (iii) de déterminer la structure complète de la mytimycine, peptide strictement antifongique, ainsi que de la cytokine MIF ; (iv) de confirmer l'existence d'un fort polymorphisme des ARNm codant les molécules effectrices de l'immunité au niveau individuel, intra et inter-populationnel ; (v) de déterminer que les niveaux d'expression des gènes liés à l'immunité dépendent des microorganismes injectés, ce qui suggère une reconnaissance/réponse spécifique; (vi) de démontrer l'existence d'une voie de transmission du signal fonctionnelle depuis des récepteurs membranaires de type Toll (TLR) jusqu'au facteur NF-κB, mais pas d'une voie de type IMD. Ainsi, la réponse immunitaire innée de la moule apparait extrêmement complexe, mettant en jeux des effecteurs polymorphes dont l'expression est modulée en fonction de la saison, de l'origine géographique et de façon spécifique en réponse à différents microorganismes. Par contre, la transcription de leurs gènes pourrait être sous le contrôle d'une seule voie de transmission du signal. / The Mediterranean mussel, Mytilus galloprovincialis (bivalve, mollusc), is an ecologically and economically essential animal. As other invertebrates, it possesses only an innate immune system to protect itself against infections. However, constantly exposed to a large variety of invasive and potentially pathogen microorganisms, and existing since more than 500 million years, its immune system seems very effective. To improve our understanding on such a system, present works were made concerning the structure and expression regulation of peptides involved in the immune response. They allowed (i) to determine that the constitutive expression levels of genes linked to immunity, as well as the nature and intensity of their expression regulation, are strongly dependent on the season and on the geographical origin of mussels; (ii) to confirm the crucial role of the three-dimensional structure of antimicrobial peptides (AMP) in biological activities; (iii) to determine the complete structure of mytimycine, a strictly antifungal peptide, as well as of cytokine MIF; (iv) to confirm the existence of an extended polymorphism of mRNA coding for the molecular effectors of immunity in individuals, within and between populations; (v) to determine that expression levels of genes linked to immunity are strongly dependent to the injected microorganisms, suggesting a specific recognition/ response; (vi) to demonstrate the existence of a functional signalling pathway from Toll-like receptors (TLR) to NF-κB factor, but not of an IMD-like pathway. In conclusion, the immune response of the mussel appeared extremely complex, involving polymorphic effectors expressed differently according to the season, the geographical origin, and specifically in response to different microorganisms. On the other hand, their gene transcription could be under the control of only one signal transmission pathway.

Pseudomonas aeruginosa é uma gamaproteobactéria ubíqua capaz de infectar indivíduos imunocomprometidos e causar infecções hospitalares. Entre duas repetições diretas situadas na ilha de patogenicidade PAPI-1 da linhagem PA14, encontram-se dois grupos de genes transcritos em direções opostas. O primeiro, composto de pvrS, pvrR, rcsC e rcsB, codifica proteínas de sistemas de dois componentes e está relacionado com virulência, enquanto o segundo compreende cinco genes (cupD1-D5) e codifica uma fímbria do tipo chaperoneusher, com alta similaridade com o grupo cupA, envolvido na formação de biofilme em outras linhagens de P. aeruginosa. Fímbrias da mesma família são importantes na patogenicidade de outras bactérias. Com o objetivo de estudar a relação entre esses dois grupos de genes, procurou-se caracterizar sua organização por ensaios de RT-PCR, que possibilitaram observar a disposição dos genes dos sistemas de dois componentes em dois operons distintos (pvrRS e rcsCB) e, pelo menos, cupD1-cupD2 como uma unidade transcricional, com indícios apontando para a organização de cupD1-D5 em um único operon. Os inícios de transcrição e as regiões promotoras de cada operon foram caracterizados por experimentos de RACE 5 e extensão de oligonucleotídeo marcado em busca de seqüências relevantes para a ativação da expressão desses genes. Visando investigar a regulação da expressão da fímbria CupD pelos sistemas de dois componentes codificados pelos genes adjacentes, foram realizados ensaios de qRT-PCR, os quais mostraram uma menor expressão de cupD na linhagem mutante para rcsB. RcsB apresenta um domínio de ligação a DNA e, apesar da falta de sucesso em ensaios de ligação dessa proteína à região promotora de cupD, os dados obtidos por qRT-PCR 1 indicam fortemente que essa proteína funciona como um ativador de transcrição dos genes da fímbria. Corroborando esses achados, somente quando se utilizou RNA extraído de P. aeruginosa PA14 superexpressando RcsB foi possível visualizar no gel a banda referente ao início de transcrição de cupD1-D2 no ensaio de extensão de oligonucleotídeo. Ao contrário do efeito positivo de RcsB observado na transcrição de cupD1, cupD2 e cupD5, a histidina quinase RcsC atua negativamente na expressão dos genes da fímbria, sugerindo que, nesse caso, sua atividade predominante sobre RcsB seja a de fosfatase. PvrS e PvrR parecem atuar de forma indireta e positiva sobre cupD. Como um segundo objetivo do trabalho, ensaios de virulência de P. aeruginosa no hospedeiro-modelo Dictyostelium discoideum foram otimizados, com o estabelecimento de uma técnica para se testar alguns genes estudados no laboratório que podem ser relevantes para a virulência dessa bactéria. Resultados desses ensaios confirmaram a atenuação de mutantes para uma suposta metiltransferase, já observada em modelos de planta, camundongo e drosófila. Em conjunto, os resultados desse trabalho tornam-se informações valiosas para serem usadas na pesquisa de controle de infecções por P. aeruginosa, que depende de fímbrias para colonizar com sucesso superfícies abióticas que servem de veículo de disseminação desse agente infeccioso e para que as bactérias possam persistir no organismo do hospedeiro. / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous gammaproteobacteria able to infect immunocompromised individuals and to cause nosocomial infections. Between two direct repeats in the PAPI-1 pathogenicity island present in strain PA14, there are two gene clusters transcribed in opposite directions. The first, composed of pvrS, pvrR, rcsC and rcsB, encodes two-component systems proteins and is implicated in virulence, whereas the second comprises five genes (cupD1-D5) encoding a chaperone-usher fimbria with high similarity to cupA, a gene cluster involved in biofilm formation in other strains of P. aeruginosa. Fimbriae belonging to the same family of Cup are related to pathogenicity of other bacteria. In order to study the relationship between these two clusters, the organization of the genes in operons was characterized using RT-PCR, which results lead to the conclusion that the twocomponent systems genes are arranged into two different operons (pvrSR and rcsCB) and that cupD1-D2 share the same promoter, with some evidences that the operons extends from cupD1 to cupD5. The transcription start sites and the promoter regions of each operon were characterized with RACE 5 and primer extension assays to look for sequences that could be relevant to the activation of expression of these genes. Quantitative RT-PCR assays were carried out to investigate whether the expression of CupD fimbriae is regulated by the twocomponent systems encoded by the adjacent genes and the results showed a lower expression of cupD in the rcsB mutant strain than in the wild-type. RcsB bears a DNA-binding domain and, although our assays of DNA-protein interactions have failed, data obtained by qRT-PCR 1 strongly indicate that this protein functions as a transcription activator of fimbrial genes. These findings were corroborated by the primer extension assay, in which the band corresponding to the transcriptional start of cupD1-D2 was visible only when the reaction was performed with the RNA extracted of P. aeruginosa overexpressing RcsB. Unlike the effect observed for RcsB in cupD1, cupD2 and cupD5 transcription, the histidine quinase RcsC acts negatively in the fimbrial genes expression, suggesting that it might function predominantly as a RcsB phosphatase. PvrS and PvrR seem to regulate cupD positively and indirectly. As a second aim of this work, virulence assays of P. aeruginosa in the model host Dictyostelium discoideum were optimized, and a technique for testing genes studied in the laboratory that could be important for Pseudomonas virulence was established. These assays confirmed the attenuation-in-virulence of strains mutant in a putative methyltransferase gene, as observed before in plant, mouse and drosophila models. The results obtained in this work may contribute to P. aeruginosa infection control research, since this bacterium depends on fimbriae to successfully colonize abiotic surfaces that act as a dissemination vehicle, and to allow the bacteria to persist into the host organism.