Pesquisas envolvendo a sistemática e a taxonomia de camarões de água doce do gênero Macrobrachium Bate, 1868 ainda são pouco elucidativas para alguns de seus membros. Este é o caso de Macrobrachium olfersii (Wiegmann, 1836) que ocorre desde o sudeste dos Estados Unidos até o sul do Brasil e é comumente confundido com espécies que ocorrem preferencialmente na América Central (M. faustinum (de Saussure, 1857), M. digueti (Bouvier, 1895), M. crenulatum Holthuis, 1950, M. hancocki Holthuis, 1950 e M. acanthochirus Villalobos, 1967). Em 1969 estas espécies foram designadas por Villalobos como complexo de espécies por compartilharem características morfológicas, principalmente quanto ao segundo par de pereópodos. Outras citações afirmaram esta forte afinidade, colocando algumas espécies em sinonímia. Diante deste problema, realizou-se uma revisão taxonômica e utilizaram-se dados moleculares para verificar a validade destas espécies e explorar as relações evolutivas entre elas. As hipóteses filogenéticas foram baseadas em sequências parciais dos genes 16S rDNA, COI mtDNA, H3 e 18S nDNA por meio de análise de Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana. Embora detalhada a redescrição das espécies, ressaltando as diferenças entre elas, as análises morfológicas não foram suficientes para inferir a filogenia desse grupo, devido a presença de caracteres plásticos e variáveis entre indivíduos da mesma espécie e outros conservados interespecificamente no gênero. Porém, todas as identidades foram suportadas com a análise molecular complementar baseada nos quatros marcadores, rejeitando a existência de sinonímias. Foi demonstrado através da análise baseada no gene 16S rDNA que estas espécies são evolutivamente relacionadas com M. zariqueyi Holthuis, 1949, da costa oeste da África, como compartilham características morfologicas, acredita-se que ela deva pertencer ao complexo M. olfersii, porém há a necessidade de verificar a taxonomia, analisar a morfologia e investigar outras sequências desta espécie. Os genes COI mtDNA e 16S rDNA apresentaram um amplo sinal filogenético permitindo uma boa resolução dos dendrogramas e H3 e 18S nDNA mostraram a recente divergência entre algumas espécies do grupo. / Studies on systematic and taxonomy of freshwater shrimp of the genus Macrobrachium Bate, 1868 are still unclear for some of its members, such as Macrobrachium olfersii Wiegmann, 1836). This species occurs from the southeastern United States to southern Brazil and is commonly mistaken with species that occur mainly in Central America (M. faustinum (de Saussure, 1857), M. digueti (Bouvier, 1895), M. crenulatum Holthuis, 1950, M. hancocki Holthuis, 1950 e M. acanthochirus Villalobos, 1967). In 1969 these species have been designated as a species-complex by Villalobos, because they share morphological characteristics, particularly in the second pair of pereiopod. This strong affinity and proposed some synonyms species is pointed by other authors. Faced with this problem, the validity of these species and the evolutionary relationships between them were verified by a wide taxonomic and molecular data. The phylogenetic hypotheses were based on partial sequences of 16S rDNA, COI mtDNA, 18S and H3 nDNA using analysis of Maximum Likelihood and Inference Bayesian. The diagnoses of the species were detailed, highlighting the differences between them. Nevertheless the morphological analysis were not enough to infer the phylogeny of this group because of the presence of plastic and variables characters among individuals of the same species and other preserved characters among different species of the genus. However, all identities were supported with additional molecular analysis based on four markers, rejecting the existence of synonymy. These species are evolutionarily related to M. zariqueyi Holthuis, 1949, from the west coast of Africa and share morphological character. The latter species could also belong to the M. olfersii complex because has philogenetic closeness, but before this afirmation it may be verified by morphological and molecular analysis. The mitochondrial genes (COI and 16S) showed a broad phylogenetic signal allowing a good resolution of the dendrograms. The nuclear genes (H3 and 18S) showed the recent divergence between some members of the group.

Introdução: Mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 são responsáveis por cerca de 50% dos casos de câncer de mama e/ou ovário hereditários. Atualmente não conhecemos o perfil de mutações destes genes na população brasileira, com exceção de mutações fundadoras que ocorrem em grupos étnicos específicos. Objetivos: Detectar mutações e polimorfismos nos genes BRCA1 e BRCA2 em 73 pacientes com câncer de mama selecionadas para o teste genético. Casuística e métodos: Realizamos o sequenciamento direto e o teste de MLPA para os genes BRCA1 e BRCA2 em 73 indivíduos, sendo 63 pacientes com câncer de mama com risco maior ou igual a 10% de acordo com os critérios de Frank, Evans e BRCAPRO, dois pacientes com câncer de ovário e oito indivíduos saudáveis com forte histórico familiar de câncer ligado a mutações em BRCA1 e/ou BRCA2. Resultados: Encontramos 60 mutações no gene BRCA1: 13 alterações missense (incluindo a deletéria R71G), sete mutações sinônimas, uma mutação frameshift (a deletéria 5382insC), uma mutação nonsense (a deletéria R1751X), uma deleção in frame, uma alteração 3UTR e 36 variantes intrônicas. Em BRCA2 encontramos 57 mutações, entre as quais 26 mutações missense, uma alteração 5UTR, 11 mutações sinônimas, 14 variantes intrônicas, duas mutações nonsense (as deletérias R2318X e R3128X) e três mutações frameshift deletérias (5844del5, 6633del5 e 6610insTT). Nenhuma mutação foi detectada pelo teste de MLPA. Discussão e considerações finais: Nove de 73 indivíduos estudados são portadores de mutações deletérias, sendo que a mutação fundadora Ashkenazi 5382insC foi encontrada em duas pacientes não aparentadas e que outro grupo de pesquisa já reportou sua alta frequência numa população paulistana. As alterações de significado clínico desconhecido foram encontradas em toda a extensão dos genes BRCA1 e BRCA2 e são inúmeras. Algumas apareceram em somente uma paciente, o que nos leva a pensar que talvez uma ou algumas destas mutações tenham algum efeito patogênico, como a mutação 6610insTT, que gera uma proteína incompleta e foi encontrada em três gerações de uma família. A técnica de MLPA não detectou grandes rearranjos em ambos os genes, mostrando que este tipo de alteração genética não é freqüente em nossa coorte e que talvez esta seja uma característica mais prevalente em populações menos miscigenadas. Salientamos, portanto, a importância de ampliar este estudo e de estimular pesquisas futuras, visando um aconselhamento genético eficiente, com a diminuição do número de casos inconclusivos gerados pelas variantes de significado indeterminado e o acompanhamento clínico das famílias / Introduction: Mutation in BRCA1 and BRCA2 genes are responsible for more than 50% of hereditarian breast and ovarian cancer cases. Nowadays, we still dont know the Brazilian mutation profile for these genes, except when founder mutations occur in specific ethnic groups. Objetives: Detection of mutation and polymorphisms in BRCA1 and BRCA2 genes in 73 breast cancer patients selected for genetic testing. Casuistic and methods: we have realized direct sequencing of BRCA1 and BRCA2 in 73 patients, whose 63 have had breast cancer and showed at least 10% of risk according to Frank, Evans and BRCAPRO, two patients with ovarian cancer and eight healthy individuals of strong family history of cancer linked to mutations in BRCA1 and BRCA2. Results: We have found 60 mutations in BRCA1: 13 missense mutations (including the deleterious R71G), seven synonymous mutations, one frameshift mutation (the deleterious 5382insC), one nonsense mutation (the deleterious R1751X), one in-frame deletion, one 3UTR mutation and 36 intronic variants. In BRCA2 we have found 57 mutations: 26 missense mutations, one 5UTR mutation, 11 synonymous mutations, 14 intronic variants, two nonsense mutations (the deleterious R2318X and R3128X) and three frameshift mutations (5844del5, 6610insTT and 6633del5). No mutation was detected by MLPA technique. Discussion and final considerations: Nine of 73 studied individuals carry deleterious mutations. Among them, the Ashkenazi founder mutation 5382insC has been found in two unrelated patients and it was previously reported by another research group for its high prevalence on a population from São Paulo. Alterations of unknown clinical significance have been found all over BRCA1 and BRCA2 gene extension and are countless. Some of them are shown only in one patient, leading us to think that maybe one or a few might have a pathogenic effect, like 6610insTT, which leads to a BRCA2 incomplete protein and was shown in 3 generations of a family. MLPA technique have not detected large genomic rearrangements in both genes, showing that this kind of mutation is not frequent on our cohort and maybe this genetic alteration characterizes less miscigenated populations. So, we emphasize the importance of enlarge this study and stimulate future researches, aiming an efficient genetic counseling, decreasing inconclusive cases generated by unknown clinical significance variants, and follow up of affected families

Orientador : Lilian Maria de Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T21:46:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_ArtemisSocorrodoNascimento_M.pdf: 19510658 bytes, checksum: d40ac317790d7af4a2cd94b9f87ced53 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O sistemaRh é o maior, mais complexo e mais imunogênico sistema de grupos sanguíneos.Representa um dos sistemas de maior interesse clínico, por seu envolvimento na Doença Hemolítica Peri-Natal; nas Reações Transfusionais Hemolíticas e nas Anemias Hemolíticas Auto-Imunes. Os antígenos do sistema Rh são codificados por 2 genes altamente homólogos, RHD e RHCE. As bases moleculares da maioria dos fenótipos Rh foram determinadas nos últimos 10 anos e rearranjos gênicos, deleções e mutações de ponto podem ser responsáveis por algumas variantes dos antígenos RhD e RhCE. A elucidação da base molecular das variantes Rh possibilitou o desenvolvimento de técnicas para a determinação de variantes que parecem ser predominantes em algumas populações. Desta forma, é possível estabelecer a correlação adequada entre os genótipos e os fenótipos e o esclarecimento da perda de expressão de alguns antígenos Rh comuns. A determinação da fteqüência das variantes Rh em populações distintas pode auxiliar na determinação de fenótipos raros que não são caracterizados sorologicamente Estudos envolvendo variantes Rh em pacientes falciformes politransfundidos, poderão em futuro próximo auxiliar no melhor entendimento da correlação entre o fenótipo e o genótipo e aumentar a segurança transfusional destes pacientes que muitas vezes desenvolvem anticorpos após transfusão de sangue. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The Rh blood group system is one of the most polymorphic and immunogenic systems known in humans. In the past decade, intense investigation has yielded considerable knowledge of the molecular background of this system. The genes encoding 2 distinct Rh proteins that carry C or c together with either E or e antigens, and the D antigen, have been cloned, and the molecular bases of many of the antigens and of the phenotypes have been determined. Gene rearrangements, deletions, or point mutations may cause partial D and CE antigens. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador : Laura Sterian Ward / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T05:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_GabrielaPaula_M.pdf: 963610 bytes, checksum: 2683bae31c2510f7a91e236ad7ab1c5b (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O câncer de pele não-melanocítico é o mais comum do mundo ocidental e sua incidência tem aumentado rapidamente, particularmente nos indivíduos claros, com pouca proteção da pigmentação. Análise de perda de heterozigozidade alélica na região 9p21-p22, onde se encontram os genes supressores tumorais CDKN2a/p16INK4a, p19ARF e p15INK4b, tem sido freqüentemente descrita em muitos tumores malignos, incluindo o melanoma familiar. Perdas e ganhos em outras regiões do cromossoma nove também têm sido freqüentemente observados e podem indicar mecanismos adicionais no processo de tumorigênese da célula basal. Usando DNA extraído de tecido tumoral e tecido normal correspondente, examinamos 13 lesões pré-malignas e 58 tumores cutâneos malignos. Os casos benignos e pré-malignos incluíram 4 de queratose solar, 3 de queratoacantoma, 3 de nevo melanocíticos, 2 doenças de bowen e 1 neurofibroma. Tumores de pele malignos incluíram 14 carcinomas espinocelulares, 40 carcinomas basocelulares e 4 melanomas. Foram usados 4 pares de primers para amplificar repetições de microssatélites no cromossomo 9. Identificamos 8 casos (20%) de desequilíbrio alélico entre os carcinomas basocelulares, sendo 2 casos de perda de heterozigozidade alélica e 6 casos de instabilidade microssatélite. Nenhum evento foi detectado nas lesões pré-malignas ou nos outros casos malignos. Essa dependência fenotípica sugere que exista uma grande distinção entre as duas mais importantes formas de cânceres de pele não-melanocítico na sua tendência de apresentar instabilidade microssatélite no cromossomo 9 no CBC / Abstract: Non-melanoma skin cancer is the most common malignancy in human beings, and the incidence continues to increase. Loss of heterozigozity analysis in the 9p21-p22 region, that harbors the CDKN2a/p16INK4a, p19ARF, and p15INK4b tumor suppressor genes, have been frequently described in a wide range of human malignancies, including familial melanomas. Also, losses and gains in other regions of chromosome 9 have been frequently observed and may indicate additional mechanisms in basal cell tumorigenesis. Using DNA extracted from tumor and matched normal tissues, we examined 13 premalignant and 58 malignant skin tumors. Benign cases included 4 solar keratosis, 3 keratoachantomas, 3 melanocitic nevi, 2 Bowen¿s disease and 1 neurofibroma. Malignant skin tumors included 14 squamous cell, 40 basal cell carcinomas and 4 melanomas. Using 4 sets of primers to amplify polymorphic microsatellite repeats on chromosome 9, we identified 8 cases (20%) of allelic imbalance among basal cell carcinomas, 2 cases of loss of heterozigozity and 6 cases of microsatellite instability. No events were detected among the premalignant or the other malignant cases. This phenotype-dependency suggest that there is a major distinction between the two most important forms of non-melanoma skin cancers in their tendency to present microsatellite instability in chromosome 9 / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador : Lilian Maria de Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T06:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BaleottiJunior_Wilson_M.pdf: 6907784 bytes, checksum: 324eddb7fcb054026e1642e61315fd3e (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O sistema de grupo sanguíneo Diego é constituído por 21 antígenos localizados na glicoproteína banda 3 da membrana eritrocitária. Compreende 4 antígenos antitéticos Dia/Dib e Wra/Wrb e 17 antígenos de baixa incidência populacional. O fenótipo Dia resulta de uma mutação de ponto no nucleotídeo 2561 (T>C) que leva à substituição do aminoácid6 Prolina (Dib) para Leucina (Dia) na posição 854. O antígeno Dib é um antígeno de alta incidência na população geral, enquanto que o antígeno Dia é de baixa incidência em caucasianos, mas pode ser comum entre índios e japoneses. A mutação 166A>G no gene SLC4A1 (AE 1) que codifica a banda 3 dá origem a uma proteína variante, chamada banda 3-Memphis. Podem ser distinguidos dois tipos de banda 3 Memphis: variantes 1 e 11. A banda 3 Memphis II está associada a presença do antígeno Dia e apresenta maior afinidade de reação covalente com o H2DIDS do que a Memphis 1 e a banda 3 normal. De acordo com a literatura, o antígeno Dia está sempre associado a presença da banda 3-Memphis, caracterizando a variante Memphis 11. Entretanto, nenhum estudo de freqüência dos alelos DI A e 166G foi realizado até o momento. Com a finalidade de determinar a freqüência dos alelos DI A/DI B e da mutação 166A>G na população brasileira por métodos moleculares, estudamos 318 amostras de DNA de 4 diferentes populações (93 doadores voluntários de sangue, 71 descendentes de japoneses, 84 descendentes de africanos e 70 índios da tribo dos Parakanãs).Nossos resultados demonstraram que existe forte associação entre os alelos DI A e 166G e que o alelo DI A pode também ocorrer sem o alelo 166G. Em nosso trabalho foram identificadas 4 formas alélicas da associação DI / Memphis na população brasileira: alelo DI A 1 66A, DI A 1 66G, DI B166A e DI B166G . Os resultados da genotipagem 166A/G demonstraram que a banda 3-Memphis é um polimorfismo comum entre as populações estudadas. Devido a alta freqüência da mutação 166A>G encontrada, o alelo 166G pode ser considerado como um bom marcador genético de populações não miscigenadas e que o alelo 166G pode também ser considerado um protótipo do gene SLC4A1. Além disso, considerando a importância clínica dos antígenos Dia e Dib, a possibilidade em determinar os genótipos DI A/DI B, poderá contribuir substancialmente na segurança transfusional e materno-fetal / Abstract: The Diego blood group system consists of21 antigens located on band 3 of the red blood cell membrane. It includes the 4 antithetical antigens Dia / Dib and Wra / Wrb, and 17 low incidence antigens. The Dia phenotype results from a point mutation at nucleotide 2561 (T>C) leading to a single amino acid substitution from Leu (Dia) to Pro (Dib) in position 854. Dib is a high incidence antigen while Dia has low incidence among Caucasians but is particularly common among American Indians and Japanese. The Memphis variants of band 3 result from a point mutation 166 A>G in SLC4Al leading to an amino acid substitution (56 Lys>Glu). There appears to be a strong association of Memphis (56Glu) with Dia (854Leu) among Native Americans. The initial aim of this study was to determine the frequency of Diego (DI A/DI B) and Memphis (166A>G) mutations in the Brazilian population. We studied samples from 70 Amazonian Indians, 71 individuals of Japanese descent, 93 regular blood donors and 84 Sickle Cell Disease patients by PCR-RFLP. PCR assays were designed to amplify a sequence of 149 bp from exon 18 (DI A/DI B alleles), and of 84 bp from exon 3 SLC4Algene that determine band 3-Memphis. Al1eles were identified by digestion of amplified products with the restriction enzymes Msp I to discriminate DI A from DI B in exon 18, and Mnl I to identify band 3-Memphis in exon 3. Both the DI A allele and band 3-Memphis had high gene frequency among Amazonian Indians (0.571 and 0,543, respectively). Unexpectedly, four Amazonian Indians had the DI A allele without the band-3 Memphis mutation / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Laura Sterian Ward / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:22:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_MarciaReginaMessaggiGomes_M.pdf: 3529772 bytes, checksum: b04313ec6622e2cc1a2afe5efd67d027 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A obesidade é uma doença considerada como uma epidemia mundial. Apresenta altas taxas de morbidade e mortalidade associadas a várias causas diretas, como hipertrofia cardíaca, arritmias e aumento do débito cardíaco, além de estar intimamente associada à hipertensão arterial e ao diabetes mellitus. É vista como uma doença poligênica e multifatorial, e um número crescente de mutações e polimorfismos gênicos populacionais vem sendo a ela associados. o gene do Receptor Ativado Proliferador de Peroxisomo Gama (PP ARy), um fator de transcrição implicado na diferenciação do adipócito e no metabolismo de lipídeos e glicose, está claramente envolvido na regulação do metabolismo do tecido adiposo em seres humanos. Ristow et ai descreveram uma mutação Pro115Gln no PPARy2 restrita a indivíduos com obesidade mórbida e que aceleraria a diferenciação do adipócito, podendo ser, portanto, um fator causal da obesidade. Também se sabe que a resistência à insulina induzi da pela deficiência do receptor de insulina de tipo 1 (IRS-l) conduz a um aumento da pressão arterial e dos níveis plasmáticos de triglicérides. Um polimorfismo no gene do IRS-l, com substituição de glicina (GGG) por arginina (AGG) no códon 972, foi implicado na resistência à insulina. o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação da obesidade e dos distúrbios metabólicos a ela relacionados com mutações e/ou polimorfismos para os genes IRS-l e PPARy2. Para tanto, estudamos 67 indivíduos eutróficos, 37 obesos moderados e 27 obesos mórbidos, totalizando 40 homens e 91 mulheres, de 18 a 67 anos ( 29,2 :t 1,7 anos de idade para o sexo masculino e 32,9 :!: 1,2 anos de idade para o sexo feminino). Foram analisados Parâmetros antropométricos, hemodinâmicos, bioquímicos, bioimpedanciometria (BIA), calorimetria indireta e o índice HOMA-IR para avaliação de resistência insulínica. O estudo genético foi realizado através da pesquisa de mutações em DNA extraído de sangue periférico de todos os casos, usando-se PCR-restrição enzimática. Os indivíduos obesos possuíam maiores níveis de pressão arterial diastólica e sistólica (p<O,OOl), além de freqüência cardíaca mais elevada do que os eutróficos (p=O,003). Também apresentavam níveis mais elevados de colesterol total e triglicérides (p=O,Ol, p<O,03, respectivamente) do que os eutróficos, assim como de ácido úrico (p<O,OOOl). A análise genética mostrou que apenas 5 (3,8 %) indivíduos possuíam a mutação no gene PPARy2, todos homozigotos, enquanto que polimorfismo do gene IRS-I foi encontrado em 12 (9,1 %) casos em heterozigose. Não houve correlação entre o perfil genético e nenhum dos parâmetros antropométricos, hemodinâmicos, bioquímicos ou indicadores de resistência insulínica medidos / Abstract: Obesity is a complex, multifactorial disease that develops from the interaction between genotype and environment. It may be defined as a syndrome characterized by an increase in body fat storage and its prevalence has increased dramatically in industrialized and developing nations. There are several reasons for medical concern regarding overweight and obesity. It increases the risk for several diseases, especially cardiovascular diseases, type 2 Diabetes Mellitus and hypertension. The Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR)-y is a transcription factor that belongs to the same family of nuclear receptors as steroid and thyroid hormone receptors. PP AR-y is a nuclear ligand-dependent transcription factor that promotes adipocyte differentiation and influences insulin sensitivity. A number of genetic variants in the PPARy gene have been identified. These include a very rare gain-of-function mutation (proI15Gln) that was associated by Ristow et al with obesity. The Insulin Receptor Substrate -1 (IRS-l) functions as a key proximal signaling molecule for both insulin receptor and insulin-like growth factor-l receptor signaling pathways. IRS-l is the principal substrate for insulin and insulin-like growth factor-l (IGF-1) receptors; it is present throughout tissues that are insulin sensitive, including sites responsible for glucose production, glucose clearance, and pancreatic j3-cells. A Gly~Arg substitution at codon 972 of IRS-l has been described as associated with obesity, particularly visceral obesity, with which insulin resistance is predominantly associated. The purpose of this study was to evaluate the presence of IRS-l G972R and PP ARy2 Pro 115Gln mutations in the Brazilian population. Sixty-seven lean and 64 obese/severely obese subjects (91women (32.9 i: 1.2 y) and 40 men (29.2 i: 1.7y) between 18 and 67 years of age) participated in the study. BM], waist circumference, fat mass (electrical bioimpedance), indirect calorimetry, blood pressure, fasting plasma glucose and insulin, serum uric acid, plasma lipids and HOMA-IR were evaluated. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes and amplified by polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzyme digestion. Men presented larger waist circumference and larger waist-hip ratio than women (p=0.04 and p= 0.0001, respectively). Women presented larger fat percentage and lesser lean mass percentage in comparison with men (p< 0.0001). In relation to biochemical parameters, the female sex presented larger HDL-cholesterol values (p=0.03) and the male sex, a larger value for uric acid (p<O.OOOl). Obese subjects had larger levels ofdiastolic and systolic arterial pressure (p<O,OOI), in addition to more elevated cardiac frequency than lean subjects (p=0.003). They also presented more elevated levels of total cholesterol and triglyceride (p= 0.01, p<0.03, respectively), as well as uric acid, than thin subjects (p<O.OOOl). Genetic analysis showed that only 5 (3.8 %) individuals presented mutation in the PPARy2 gene, all of them homozygote, whereas polymorphism of the IRS-l gene was found in 12 (9.1 %) cases of heterozygosis. There was no correlation between the genetic profile and any of the anthropometric, hemodynamic and biochemical parameters or measured indicators of insulin resistance / Mestrado / Mestre em Farmacologia

The work in this thesis describes the isolation and characterisation of the mouse surfactant protein D (SP-D) gene (Sftpd). This gene has been show to span 8 exons across 14 kb of DNA sequence and displays an overall organisation similar to the other collectin genes. The complete 5' untranslated region of the mRNA was also cloned which allowed the identification of the transcription start site for SP-D. Subsequently, the analysis of the promoter region of Sftpd revealed positional conservation of a number of transcription factor binding sites between the murine and human SP-D genes and the bovine conglutinin gene. A single copy SP-D-like gene has been shown to be present in mammals, birds and amphibians. Three polymorphic microsatellites were identified for the SP-D gene. In addition, the murine genes for surfactant protein A, SP-D and mannose binding lectin (MBL-A) were shown to co-segregate within a 5.64 cM area on chromosome 14. PCR cloning identified the presence of a CL-43-like gene in sheep, this represent the second member of the bovidea to contain CL-43. Specific antibodies were raised against mouse SP-A and SP-D by cDNA cloning fragments of these molecules and using them for protein expression. The complete cDNA sequence of the porcine cDNA was cloned. Three unique features were revealed in comparison to SP-D from other species. The collagen region contains an extra cysteine residue, which may have important structural consequences. Two other differences lie within loop regions of the carbohydrate recognition domain, a potential glycosylation site and an insertion of three amino acids, which may have functional implications by influencing carbohydrate binding. The porcine genes for SP-D and SP-A were also shown to co-localise to porcine chromosome 14, which is syntenic with murine chromosome 14. A novel and rapid PCR restriction fragment length polymorphism method was developed to exploit the murine expressed sequence tag (EST) database. This technique circumvents the laborious cDNA or genomic cloning steps of other mapping methods by relying on EST data and the prediction of exon-intron boundaries. This approach revealed that the C3a receptor, C1r and C1s genes form an unexpected complement gene cluster while the second MBL associated serine protease gene does not co-segregate with other complement activating serine protease genes. The gene localisations performed here help to explain the evolution of this group of proteins. This method can easily be applied to the genes of other systems, ranging from the interests of the individual researcher to large scale gene localisation projects.

The recently identified DREAM complex assembles when Rb-like protein (p130, p107) recruits E2F4, DP (dimerization partner) and MuvB (multivulval complex B (Lin9, Lin37, Lin52, Lin54, and RbBp4)) during G0 and quiescence to repress cell cycle-dependent genes. DREAM assembly requires phosphorylation of the MuvB subunit Lin52 mediated by Dyrk1a, a kinase that has been linked to Down syndrome and neurodegenerative diseases. Our lab previously demonstrated an essential role for the Rb-like pocket proteins in the regulation of neural precursor population and that E2F4 is also involved in the regulation of the expression of the pluripotent gene Sox2. Here, we performed in utero electroporation experiments to overexpress the DREAM complex components and assess their roles during neurogenesis. Our results showed that the overexpression of DREAM components (Lin52 and p130) and Dyrk1a promotes commitment to differentiation at the expense of self-renewal. We also showed that Dyrk1a requires p130 or p107 to regulate neurogenesis. Furthermore, using harmine treatment which is an inhibitor of Dyrk1a the kinase that induces DREAM assembly, our results revealed that DREAM regulates the expression of self-renewal markers affecting the cell fate decision. Performing ChIP experiments, we detected a binding enrichment of the DREAM components on the promoters of not only classical cell cycle genes but on the self-renewal genes like Sox2 and EZH2. Taken together, our study confirmed that DREAM complex plays an important role in the cell fate determination during the regulation of neurogenesis through the control of the self-renewal genes.

Following previous studies, Asparagus officinalis single cell suspensions were hypothesized to be a rich source of wound-inducible mRNAs. A previously isolated clone, DDl-34, was shown to hybridize to wound-inducible transcript. This sequence was used to isolate the AoPR1 (Asparagus officinalis Pathogenesis Related cDNA clone 1). Data from the isolation and analysis of genomic clones hybridizing to DDl-34 probe suggested that these clones were unlikely to contain the upstream regulatory sequences of the AoPR1 gene and that the genomic arrangement of these sequences is complex. Inverse polymerase chain reactions (IPCR) were used to amplify AoPR1 genic sequences directly from the asparagus genome. Two products were cloned and sequenced, demonstrating that the correct sequences, upstream and downstream of the primers, had been amplified. The downstream IPCR product's sequence overlaps with AoPR1 coding sequence and contains an intron sequence. The upstream IPCR product partially overlaps with the start of AoPR1 coding sequence and was successfully used in transcript mapping experiments. Translational fusions were constructed between this fragment and the -glucuronidase (gus) reporter gene. GUS analysis demonstrated that this fragment, containing the AoPR1 promoter, was sufficient to drive wound-inducible transcription in transgenic tobacco. A smaller upstream fragment was insufficient to drive wound-inducible transcription. GUS expression was also detectable in tissues such as the xylem parenchyma, mature pollen and coloured regions of the petal. AoPR1-gus transgene expression correlates with the spatial expression patterns of phenylpropanoid biosynthesis pathway genes. The nature of the fusion suggested that the AoPR1 protein is intracellular. This is the first example of the cloning and analysis of a monocotyledon gene belonging to the 'intracellular pathogenesis related protein' class. The analysis and application of AoPR1 sequences are discussed.

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