Thesis (M.S.)--University of Texas at Dallas, 2008. / Includes vita. Non-Latin script record Includes bibliographical references (leaves 39-40)

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia micoplásmica suína (PMS) e tem sido descrita em diversos países como um dos patógenos mais comumente envolvidos em problemas respiratórios dos suínos, causando importantes perdas econômicas. Os métodos de uso corrente para a identificação de M. hyopneumoniae, sejam eles baseados em técnicas imunológicas, no cultivo e isolamento do agente etiológico ou em métodos moleculares, apresentam diversas limitações. Além disso, as vacinas para PMS oferecem apenas proteção parcial. A identificação e a caracterização imunológica e funcional de proteínas da bactéria, especialmente aquelas preferencial ou exclusivamente expressas em cepas patogênicas, pode trazer avanços importantes no conhecimento da biologia da bactéria e da interação entre patógeno e hospedeiro. Podem também, trazer melhorias para o imunodiagnóstico da PMS, em termos de aumento da especificidade e da sensibilidade dos testes utilizados, e melhorias no aspecto imunoprotetor das vacinas atualmente disponíveis. Com a disponibilização das seqüências do genoma das cepas 232, J e 7448 de M. hyopneumoniae foi possível à realização de uma análise comparativa das seqüências entre a linhagem não-patogênica (J) e os isolados patogênicos (232 e 7448), visando à identificação de genes que codificam proteínas determinantes de patogenicidade e/ou com potencial para utilização em imunodiagnóstico e/ou vacinação. Foram identificadas 118 seqüências codificadores de proteínas (CDSs), entre elas, estão, por exemplo, componentes de membrana com variações evidentes entre as linhagens e prováveis fatores de virulência. Nesta análise, foi também feita a identificação preliminar de 22 repetições nucleotídicas variáveis em tandem (VNTRs) em 12 CDSs correspondentes a lipoproteínas, antígenos, adesinas e outros fatores de virulência das cepas J, 7448 e 232. A análise destas VNTRs no genoma de M. hyopneumoniae foi estendida de modo a incluir duas outras cepas de M. hyopneumoniae (7422 e PMS). O grau de variabilidade entre cepas, o possível significado biológico destas variações e seu potencial para ser utilizado como base em um ensaio de PCR foram investigados. As VNTRs identificadas codificam para proteínas com variações no número de repetições de aminoácidos (VNTARs) que podem determinar variações estruturais, físico-químicas e antigênicas nas proteínas correspondentes, previstas in silico. Um PCR baseado nestas VNTRs foi proposto para identificação de cepas de M. hyopneumoniae a campo. Além disso, como parte de uma estratégia para a produção de reagentes imunodiagnósticos da PMS, clones das CDS p36 e NrdF de M. hyopneumoniae foram expressos e suas proteínas recombinantes purificadas. Dentre os dois soros policlonais monoespecíficos produzidos em coelhos, o soro anti-p36 apresentou uma menor reação inespecífica em ensaios de imuno-histoquímica do que o soro controle utilizado. As proteínas recombinantes purificadas, os anti-soros produzidos, juntamente com novos antígenos, dentre os possíveis identificados neste trabalho, além do VNTR-PCR proposto, poderão ser de valia para o monitoramento sanitário de rebanhos suínos quanto à presença assintomática de M. hyopneumoniae e a identificação mais precisa deste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of mycoplasmal pneumonia of swines (MPS) and it is one of the most commonly found pathogens in respiratory tract of swines worldwide, causing important economic losses. The diagnostic methods currently available for M. hyopneumoniae identification are based on immunological techniques, culture and isolation of the etiologic agent or molecular methods, all of them presenting peculiar limitations. Regarding control methods, the vaccines currently available for MPS offer only partial protection. The identification and the immunological and functional characterization of mycoplasmal proteins, especially those preferentially expressed in pathogenic strains, can help in the understanding of this bacterium’s biology as well as its host-pathogen interaction. Another important outcome of such studies would be increasing the specificity and sensitivity of the immunodiagnostic tests for MPS and improvements in the immune protection of currently available vaccines. The availability of the complete genome sequences of M. hyopneumoniae strains 232, J and 7448 became feasible a comparative analysis between the non-pathogenic strain (J) and the pathogenic ones (232 and 7448), focusing at the identification of gene products related to pathogenicity and/or presenting a potential for use in immunodiagnostic and/or vaccination. In this work we report the identification of 118 CDSs encoding putative virulence factors, which were based on specific criteria including predicted cell surface location, variations between strains, previous functional studies showing antigenicity or possible involvement in host-pathogen interaction. Using this analysis it was possible to identify 22 variable number of tandem nucleotides repeats (VNTRs) in 12 CDSs corresponding to lipoproteins, antigens, adhesins and other virulence factors of strains J, 7448 and 232. The analysis of these VNTRs from M. hyopneumoniae genome was further extended, including two others M. hyopneumoniae strains (7422 and PMS). The degree of variability between strains, the possible biological meaning of these variations and their potential to be used as VNTR-based PCR had been investigated. The identified VNTRs codes for proteins with variations in the number of amino acid repeats (VNTARs) that determine structural, physicochemical and antigenic variations in the corresponding proteins, as predicted in silico. As part of a strategy for the production of immunodiagnostic reagents for MPS, recombinant clones of p36 and NrdF CDSs were expressed, the correspondent proteins purified and polyclonal sera were produced in rabbits. The anti-p36 protein sera presented a low background in an immunohistochemistry assay when compared to the control sera. In conclusion, taken together the recombinant proteins and anti-sera that were produced, the new putative antigens that were identified and the development of a VNTR-PCR, could be of value for the sanitary monitoring of swine herds, specialy for the identification of asymptomatic carriers of M. hyopneumoniae and in the establishment of more efficient, specific and sensitive MPS diagnostic methods.

Um dos principais avanços da era pós-genômica consiste na possibilidade da análise da expressão global de genes pela tecnologia de microarranjos de DNA, a qual permite a investigação simultânea do perfil de transcrição de milhares de genes. Com os microarranjos, tornou-se possível comparar os padrões de expressão entre indivíduos de diferentes espécies, de diferentes órgãos/tecidos dentro de uma mesma espécie ou diferentes tecidos submetidos a várias situações e tratamentos e, ainda, analisar os genes de proteínas potencialmente reguladoras da transcrição, os fatores de transcrição. Uma etapa fundamental após a análise dos resultados dos microarranjos consiste na validação experimental dos dados de expressão gênica. Esta validação é realizada pela utilização da técnica de qRT-PCR (“Real Time Quantitative RT-PCR”) um método que, atualmente, apresenta maior sensibilidade e especificidade na análise de transcritos. A qRT-PCR necessita, entretanto, de normalização para uma leitura adequada dos dados. Essa normalização tornou-se bastante específica já que depende da disponibilidade de genes que apresentem transcritos com expressão uniforme em todas as células do organismo ou entre as espécies que estão sendo analisadas, bem como durante várias fases do desenvolvimento e sob diferentes condições ambientais. São os chamados genes-referência ou housekeeping. Entretanto, alguns trabalhos vêm constatando que os genes-referência utilizados na era prégenômica não apresentam expressão estável entre tecidos e genótipos e, por este motivo, não são adequados como controles em qRT-PCR. O objetivo desse trabalho foi investigar a estabilidade de expressão de genes constitutivos freqüentemente utilizados como controles internos em estudos de expressão gênica e selecionar novos genes-referência para Eucalyptus por meio de experimentos de qRT-PCR para a sua utilização na validação de experimentos de microarranjos do Projeto Genolyptus. Como resultados das análises de qRT-PCR, foi possível observar que para xilemas de E. globulus e xilemas e folhas maduras de E. grandis, os genes EuC12, At2g28390, EuC10, Histona H2B, Gliceraldeído- 3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), EuC06 e EuC09 foram os que demonstraram, respectivamente, menor variação em suas expressões, caracterizando-se como constitutivos para estes tecidos. De acordo com os resultados encontrados nas análises com cDNAs derivados de folhas e xilemas de E. grandis, somente EuC12 e At2g28390 demonstraram invariabilidade de expressões entre os tecidos. Dois tradicionais genes constitutivos, Histona H2B e GAPDH, apresentaram uma variação considerável nas suas expressões entre os tecidos. Os genes selecionados, servirão como controles internos em todas as qRTPCRs subseqüentes nas avaliações de dados gerados pelos microarranjos de DNA para todos os demais genes sob análise no Projeto Genolyptus, e demais linhas de investigação de Eucalyptus. Paralelamente realizou-se, ainda, a seleção e análise de treze genes com expressão diferencial significativa entre tecidos vasculares das espécies de E. grandis e E. globulus. Estes foram selecionados com base nos resultados de microarranjos do Genolyptus e terão seus padrões de expressão analisados por qRT-PCR. / One of the most important advances of post-genomic era is the possibility of global gene expression analysis by DNA microarray technology, which allow verifying transcription profile for thousand genes simultaneously. Microarray allows comparing expression patterns among individuals from distinct species, from distinct organs/tissues within of the same specie or distinct tissues submitted across a wide range of developmental and environmental conditions, beyond genes of proteins mighty involved in transcriptional regulation, the transcription factors. A basic stage of microarray analysis is the experimental validation from gene expression data. This validation is carried out by the use of qRT-PCR (“Real Time Quantitative RT-PCR”) technique witch is the method that currently presents greater sensitivity and specificity in transcript analysis. However, qRTPCR needs normalization for an accurate data interpretation. This data normalization is specific since it depends on the availability of a gene which displays highly uniform expression in all organism cells, between species under analysis, during various phases of development and under different environmental conditions. They are known as reference or housekeeping genes. However, some studies come evidencing that reference genes normally used in pre-genomic era doesn’t show steady expression between tissues and genotypes and, for this reason, are not suitable as controls in qRT-PCR. The objective of this work was to investigate the expression stability of housekeeping genes often used as internal controls in genetic expression studies and select novel genes for Eucalyptus by qRT-PCR for its use in the validation of Genolyptus Project microarray experiments. As results it was possible to identified histone, EuC06, EuC09, EuC10, EuC12, At2g28390 and GAPDH as the most stably expressed genes between E. globulus xylems and E. grandis xylems and mature leafs, as well pointing them out as control genes for these tissues. In accordance with the results found in the analysis with cDNAs derived from E. grandis leaves and xylems, only EuC12 and At2g28390 had demonstrated expression invariability between tissues. We found out that two traditional housekeeping genes, Histone and GAPDH, shown a considerable expression variation between those tissues. According to our analysis the selected genes will serve as internal controls in all subsequent qRT-PCRs, in microarray data evaluation to other genes under investigation in Genolyptus Project as well as another research lines in Eucalyptus. At the same time, we selected and analyzed thirteen genes with significant differential expression between E. grandis and E. globulus vascular tissues. These had been selected on the basis of the results of Genolyptus microarrays. Their expression patterns will be analyzed by qRTPCR.

FERREIRA FILHO, Luiz Ivando Pires. Alterações citogenômicas na medula óssea de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos. 2013. Dissertação (Mestrado Ciências Médicas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-02-17T12:21:59Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_lipferreira filho.pdf: 2103165 bytes, checksum: 7ca3a3bd505574da57104d00a78b404d (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-02-17T12:22:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_lipferreira filho.pdf: 2103165 bytes, checksum: 7ca3a3bd505574da57104d00a78b404d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-17T12:22:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_lipferreira filho.pdf: 2103165 bytes, checksum: 7ca3a3bd505574da57104d00a78b404d (MD5) Previous issue date: 2013 / Os pesticidas são produtos químicos de uso disseminado no controle das pragas nas lavouras agrícolas. Estes produtos são classificados em herbicidas, inseticidas e fungicidas e podem acumular-se no meio ambiente. Um grande número de estudos epidemiológicos em trabalhadores rurais sugeriu um aumento do risco de câncer no grupo exposto a pesticidas. O objetivo deste estudo é avaliar a presença de anormalidades cromossômicas em células da medula óssea e alterações do gene TP53 por FISH em trabalhadores rurais expostos a pesticidas. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliar estas alterações utilizando células-tronco hematopoéticas coletadas por aspirado da medula óssea. Foram avaliados 43 trabalhadores rurais do sexo masculino e detectadas anormalidades cromossômicas através de citogenética por Banda G em 11 (25%). A maioria destas anomalias era relacionada com aneuploidias (6/11). Aneuploidias podem ocorrer devido a um cromossomo extra ou ausente. De extrema importância, encontramos quatro casos com anormalidades estruturais relacionadas aos cromossomos 4, 5, 7 e 11, como deleções do braço longo dos cromossomos 5, 7 e 11. Detectamos supressão do gene TP53 por Hibridização por Fluorescência in situ (FISH) em 4/31 e de amplificação em 3/31 casos. As outras alterações por FISH foram relacionadas à aneuploidia (6/31). Entre as anormalidades numéricas, encontramos tetrassomia em 3 casos, trissomia em dois casos e monossomia em um caso. Nosso trabalho é o primeiro a apresentar anomalias citogenéticas em células da medula óssea de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos. Nosso estudo destaca a importância da prevenção primária, pois apenas 23% dos trabalhadores rurais relatou medidas de proteção. Todas essas anormalidades citogenéticas aqui detectados são descritas como responsáveis por aumentar o risco de desenvolvimento de neoplasias. Como o uso de agrotóxicos está disseminado em nossa agricultura, os trabalhadores rurais devem evitar o uso impróprio devido ao risco de desenvolver neoplasias.

VIANA, Daniel de Araújo. Polimorfismos do gene TP53 no linfoma de Hodgkin. 2007. 85 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Patologia, Fortaleza, 2007. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-21T11:21:30Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_daviana.pdf: 2983687 bytes, checksum: a560463a3e70aa3380fd982718cb146f (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T16:10:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_daviana.pdf: 2983687 bytes, checksum: a560463a3e70aa3380fd982718cb146f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T16:10:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_daviana.pdf: 2983687 bytes, checksum: a560463a3e70aa3380fd982718cb146f (MD5) Previous issue date: 2007 / Hodgkin lymphoma is a hematololgic B neoplasm occurring at patients within any age, however more likely to affect those from 15 to 40 years-old. The TP53 gene is 20kb length gene with 11 exons that encodes the p53 protein, which main function is related to the conservation and integrity of the genetic code. Most cancers show point mutations in the TP53 sequence. The analysis of these mutations allows a better understanding of the function of the diverse domains of the protein and its relationship to tumor suppression. There is only a few data about TP53 polymorphisms and Hodgkin lymphoma. In this manner, in our study we try to detect polymorphisms within the codons 272, 273, 278, 282, 306 of the exon 8 of the TP53 gene in Hodgkin lymphoma. In our survey we analyzed 42 paraffin-embedded tissues from 2000 to 2006. These samples were prepared for DNA extraction and PCR isolation and amplification of the 137bp fragment of the exon 8 of the TP53 gene, using exclusive primers specially designed to our experiment: PFw8 e PRv8. After PCR amplification, the products of the reaction were purified to the Sequencing reaction. The last part of the experiment encoded the bioinformatics analysis of sequences. DNA extraction and PCR amplification were successfully obtained in our study in all the samples. However, the DNA sequencing was only obtained in 32 samples, but there was no characteristic electropherogram of the analyzed region of the gene. Therefore, it was not possible to determine the presence or absence of SNPs in the TP53 exon 8. / O Linfoma de Hodgkin é uma hemopatia linfóide pode ocorrer em qualquer faixa etária; no entanto, é mais comum na idade adulta jovem, dos 15 aos 40 anos. O TP53 é um gene de 20kb de comprimento que possui 11 éxons situado no cromossomo 17 e codifica a proteína p53, uma proteína cuja principal função está relacionada à preservação da integridade do código genético, e, durante o ciclo celular faz verificação quanto à eventual ocorrência de uma mutação na seqüência do código genético. Na presença dessas mutações, impede que esta célula entre em processo de mitose e complete a divisão celular. A maioria dos cânceres apresenta mutações pontuais na seqüência do TP53. A análise dos padrões dessas mutações é de grande valia uma vez que o conhecimento dessas mutações leva a um melhor entendimento das funções dos vários domínios da proteína p53 e seu envolvimento com o mecanismo de supressão tumoral, além de permitir que essas mutações sejam utilizadas como biomarcadores para desvendar a oncogênese humana. Na literatura vigente, poucos trabalhos abordam a identificação dessas mutações em relação ao linfoma de Hodgkin – forma clássica. Dessa forma, este trabalho se propõe a investigar quantitativa e qualitativamente os padrões de polimorfismos existentes nesta forma do linfoma de Hodgkin. A primeira etapa do nosso experimento constou da seleção de 42 casos de linfonodos diagnosticados como linfoma de Hodgkin entre os anos de 2000 e 2006, arquivados em blocos de parafina. Os casos foram selecionados de pacientes com diagnóstico de linfoma de Hodgkin, sem predileção por idade, sexo ou raça. Em seguida, o DNA foi extraído das amostras selecionadas para reação de PCR, realizada para isolar e amplificar, o fragmento de 137pb correspondente ao éxon 8 do gene TP53, através de primers exclusivos desenhados para o experimento: PFw8 e PRv8. Após a reação, os produtos de PCR foram purificados para reação de Seqüenciamento de DNA, utilizando o seqüenciador automático de DNA da marca ABI Prism® 3100 de 16 capilares (Applied Biosystems). A última etapa aconteceu em laboratório de bioinformática – dry lab, onde as seqüências de DNA obtidas foram analisadas qualitativa- e quantitativamente. Os processos de extração do DNA genômico, amplificação do éxon 8, purificação do produto de PCR foram realizadas com sucesso em todas as amostras obtidas de material parafinizado. No seqüenciamento do DNA parafinizado foi possível determinar, com segurança e confiabilidades previstas em parâmetros convencionais, a seqüência de pelo menos 32 amostras; contudo, não se obteve distinção suficiente dos picos de eletroferogramas para a determinação de eventuais polimorfismos na região analisada. Não foi possível portanto, verificar com margem de segurança razoável, a presença ou ausência de SNPs nas amostras seqüenciadas. Houve, contudo, uma qualificação e competência laboratorial instalada localmente (em Fortaleza), a partir da experiência desenvolvida com o esforço deste trabalho, para continuar a investigação molecular em prol da determinação, em futuro breve, da ocorrência ou não de SNPs no exon 8 do TP53 em linfoma de Hodgkin.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016 / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:54:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340337.pdf: 2007305 bytes, checksum: 6be22e3638da4b7879d83a31d6880e6d (MD5) Previous issue date: 2016 / A exposição de Staphylococcus aureus a glicopeptídeos pode determinar mudanças transcricionais em genes envolvidos na biossíntese da parede celular. Somado a isso, mutações em sistemas reguladores de dois componentes como graSR, vraSR, walKR, além do gene codificador da unidade beta da RNA polimerase (rpoB) têm sido descritas e apresentam possível relação causal com o desenvolvimento de S. aureus com heterorresistência intermediária à vancomicina (hVISA). O fenômeno da heterorresistência é caracterizado pela presença de raras sobpopulações de células que apresentam níveis mais elevados de resistência e está associado a falha terapêutica, maior tempo de hospitalização, além de ser de difícil detecção laboratorial. Os mecanismos genéticos envolvidos neste fenótipo são pouco compreendidos e sua análise pode conduzir a determinação de marcadores moleculares da resistência além de auxiliar na validação de métodos laboratoriais que possibilitem um diagnóstico mais fácil, rápido e acurado. Nosso estudo contou com 12 isolados de hVISA obtidos de quatro hospitais de Santa Catarina e objetivou analisar dados de sequenciamento e o perfil de transcrição nos genes graSR, vraSR, walKR e rpoB destas amostras. Cinco isolados apresentaram-se mutados em pelo menos um dos genes avaliados. As mutações rpoB H481N e graS T224I foram as mais frequentes, seguidas pelas mutações graR D148Q e walK A468T. As mutações walK R222K e vraR E59D foram observadas com menor frequência, porém assim como as demais mutações citadas estão mais sugestivamente implicadas na aquisição da resistência em nossas amostras. Mutações em vraS e walR não foram descritas. Da mesma forma, alterações do perfil transcricional nos genes vraSR e walKR não foram observadas neste estudo. No entanto, a exposição à vancomicina aumentou o nível de expressão dos genes rpoB e graSR em pequeno número de nossas amostras, indicando a possível participação dos mesmos no desenvolvimento do fenótipo hVISA. Embora algumas questões permanecem sem resposta, nosso estudo possibilitou a descrição de alterações genéticas em isolados com redução de suscetibilidade à vancomicina que naturalmente ocorreram em hospitais de Santa Catarina, auxiliando, ainda, na compreensão dos prováveis mecanismos envolvidos na determinação deste fenótipo. <br> / Abstract : Staphylococcus aureus constantly exposed to glycopeptides determines transcriptional changes of genes involved in cell wall biosynthesis. Furthermore, mutations in two-component regulatory systems as graSR, vraSR, walKR and in gene encoding RNA polymerase beta unit (rpoB) have been described and may be related to heteroresistant vancomycin-intermediate S. aureus (hVISA). Heteroresistance is characterized by the presence of a rare population of cells with larger levels of resistance, and it is associated with therapy failure and longer hospital stays. Furthermore their laboratory detection is very difficult. The genetic mechanisms involved in this phenotype are poorly understood and their analysis may lead to the determination of molecular markers and validation of methods, which could make laboratory diagnosis earlier, faster and accurate. Our study included 12 hVISA isolates obtained from four hospitals in Santa Catarina and aimed to analyze sequencing data and the transcription levels of graSR, vraSR, walKR and rpoB genes. Five isolates showed mutations in at least one of the genes evaluated. The rpoB H481N and graS T224I were the most frequent mutations, followed by graR D148Q and walK A468T. The walK R222K and vraR E59D mutations were observed less frequently, but like other mutations were more involved in the acquisition of resistance in our samples. Mutations were not described in vraS and walR. Similarly, changes in the transcriptional profile of vraSR and walKR genes were not observed in this study. However, exposure to vancomycin increased the expression level of rpoB and graSR genes in small number of our samples. This indicated their possible participation in the development of hVISA phenotype. Although some questions remain unanswered, our study allowed the description of genetic changes in strains with reduced sensitivity to vancomycin that naturally occurred in hospitals in Santa Catarina and helped understanding the mechanism involved in the determination of this phenotype.

A bactéria Mycoplasma hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia micoplásmica suína (PMS) e tem sido descrita em diversos países como um dos patógenos mais comumente envolvidos em problemas respiratórios dos suínos, causando importantes perdas econômicas. Os métodos de uso corrente para a identificação de M. hyopneumoniae, sejam eles baseados em técnicas imunológicas, no cultivo e isolamento do agente etiológico ou em métodos moleculares, apresentam diversas limitações. Além disso, as vacinas para PMS oferecem apenas proteção parcial. A identificação e a caracterização imunológica e funcional de proteínas da bactéria, especialmente aquelas preferencial ou exclusivamente expressas em cepas patogênicas, pode trazer avanços importantes no conhecimento da biologia da bactéria e da interação entre patógeno e hospedeiro. Podem também, trazer melhorias para o imunodiagnóstico da PMS, em termos de aumento da especificidade e da sensibilidade dos testes utilizados, e melhorias no aspecto imunoprotetor das vacinas atualmente disponíveis. Com a disponibilização das seqüências do genoma das cepas 232, J e 7448 de M. hyopneumoniae foi possível à realização de uma análise comparativa das seqüências entre a linhagem não-patogênica (J) e os isolados patogênicos (232 e 7448), visando à identificação de genes que codificam proteínas determinantes de patogenicidade e/ou com potencial para utilização em imunodiagnóstico e/ou vacinação. Foram identificadas 118 seqüências codificadores de proteínas (CDSs), entre elas, estão, por exemplo, componentes de membrana com variações evidentes entre as linhagens e prováveis fatores de virulência. Nesta análise, foi também feita a identificação preliminar de 22 repetições nucleotídicas variáveis em tandem (VNTRs) em 12 CDSs correspondentes a lipoproteínas, antígenos, adesinas e outros fatores de virulência das cepas J, 7448 e 232. A análise destas VNTRs no genoma de M. hyopneumoniae foi estendida de modo a incluir duas outras cepas de M. hyopneumoniae (7422 e PMS). O grau de variabilidade entre cepas, o possível significado biológico destas variações e seu potencial para ser utilizado como base em um ensaio de PCR foram investigados. As VNTRs identificadas codificam para proteínas com variações no número de repetições de aminoácidos (VNTARs) que podem determinar variações estruturais, físico-químicas e antigênicas nas proteínas correspondentes, previstas in silico. Um PCR baseado nestas VNTRs foi proposto para identificação de cepas de M. hyopneumoniae a campo. Além disso, como parte de uma estratégia para a produção de reagentes imunodiagnósticos da PMS, clones das CDS p36 e NrdF de M. hyopneumoniae foram expressos e suas proteínas recombinantes purificadas. Dentre os dois soros policlonais monoespecíficos produzidos em coelhos, o soro anti-p36 apresentou uma menor reação inespecífica em ensaios de imuno-histoquímica do que o soro controle utilizado. As proteínas recombinantes purificadas, os anti-soros produzidos, juntamente com novos antígenos, dentre os possíveis identificados neste trabalho, além do VNTR-PCR proposto, poderão ser de valia para o monitoramento sanitário de rebanhos suínos quanto à presença assintomática de M. hyopneumoniae e a identificação mais precisa deste patógeno. / Mycoplasma hyopneumoniae is the etiologic agent of mycoplasmal pneumonia of swines (MPS) and it is one of the most commonly found pathogens in respiratory tract of swines worldwide, causing important economic losses. The diagnostic methods currently available for M. hyopneumoniae identification are based on immunological techniques, culture and isolation of the etiologic agent or molecular methods, all of them presenting peculiar limitations. Regarding control methods, the vaccines currently available for MPS offer only partial protection. The identification and the immunological and functional characterization of mycoplasmal proteins, especially those preferentially expressed in pathogenic strains, can help in the understanding of this bacterium’s biology as well as its host-pathogen interaction. Another important outcome of such studies would be increasing the specificity and sensitivity of the immunodiagnostic tests for MPS and improvements in the immune protection of currently available vaccines. The availability of the complete genome sequences of M. hyopneumoniae strains 232, J and 7448 became feasible a comparative analysis between the non-pathogenic strain (J) and the pathogenic ones (232 and 7448), focusing at the identification of gene products related to pathogenicity and/or presenting a potential for use in immunodiagnostic and/or vaccination. In this work we report the identification of 118 CDSs encoding putative virulence factors, which were based on specific criteria including predicted cell surface location, variations between strains, previous functional studies showing antigenicity or possible involvement in host-pathogen interaction. Using this analysis it was possible to identify 22 variable number of tandem nucleotides repeats (VNTRs) in 12 CDSs corresponding to lipoproteins, antigens, adhesins and other virulence factors of strains J, 7448 and 232. The analysis of these VNTRs from M. hyopneumoniae genome was further extended, including two others M. hyopneumoniae strains (7422 and PMS). The degree of variability between strains, the possible biological meaning of these variations and their potential to be used as VNTR-based PCR had been investigated. The identified VNTRs codes for proteins with variations in the number of amino acid repeats (VNTARs) that determine structural, physicochemical and antigenic variations in the corresponding proteins, as predicted in silico. As part of a strategy for the production of immunodiagnostic reagents for MPS, recombinant clones of p36 and NrdF CDSs were expressed, the correspondent proteins purified and polyclonal sera were produced in rabbits. The anti-p36 protein sera presented a low background in an immunohistochemistry assay when compared to the control sera. In conclusion, taken together the recombinant proteins and anti-sera that were produced, the new putative antigens that were identified and the development of a VNTR-PCR, could be of value for the sanitary monitoring of swine herds, specialy for the identification of asymptomatic carriers of M. hyopneumoniae and in the establishment of more efficient, specific and sensitive MPS diagnostic methods.

Um dos principais avanços da era pós-genômica consiste na possibilidade da análise da expressão global de genes pela tecnologia de microarranjos de DNA, a qual permite a investigação simultânea do perfil de transcrição de milhares de genes. Com os microarranjos, tornou-se possível comparar os padrões de expressão entre indivíduos de diferentes espécies, de diferentes órgãos/tecidos dentro de uma mesma espécie ou diferentes tecidos submetidos a várias situações e tratamentos e, ainda, analisar os genes de proteínas potencialmente reguladoras da transcrição, os fatores de transcrição. Uma etapa fundamental após a análise dos resultados dos microarranjos consiste na validação experimental dos dados de expressão gênica. Esta validação é realizada pela utilização da técnica de qRT-PCR (“Real Time Quantitative RT-PCR”) um método que, atualmente, apresenta maior sensibilidade e especificidade na análise de transcritos. A qRT-PCR necessita, entretanto, de normalização para uma leitura adequada dos dados. Essa normalização tornou-se bastante específica já que depende da disponibilidade de genes que apresentem transcritos com expressão uniforme em todas as células do organismo ou entre as espécies que estão sendo analisadas, bem como durante várias fases do desenvolvimento e sob diferentes condições ambientais. São os chamados genes-referência ou housekeeping. Entretanto, alguns trabalhos vêm constatando que os genes-referência utilizados na era prégenômica não apresentam expressão estável entre tecidos e genótipos e, por este motivo, não são adequados como controles em qRT-PCR. O objetivo desse trabalho foi investigar a estabilidade de expressão de genes constitutivos freqüentemente utilizados como controles internos em estudos de expressão gênica e selecionar novos genes-referência para Eucalyptus por meio de experimentos de qRT-PCR para a sua utilização na validação de experimentos de microarranjos do Projeto Genolyptus. Como resultados das análises de qRT-PCR, foi possível observar que para xilemas de E. globulus e xilemas e folhas maduras de E. grandis, os genes EuC12, At2g28390, EuC10, Histona H2B, Gliceraldeído- 3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), EuC06 e EuC09 foram os que demonstraram, respectivamente, menor variação em suas expressões, caracterizando-se como constitutivos para estes tecidos. De acordo com os resultados encontrados nas análises com cDNAs derivados de folhas e xilemas de E. grandis, somente EuC12 e At2g28390 demonstraram invariabilidade de expressões entre os tecidos. Dois tradicionais genes constitutivos, Histona H2B e GAPDH, apresentaram uma variação considerável nas suas expressões entre os tecidos. Os genes selecionados, servirão como controles internos em todas as qRTPCRs subseqüentes nas avaliações de dados gerados pelos microarranjos de DNA para todos os demais genes sob análise no Projeto Genolyptus, e demais linhas de investigação de Eucalyptus. Paralelamente realizou-se, ainda, a seleção e análise de treze genes com expressão diferencial significativa entre tecidos vasculares das espécies de E. grandis e E. globulus. Estes foram selecionados com base nos resultados de microarranjos do Genolyptus e terão seus padrões de expressão analisados por qRT-PCR. / One of the most important advances of post-genomic era is the possibility of global gene expression analysis by DNA microarray technology, which allow verifying transcription profile for thousand genes simultaneously. Microarray allows comparing expression patterns among individuals from distinct species, from distinct organs/tissues within of the same specie or distinct tissues submitted across a wide range of developmental and environmental conditions, beyond genes of proteins mighty involved in transcriptional regulation, the transcription factors. A basic stage of microarray analysis is the experimental validation from gene expression data. This validation is carried out by the use of qRT-PCR (“Real Time Quantitative RT-PCR”) technique witch is the method that currently presents greater sensitivity and specificity in transcript analysis. However, qRTPCR needs normalization for an accurate data interpretation. This data normalization is specific since it depends on the availability of a gene which displays highly uniform expression in all organism cells, between species under analysis, during various phases of development and under different environmental conditions. They are known as reference or housekeeping genes. However, some studies come evidencing that reference genes normally used in pre-genomic era doesn’t show steady expression between tissues and genotypes and, for this reason, are not suitable as controls in qRT-PCR. The objective of this work was to investigate the expression stability of housekeeping genes often used as internal controls in genetic expression studies and select novel genes for Eucalyptus by qRT-PCR for its use in the validation of Genolyptus Project microarray experiments. As results it was possible to identified histone, EuC06, EuC09, EuC10, EuC12, At2g28390 and GAPDH as the most stably expressed genes between E. globulus xylems and E. grandis xylems and mature leafs, as well pointing them out as control genes for these tissues. In accordance with the results found in the analysis with cDNAs derived from E. grandis leaves and xylems, only EuC12 and At2g28390 had demonstrated expression invariability between tissues. We found out that two traditional housekeeping genes, Histone and GAPDH, shown a considerable expression variation between those tissues. According to our analysis the selected genes will serve as internal controls in all subsequent qRT-PCRs, in microarray data evaluation to other genes under investigation in Genolyptus Project as well as another research lines in Eucalyptus. At the same time, we selected and analyzed thirteen genes with significant differential expression between E. grandis and E. globulus vascular tissues. These had been selected on the basis of the results of Genolyptus microarrays. Their expression patterns will be analyzed by qRTPCR.

Resumo: A leucemia de lactentes difere das demais por apresentar diversas características epidemiológicas e biológicas particulares, com destaque à alta freqüência do envolvimento do gene MLL que é rearranjado com uma variedade de outros genes (cerca de 50 já descritos), gerando produtos de fusão comprovadamente leucemogênicos, apesar de o mecanismo exato ser ainda desconhecido. A identificação do envolvimento do MLL é por si só de grande importância prognóstica e terapêutica, porém a identificação das seqüências parceiras assume importância desde que traz informações sobre os mecanismos básicos de leucemogênese, de possíveis alvos para terapias e pesquisa de doença residual mínima. Com o objetivo de estimar a freqüência e caracterizar os diferentes rearranjos do gene MLL em uma amostra brasileira de lactentes portadores de leucemia aguda de novo, foram analisados 112 pacientes provenientes do "Grupo Brasileiro de Estudos Colaborativos sobre Leucemia Aguda em Lactentes". Vários métodos laboratoriais foram utilizados de forma complementar (citogenética convencional e molecular, RT-PCR, Southern Blotting, LDI-PCR e seqüenciamento), de acordo com um fluxograma previamente estabelecido. Vinte pacientes (17,85%) eram portadores de alterações recorrentes e bem caracterizadas nas leucemias e foram excluídos da análise do gene MLL. Dentre os 92 restantes, 56 pacientes eram portadores de rearranjos no gene MLL (61%) e 36 não (39%). A alteração mais freqüentemente observada foi o rearranjo MLL/AFF1, observado em nove dentre os 56 pacientes positivos para o rearranjo considerando os diversos métodos (16,1%). O estudo corrobora a importância da utilização de diversas metodologias complementares na identificação do rearranjo do gene MLL e de seus parceiros, destacando a alta sensibilidade do método de hibridização in situ por fluorescência (FISH), que foi capaz de identificar 49 pacientes positivos em 82 (59,8%) em que a hibridização foi possível incluindo 38 casos que, sem esta análise, seriam dados como normais. Considerando que a limitação deste método é a não identificação do gene parceiro, a análise por LDI mostrou-se extremamente eficaz na complementação, identificando 9 de 13 casos analisados (69,2%), sendo que um destes rearranjado ao gene Nebulette, caracterizando um novo gene de fusão.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, 2012. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-06-22T13:33:05Z No. of bitstreams: 1 2012_LucianoCoelhoMilhomensCemin.pdf: 8570536 bytes, checksum: 4b4edb3b81a616dacb859d177664b5e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-08-09T13:29:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LucianoCoelhoMilhomensCemin.pdf: 8570536 bytes, checksum: 4b4edb3b81a616dacb859d177664b5e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-09T13:29:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LucianoCoelhoMilhomensCemin.pdf: 8570536 bytes, checksum: 4b4edb3b81a616dacb859d177664b5e8 (MD5) / O uso de código de barras de DNA ou DNA barcodes pode, teoricamente, permitir aidentificação de qualquer material biológico portador de DNA intacto. As dificuldadesde identificação e circunscrição taxonômica, o número insuficiente de especialistas eo crescente interesse no uso e na comercialização de suas espécies fazem dasAraceae um grupo ideal para o estabelecimento de uma ferramenta de identificaçãomolecular como esta. Assim, o principal objetivo deste estudo foi avaliar aaplicabilidade e o funcionamento de um fragmento do marcador matK como códigode barras de DNA, utilizando como modelo a família Araceae. Pela primeira vezdentro de Araceae, o uso de um marcador como sequência barcode foi avaliado emgrande escala. O fragmento-alvo de matK, de aproximadamente 725pb, mostrou-sesuficientemente variável para tal tarefa, sendo capaz de recuperar, na maioria doscasos, identificações inequívocas para os diferentes gêneros e espéciesamostrados. A busca BLAST® mostrou-se mais eficiente que o método de distânciaem recuperar identificações ao nível específico (68% e 81,5%, respectivamente). Ofragmento-alvo apresentou ainda forte sinal filogenético, refletindo grande parte dasrelações entre os diferentes táxons de Araceae. Embora o fragmento-alvo apresentelimitações no reconhecimento de espécies proximamente relacionadas, osresultados obtidos apontam para uma nova circunscrição taxonômica emXanthosoma Schott, na qual as principais espécies cultivadas de taioba seriam, naverdade, uma única espécie, com marcada amplitude de variação fenotípica,alcançada tanto por processos naturais quanto pela intervenção do homem. Ofragmento-alvo de matK mostrou-se ainda como uma ferramenta capaz de procedera identificação de um táxon desconhecido, servindo como base para a descrição deum novo gênero em Araceae: Lorenzia E.G. Gonç. gen. nov. inéd., instituído pelacriação da espécie Lorenzia umbrosa E.G. Gonç. sp. nov. inéd. Finalmente, autilização de uma abordagem DNA barcoding pode, futuramente, auxiliar naconservação e o uso sustentável das espécies de Araceae. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The use of DNA barcodes can, theoretically, allow the identification of any biologicalmaterial carrier of DNA intact. The difficulties of identification and taxonomiccircumscription, the insufficient number of specialists and the growing interest in theuse and marketing of species make Araceae an ideal group for the establishment ofa molecular identification tool. Thus, the main objective of this study was to evaluatethe applicability and operation of a marker fragment of matK as a barcode DNA,using the family Araceae as a model. For the first time in the Araceae, the use of amarker as barcode sequence was evaluated on a large scale. The target fragment ofmatK, approximately 725pb, was sufficiently variable for the task, which was able torecover in most cases, unambiguous identification of different genera as well asspecies level. The BLAST® search was more efficient than the method of retrievingdistance identification specific level (68% and 81.5%, respectively). The targetfragment presented a strong phylogenetical signal, largely reflecting the relationshipsbetween different taxa of Araceae. Although the target fragment showed limitations inthe recognition of closely related species, the results suggested a new taxonomiccircumscription of Xanthosoma Schott, in which the most cultivated species of tarowere, in fact, a single species, with large phenotypical variation as a result of bothnatural processes and human intervention. The target fragment of matK was capableof identifying an unknown taxon, which was as the basis for the description of a newgenus of Araceae: Lorenzia E.G. Gonç. gen. nov. ined., established by the creationof Lorenzia umbrosa E.G. Gonç. sp. nov. ined. Finally, the use of a DNA barcodingapproach may further assist in the conservation and sustainable use of Araceaespecies.