A dissertation submitted to Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, in fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science in Medicine Johannesburg, June 2016 / Human Leukocyte Antigen (HLA) class I (HLA-I)-restricted CD8+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses are major drivers of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) evolution, resulting in the selection of CTL escape mutants. This is particularly well described for HIV-1 proteins such as Gag, Pol and Nef. For the accessory proteins Vif, Vpr and Vpu though, it is still not clear to what extent HLA-I-mediated responses influence their evolution. Moreover, preliminary data from our laboratory showed that Vpu was the most targeted of the accessory proteins with regards to CD8+ CTL and natural killer (NK) cell responses in a long term non progressor/elite controller cohort. Thus, the overall aims of the study were to describe immune escape in Vif, Vpr and Vpu epitopes from HIV-1 infected patients in South Africa, and to clone, express and purify recombinant Vpu for the ultimate detection of anti-Vpu antibodies in South African patient sera. Longitudinal plasma samples were available for 25 patients from two cohorts (18 from Lung and seven from M002). Viral RNA was extracted and the vif, vpr and vpu regions were RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) amplified and sequenced. HLA-A, B and C data for Lung cohort individuals were available, thus the HLA-A, B and C alleles were typed and assigned for the M002 cohort individuals. The Vif, Vpr and Vpu amino acid sequences were subsequently extensively analysed for HLA-driven CTL escape mutations. Lastly, three vpu sequences, Cons. C, 05ZAFV05 and 05ZAFV15 were selected for codon-optimization (humanized), each cloned into the pcDNA3.1/V5-His mammalian expression vector, and used to optimize expression of recombinant Vpu proteins in HEK 293T cells. The HEK 293T cells were harvested and the Vpu was purified using standard nickel affinity chromatography procedures. Protein expression and purification was monitored by SDS-PAGE, Western blot and dot blot analyses. Overall, longitudinal sequences were obtained from Vif, Vpr and Vpu from eight of the 18 patients in the Lung cohort and all seven patients in the M002 cohort. Of these, HLA-driven immune escape mutations were detected in four patients from the Lung cohort and six from the M002 cohort. Interestingly, for the M002 cohort, some reversions to the baseline sequences were noted over time. None of the identified escape mutations are amongst the best described and most optimal HIV-1 CD8+ CTL epitopes of HIV-1 accessory proteins in the HIV-1 databases. Eight and eleven HLA alleles contributed to immune escape in the Lung and M002 cohort Vif, Vpr and/or Vpu sequences, respectively. Overall, HLA-driven immune pressure in the Vif, Vpr and/or Vpu motifs described here may have contributed to the changes in viral loads seen in these patients over time, and likely impacted iii on disease progression, albeit in combination with escape mutations in the more highly targeted HIV-1 proteins, such as Gag, Pol and Nef. Future work looking at longitudinal sequence analysis of the entire HIV-1 proteome in these patients will likely reveal the contributing factors leading to immune escape and ultimately impact disease progression to AIDS. Expression of all three recombinant Vpu proteins in HEK 293T cells was successfully optimized however, as evidenced by SDS-PAGE, Western blot and dot blot analyses, the expression and purification protocol used in this study did not provide sufficient protein yields, nor an optimally purified protein for use in the downstream assays required. Future work will focus on optimization of Vpu expression and purification protocols to aid in the detailed elucidation of the role of Vpu and anti-Vpu immune responses in control of HIV-1 infection. / MT2016

A artrite reumatoide (AR) é uma doença crônica autoimune que afeta as articulações e causa uma persistente inflamação sinovial e destruição da cartilagem e osso. A artrite induzida por pristane (PIA) em camundongos é um modelo experimental utilizado em muitos trabalhos, pois se assemelha à artrite reumatoide. MicroRNAs (miRNA) têm sido bastante estudados por sua participação no desenvolvimento da artrite. As linhagens de camundongos AIRmax e AIRmin, diferem quanto a susceptibilidade/resistência à PIA. Nós analisamos o perfil de expressão gênica de mRNA e miRNAs das células peritneais dessas linhagens e avaliamos sua participação no desenvolvimento da PIA. A linhagem AIRmax mostrou uma maior modulação de genes (2025) com relação aos AIRmin (1043) no início dos sintomas. Os miRNAs 132-3p/212-3p e 130b-3p foram, os miRNAs mais significativamente modulados nos animais sensíveis e mostraram correlações negativas com alguns de seus genes alvos preditos. Nosso estudo mostrou que a expressão de mRNAs e miRNAs é modificada nas linhagens AIRmax e AIRmin durante a PIA. / Rheumatoid arthritis is a chronic autoimmune disease that affects joints and it is characterized by synovial inflammation and articular cartilage and bone destruction. Pristane-induced arthritis (PIA) in mice is an experimental model that has been used in many studies, since it resembles rheumatoid arthritis. MiRNAs has been extensively studied in the development of arthritis. AIRmax and AIRmin lines, differ in their susceptibility/resistance to PIA. We analyzed the miRNA and gene expression profile of mRNA in peritoneal cells of these lines in order to evaluate their involvement in PIA development. AIRmax mice showed a high gene modulation (2025) than AIRmin mice (1043) at the onset of disease symptoms. The 132-3p/212-3p and 130b-3p miRNAs were the most significant in susceptible animals showing negative correlations with some of their predicted target genes. Our study showed that the global gene and miRNA expressions are modified in the peritoneal cells of AIRmax and AIRmin lines during pristane-induced arthritis.

O ritmo diário de atividade é uma característica de todos os organismos vivos, que tem a capacidade de se orientar no tempo e no espaço, e distinguir entre tempo linear e tempo cíclico. O ciclo claro:escuro é um importante indicador circadiano para todos os organismos. O trabalho do relógio circadiano envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa dos genes CLOCK e BMAL1 (brain and muscle Arnt-like protein 1) que formam um heterodímero, funcionando como fator de transcrição para a expressão dos genes per (period), cry (cryptochrome) e o receptor órfão REV-ERB. Em geral, o ciclo circadiano tem início nas primeiras horas da manhã com a ativação da transcrição de per e cry por CLOCK/BMAL1. A periodicidade do relógio circadiano resulta da combinação entre retroalimentação transcricional positiva e negativa destes genes. Hoje já se sabe que os vertebrados, além do relógio central (NSQ) possuem vários relógios, distribuídos pelo corpo, os chamados relógios periféricos. A resposta ao estímulo luminoso é resultado da interpretação da informação luminosa por diferentes tipos celulares. A molécula fotorreceptora de melanóforos dérmicos embrionários de X. laevis foi denominada melanopsina (Opn4/Opn4). Neste anfíbio, cones e bastonetes, continuam a exibir ritmo circadiano em cultura durante vários dias, e a sua capacidade de se ajustar pelo estímulo luminoso indica a presença do sistema circadiano. Os objetivos deste projeto foram: verificar qual é o padrão de expressão para Opn4, per1, per2, bmal1 e clock em melanóforos de X. laevis submetidos a diferentes fotofases; verificar se a expressão para Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock nos melanóforos de X. laevis é modulada pela melatonina. Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock Dados obtidos no presente estudo demonstram que nesta linhagem celular estes genes apresentam um padrão de expressão aparentemente rítmico, quando estas células são expostas a um ciclo claro:escuro (14C:10E), que difere do padrão obtido quando mantidas em regime de escuro constante. Em geral, estas células mantidas em escuro constante durante 5 dias tendem a apresentar aumento de expressão de RNAm para estes genes e, quando mantidas em escuro constante também durante 5 dias, mas com adição de melatonina por 1h, 24 h antes de sua extração, estes níveis de RNAm tendem a diminuir. Porém, quando comparamos as três situações, podemos observar que a adição da melatonina restaura, em geral, o padrão de expressão dos genes analisados em 14C:10E. O conjunto de resultados, que obtivemos em melanóforos dérmicos de Xenopus laevis, sugere que esta linhagem celular possue características de relógio periférico. / The daily rhythm of activity is a characteristic of all living organisms, which have the ability of to behave accordingly time and space, and distinguish between linear and cyclic time. The dark:light cycle is an important time cue for all organisms. The work of circadian clock involves mechanisms of positive and negative feedback of CLOCK and BMAL1 which as a heterodimer act as a transcription factor for the expression of per (period), cry (cryptochrome) and the orphan receptor REV-ERB. A typical circadian cycle begins in the first hours of daytime, which the activation of the transcription of per and cry by CLOCK/BMAL1. It is well known that the vertebrates, besides the central clock (SCN), have several other clocks distributed by the body, the so called peripheric clock. The responses to light are the result of the interpretation of light signal by several cell types The photoreceptor molecule in the dermal melanophores of X. laevis was denominated melanopsin (Opn4/Opn4). In this amphibian, rods and cones maintain circadian rhythm during several days in culture, and their ability to synchronize by light suggest the presence of a circadian system. The objectives of this project were: verify the expression pattern for Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock in dermal melanophores of X. laevis, under different photo phases; and verify whether the expression for Opn4, per1, per2, bmal1 and clock were modulated by melatonin. Our data show that these genes have a rhythmic pattern expression, when these cells are under a 14L:10D, which is different from the pattern exhibited in constant dark. In general, these cells in constant dark have a higher mRNA expression, and in the same condition, but with melatonin applied for 1h, 24h before the data collect, these mRNA levels are lower. However, when we compared these three different experimental conditions, we observed that melatonin resets, in overall, the expression pattern of 14L:10D. These data, taken together, suggest that Xenous laevis dermal melanophores have characteristics of a peripheric clock.

Salmonella do grupo paratifóide é responsável por toxi-infecção alimentar no homem, veiculada por alimentos contaminados. Este estudo determinou o perfil genotípico de nove amostras de S. Typhimurium, a sua patogenicidade, assim como sua capacidade de colonização e invasão em aves SPF. Verificou-se pela análise dos genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP ou spvC em amostras de Salmonella Typhimurium que todas foram negativas para os genes sopE1 ou spvC. O gene cdtB estava presente em apenas uma amostra (11,11%) e o gene pefA em duas amostras (22,22%). O gene sefC foi encontrado em três amostras (33,33%). Em oito amostras (88,88%) os genes agfA, fimA, lpfC ou sptP estiveram presentes. Os genes avrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC ou slyA ou sopB estiveram presentes em 100% das amostras analisadas. Determinou-se quatro perfis genotípicos. No ensaio de patogenicidade observou-se que as amostras inoculadas por via oral, não causaram mortalidade de pintinhos SPF de um dia de idade, com a exceção da amostra SA 633 e SA 006 que apresentaram 30 e 10%, respectivamente. No entanto, observou-se que a infecção por via subcutânea provocou uma maior mortalidade de pintinhos, sendo que as amostras SA 003, SA 004, SA 005 e a amostra vacinal mostraram somente 10% de mortalidade, a amostra SA 002 30%, as amostras SA 632 e SA 634 70% e a amostra SA 633 100%. A amostra SA 006 não provocou nenhuma mortalidade. A amostra mais patogênica pela via subcutânea foi a SA 633. O ensaio de colonização foi realizado em pintinhos SPF, com as amostras SA 002, SA 003, SA 004, SA 005, SA 006, SA 632, SA 633, SA 634 e amostra vacinal. Verificou-se ausência de invasão no fígado e baço 24 horas pós- infecção, exceto para as amostras SA 632 (30%) e amostra vacinal (20%). Após sete dias da infecção houve invasão em dois pintinhos com a amostra SA 002 e um pintinho com as amostras SA 004 e SA 005. Apenas na amostra SA 632 constatou-se colonização em ceco após 24 horas em 10% das amostras e após 7 dias em 70% pós-infecção. Concluiu-se que entre as amostras de Salmonella Typhimurium analisadas existiam diferentes perfis genotípicos baseando-se na presença ou ausência de genes de virulência, e que a amostra vacinal assemelha-se a amostras de S. Typhimurium estudadas quanto a presença dos genes. Os resultados do teste de patogenicidade das amostras de ST indicaram que a via de inoculação modifica a patogenicidade de uma mesma amostra e que a mortalidade após a inoculação pela via subcutânea é sempre superior que pela via oral. / Parathyphoid Salmonella are major food-borne pathogens spread by contaminated food products. This study determined the genotypic profile of nine samples of S. Typhimurium, pathogenicity, colonization and invasion in SPF chicks. It was found by analysis of genes: agfA, avrA, cdtB, fimA, fliC, invA, iroN, lpfC, mgtC, pefA, sefC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA, sopB, sopE1, sptP or spvC samples of S. Typhimurium all were negative to sopE1 or spvC. The cdtB gene was identified in one sample and pefA gene in two samples (22,22%). Sef C gene was detected in three samples (33,33%). In eight samples (88,88%) agfA, fimA, lpf or sptP were detected. AvrA, fliC, invA, iroN, mgtC, sifA, sipB, sipC, sitC, slyA and sopB were detected in all samples evaluated. Four genotypic profiles were established. Pathogenicity tests showed that samplesinoculated by oral gavage did not present mortality in one day old SPF chicks, except samples SA 633 and SA006 with 30 and 10%, respectively. However, it was observed that subcutaneous inoculation showed high mortality in SPF chicks than oral inoculation, and samples SA 003, SA004, SA005 and vaccinal strain showed 10% of mortality, 30% for sample SA002, 70% in the samples SA632 and SA 634 and 100% when the sample SA 633 was inoculated. No mortality was observed in sample SA006. Colonization test was performed in SPF chicks using the samples: SA002, SA 003, SA 004, SA005, SA006, SA 632, SA 633, SA 634 and vaccinal strain. The more pathogenic strain subcutaneously was the SA 633. There was not invasion in liver and spleen 24 hours p.i., except for sample SA 632 (30%) and vaccinal strain (20%). Seven days p.i. invasion was detected in two chicks inoculated with samples identified as SA 004 and SA 005. Sample SA 632 showed 10% of cecal colonization 24 hours p.i. and 70% after one week p.i. It was concluded that Salmonella Typhimurium strains including the vaccinal strain, showed different genotypical profiles, based on the presence or absence of genes of virulence genes. The results of the pathogenicity test indicated that inoculation route modify the pathogenicity of the same strain, and the mortality post-inoculation was always higher in chicks inoculated by subcutaneous route when compared to the oral route.

A leishmaniose é causada por protozoários do gênero Leishmania e no Brasil, as principais espécies causadoras da leishmaniose cutânea são Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) amazonenses. O tratamento da leishmaniose apresenta diversas dificuldades, portanto é fundamental a descoberta de novos fármacos ativos, podendo ser detectada em células cultivadas in vitro e também em animais íntegros, através da técnica de bioimageamento. Neste trabalho, propusemo-nos a produzir linhagens de L. (V.) braziliensis e L. (L) amazonenses expressoras de luciferase e caracterizar o comportamento das linhagens mutantes em testes de sensibilidade a fármacos e de infecção in vitro e in vivo. Foi confirmada a emissão de luz pelas linhagens mutantes das duas espécies de Leishmania, em promastigotas e amastigotas. O comportamento das linhagens mutantes obtidas em relação a curvas de crescimento, sensibilidade aos fármacos tamoxifeno e anfoterina B em promastigotas, perfil de infectividade e sobrevivência em macrófagos e sensibilidade de amastigotas à anfotericina B foi comparado ao comportamento das linhagens parentais, não sendo observadas diferenças significativas. Camundongos BALB/c infectados com a linhagem expressora de luciferase de L. (L.) amazonenses desenvolveram lesões comparáveis aos animais infectados com a cepa selvagem, sendo possível quantificar a carga parasitária nesses animais por bioimageamento. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que os parasitas mutantes expressores de luciferase obtidos podem ser utilizados em testes de sensibilidade a fármacos tanto in vitro como in vivo, representando um avanço metodológico nessa área de pesquisa. / Leishmaniasis is caused by protozoan parasites in Brazil, the main causative species of cutaneous leishmaniasis are Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonenses. The treatment of leishmaniasis presents several difficulties, and the discovery of new active drugs for the treatment of leishmaniasis is therefore fundamental. The enzyme luciferase is a reporter widely used in screening tests for new drugs. This enzyme catalyzes the oxidation of luciferase in the presence of ATP emitting light that can be detected in cultured cells in vitro as well as in intact animals, using the technique of bioimaging. In this work, we sought to produce strains of L. (V.) braziliensis and L. (L) amazonenses expressing luciferase and characterize the behavior of these mutant strains in drug susceptibility tests and in in vitro and in vivo infections. Production of light was detected in mutants of both species, in all life cycle stages. Mutant strains were compared to their corresponding parental lines as to their growth pattern, infectivity and survival profile in macrophages and sensitivity to amphotericin B and tamoxifen. No significant differences were observed for these parameters. BALB/c mice infected with the luciferase expressing line of L. (L.) amazonenses developed lesions comparable to those in animals infected with the wild-type strain. The parasite load in these animals was quantified through bioimaging. The results obtained of this study indicate that the mutant parasites expressing luciferase can be used for drug susceptibility testing in vitro and in vivo, representing a methodological advance in this area of research.

Os genes HLA (Antígenos leucocitários humanos) estão localizados no Complexo Principal de Histocompatibilidade humano (o MHC), e possuem os maiores níveis de variação do genoma, com milhares de alelos, altas taxas de heterozigose e diversidade nucleotídica. No presente estudo, nosso objetivo foi a identificação dos principais alvos da seleção natural nos genes HLA. Para isso, propusemos duas abordagens que resultaram na redação de dois manuscritos. Na primeira abordagem, nós testamos a hipótese de que os principais alvos da atuação da seleção natural nas moléculas HLA seriam os aminoácidos que compões os sítios que ancoram os peptídeos antigênicos (os bolsões B e F da região de ligação de peptídeos (PBR)). Para isso, utilizamos um conjunto de dados de 6.435 e 6.409 indivíduos genotipados para os genes HLA-A e -B respectivamente, gerados para o 13º Workshop Internacional de Histocompatibilidade (IHW) e pertencentes a 55 populações espalhadas por todos os continentes. Nós estimamos a diversidade nucleotídica (&PI;) das sequências que codificam para os bolsões B e F e comparamos esses dados com os obtidos de outros bolsões da PBR. Concomitantemente, utilizamos a classificação de alelos dos locos HLA-A e -B em supertipos, que são agrupamentos alélicos com similaridades nos perfis de ligação de peptídeos, devido a semelhanças em aminoácidos específicos dos bolsões B e F. Nós descrevemos os padrões observados de variação dos supertipos e desenvolvemos um teste de hipótese onde comparamos os estimadores observados de diferenciação populacional (Gst) e diversidade genética (taxa de heterozigose (He) e número de alelos (k)) com os obtidos a partir de 10.000 réplicas constituídas por agrupamentos aleatórios de alelos. O bolsão B foi a região que apresentou os maiores níveis de diversidade no gene HLA-B (p <0,00001, teste de soma de ranques de Mann-Whitney) e boa parte de sua variação está estruturada entre os supertipos desse mesmo loco. Além disso, os padrões observados de variação nos supertipos de HLA-B não foram reproduzidos pelos agrupamentos aleatórios de alelos (com 98 % das simulações apresentando valores de Gst menores do que os observados, utilizando as amostras africanas, europeias e asiáticas). Esse resultado indicou que os supertipos e consequentemente as especificidades do bolsão B estão significativamente estruturas entre as populações, um indicativo de adaptações locais aos patógenos específicos de diferentes regiões geográficas. Esses mesmos padrões não foram reproduzidos na análise do loco HLA-A, pois boa parte da variação no PBR desse gene não está localizada nos bolsões B e F. Além disso, as simulações envolvendo os supertipos de HLA-A reproduziram mais frequentemente os padrões observados de variação, indicando que os bolsões B e F não são os principais alvos da seleção nesse gene, ou que os níveis de seleção em HLA-A sejam menores dos atuantes em HLA-B. Na segunda abordagem, o nosso principal objetivo foi a identificação de genes que contribuíram para a adaptação local das populações nativas das Américas, que teria ocorrido durante o recente processo de colonização desse continente. Nós sequenciamos os exons 2 e 3 dos loci de classe I HLA-B e -C e o exon 2 do loco de classe II -DRB1 em 635, 524 e 568 indivíduos, respectivamente, pertencentes a 32 populações nativas do continente Americano. Os dados de sequência foram utilizados na estimativa das frequências alélicas, taxa de heterozigose (He), grau de compartilhamento de alelos entre populações (medido pela distância de Prevosti) e desvios de neutralidade utilizando o teste D de Tajima. Nós também comparamos os padrões de variação das taxas de heterozigose obtidas a partir dos loci HLA ao longo do continente com os obtidos a partir de um conjunto de 61 microssatélites espalhados ao longo do genoma, permitindo-nos a diferenciação dos padrões provavelmente gerados pela história demográfica ou seleção natural. O loco HLA-B apresentou o maior número de pares de populações em que não observamos compartilhamento de alelos (44 pares contra 4 e 6 para os loci HLA-C e -DRB1, respectivamente) sendo que a região leste da América do Sul (SAE) foi a que apresentou os menores níveis de compartilhamento de alelos com outras regiões das Américas (39 dos 44 pares de populações continham uma população SAE). Essa maior diferenciação do gene HLA-B nas populações SAE é uma consequência da presença de alelos exclusivos dessa região, originados por eventos de conversão genica e/ou recombinação envolvendo alelos presentes em outras regiões do continente. As populações SAE também apresentaram níveis elevados de variação para o gene HLA-B, resultado evidenciado pela falta de correlação entre a diminuição da taxa de heterozigose e o aumento da distância em relação ao Estreito de Bering (r2 = -0,1117, p > 0,05), o que contrasta com a tendência geral observada nos microssatélites e genes HLA -C e -DRB1 (r2 = -0,1957, -0,2261 e -0,2637, respectivamente (p < 0,05)). Finalizando, as populações SAE apresentaram valores de D de Tajima maiores (p <0,001, teste de soma de ranques de Mann-Whitney) e mais significativos (p < 0,0000005, aplicando um teste binomial exato) no loco HLA-B, quando comparadas às populações das outras regiões. Essas diferenças entre regiões geográficas não foram observadas nos genes HLA-C e -DRB1, corroborando a explicação seletiva para o aumento da frequência dos alelos de HLA-B originados por conversão gênica/recombinação em resposta aos novos desafios ambientais das regiões tropicais na América do Sul. As conclusões obtidas a partir de ambas as abordagens do presente trabalho apontam o gene HLA-B como o principal alvo da seleção natural, uma vez que esse loco concentra as maiores evidências de atuação de seleção natural recente quando comparado aos demais genes HLA analisados. Nós também demonstramos com as análises intragênicas que o bolsão B do PBR de HLA-B concentra por boa parte das diferenças observadas entre as populações, implicando em diferenças nos perfis de apresentação de peptídeos entre essas mesmas populações, o que pode ser interpretado como um indicativo de adaptações locais aos conjuntos de patógenos presentes em distintas regiões geográficas / The Classical HLA genes (Human Leucocyte Antigens) are located in the human Major Histocompatibility Complex (the MHC) and present the highest levels of variation on the Human genome, with thousands of alleles associated with high levels of heterozygosis and nucleotide diversity. In the present study, our goal was the identification of the main targets of natural selection on the HLA genes. We proposed two different approaches to address this issue resulting in two manuscripts. At the first approach, we performed an intragenic analysis, verifying if the amino acids at the peptide-binding region (PBR) anchor positions (the B and F pockets) exhibit higher evidences of evolution under natural selection when compared with the remaining regions of the HLA molecules. To do so, we used a dataset generated for the 13th International Histocompatibility Workshop (IHW), composed by 6,435 and 6,409 individuals genotyped for HLA-A and -B respectively, belonging to 55 populations scattered along all the continents. We measured the levels of nucleotide diversity (&pi;) of the sequences coding for the B and F pockets and compared them with the remaining PBR pockets. Concomitantly, we applied the supertype classification which consists in groups of HLA-A and -B alleles which bind overlapping sets of peptides, as a consequence of sharing specific amino acids at B and F pockets and described the patterns of supertype variation in the observed data. Next, we developed a hypothesis test in which the observed patterns of population differentiation (Gst) and variability (heterozygosity (He) and number of alleles (k)), using the supertype definition, were compared with 10,000 replicates of random assigned groups of alleles. At the HLA-B locus, the B pocket presented the highest levels of variation (p < 0.00001, Wilcoxon rank sum test) and concentrated most of the differences between supertypes. Our simulations results revealed that the reassignment of alleles into random groups could not reproduce the observed patterns of population differentiation (with 98% of the simulations presenting Gst values smaller than the observed, using the African, European and Asiatic samples), indicating that supertypes and more specifically the B pocket specificities are significantly structured among populations, which could be an indicative of adaptations to local pathogens. We did not observe the same patterns at the HLA-A locus which presented relative lower levels of variation at B and F pockets when compared with the remaining PBR regions, and simulated values of Gst and He which often reproduced the observed data. At the second approach, our main objective was the identification of genes that contributed for local adaptation on Native American Populations because of the relatively recent colonization of the new American environments. We sequenced the exons 2 and 3 of the HLA-B and -C class I loci and the exon 2 of the -DRB1 class II locus in 635, 524 and 568 individuals, respectively, belonging to 32 different Native American Populations scattered along all the Americas. We estimated the allele frequencies, expected heterozygosity (He), degree of allelic sharing between populations (measured by the Prevost\'s Distance) and departure from neutral expectation using the Ewens-Watterson (EW) and Tajima\'s D test. Concomitantly, we used a dataset of 61 microsatellites scattered along the genome as a demographic control, comparing the degree of variation of the heterozygosity along the continent. The HLA-B locus showed the highest number of pairs of populations in which we did not observe any sharing of alleles (44 pairs against 4 and 6 for HLA-C and -DRB1 loci, respectively) and the Eastern South American (SAE) region was the one presenting the smallest levels of allelic sharing with other American regions at this locus (39 out the 44 pair of populations contained a SAE population). The presence of exclusive gene conversion and/or recombination alleles accounts for the higher differentiation of SAE populations at the -B locus. The -B locus also exhibited a higher level of variation at SAE populations which was evidenced

O gene Slc11a1 regula a resistência contra S. entérica, L. donovani e M. tuberculosis. Sublinhagens de camundongos AIRmax e AIRmin homozigotas para os alelos R e S do gene Slc11a1 (AIRmax,RR, AIRmaxSS, AIRminRR e AIRminSS) foram utilizadas para avaliar o efeito destes alelos na ativação de macrófagos peritoneais (M<font face=\"Symbol\">F), induzida pelo tioglicolato (TIO) ou infecção por M. bovis BCG.O TIO induz baixa ativação celular, a estimulação com LPS aumentou a ativação nos macrófagos dos animais AIRmaxRR e AIRmaxSS. Assim, na inflamação com TIO, a ativação do M<font face=\"Symbol\">F foi dependente do fundo genético selecionado nos animais AIRmax, independente do alelo do gene Slc11a1. Na infecção com BCG, a sublinhagem AIRmaxRR foi a única capaz de controlar a proliferação da bactéria, secretando altos níveis de IL-1<font face=\"Symbol\">b, IL-12, TNF<font face=\"Symbol\">a e IL-6 que ativam o macrófago. Por outro lado, os AIRminSS susceptíveis à infecção produziram maiores concentrações de NO, H2O2 e IL-10, mostrando o fundo genético para alta ou baixa resposta inflamatória, e os alelos do gene Slc11a1 interferem na resistência à infecção. / The Slc11a1 gene regulates resistance against S. enterica, L. donovani and M. tuberculosis. AIRmax and AIRmin mouse sublines, homozygous for Slc11a1 R and S alleles (AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR and AIRminSS) were used in this work to evaluate the effect of this gene in peritoneal macrophage (M<font face=\"Symbol\">F) activation induced by thioglycollate (TIO) or M. bovis BCG infection. TIO induced weak cellular activation, LPS stimulation increased AIRmaxRR and AIRmaxSS macrophages activation. These results indicate that inflammation and M<font face=\"Symbol\">F activation induced by TIO were dependent on the genetic background for acute inflammatory response, while Slc11a1 alleles have little effect on this phenotype. In BCG infection only AIRmaxRR mice were capable of controlling bacterial proliferation, which was accompanied with high levels of IL-1<font face=\"Symbol\">b, IL-12, TNF and IL-6 produced by activated macrophages. On the other hand, susceptible AIRminSS mice produced higher amounts of NO, H2O2 and IL-10 suggesting that both inflammatory background and Slc11a1 alleles interfere on resistance to BCG infection.

O objetivo deste estudo foi o de verificar a ocorrência de quatro genes de virulência em Salmonella Enteritidis de acordo com o fagotipo e ribotipo, assim como a virulência “in vivo". Os genes estudados foram invA, spvC, sefC e pefA em 120 amostras isoladas de várias fontes, pertencentes a diferentes fagotipos e ribotipos provenientes de sete estados brasileiros. Para a verificação da presença dos genes, as amostras foram examinadas pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) individualmente e em multiplex. A ocorrência para o gene invA foi de 100% nas amostras (120/120), spvC em 94% (113/120), sefC em 97,5% (117/120) e pefA em 97% (116/120) das amostras. Foi possível caracterizar as amostras em cinco diferentes perfis. O primeiro, P1, foi positivo para os genes invA, spvC, sefC e pefA, P2 para invA, spvC e pefA, P3 para invA, sefC e pefA, P4 para invA e sefC e o último P5 para os genes invA e spvC. Para as amostras PT4RT1 obteve-se o perfil P1 em 94% (64/68), P2 em 1,5% (1/68), P3 em 3% (2/68) e P4 em 1,5% das amostras (1/68). Para as amostras PT4RT2, 86% (18/21) pertenceram ao perfil P1, 5% (1/21) ao P3 e 9% (2/21) das amostras ao perfil P4. Nas amostras PT4RT3 80% (4/5) pertenceram ao perfil P1 e 20% (1/5) ao P2. Nas amostras PT4TR9, 91% (10/11) pertenceram ao perfil P1 e 9% (1/11) ao P3. Todas as amostras PT4RT5, PT7RT1 e PT4RT10 pertenceram ao perfil P1 e apenas a amostra PT1 apresemtou o perfil P5. A virulência foi avaliada desafiando as aves via oral e subcutânea, através da colonização do ceco e invasão do fígado e baço. O gene spvC está relacionado com a sobrevivência e aumento da média de crescimento da bactéria no fígado e baço, mas neste estudo não demonstrou diferença na porcentagem de aves com reisolamento positivo para a bactéria nestes orgãos. Os genes sefC e pefA foram importantes para promover a colonização cecal, pois somente quando estes dois genes simultaneamente estiveram presentes no perfil, obteve-se o reisolamento cecal quando as aves foram desafiadas oralmente sendo esta via a principal rota de infecção deste patógeno. / This study has the intention of verify the four virulence genes event in Salmonella Enteritidis according with phage type and ribotype and the virulence “in vivo". The genes studied were invA, spvC, sefC and pefA in 120 Salmonella Enteritidis isolates from different origins, belongs at different ribotypes and phage types of seven Brazilian states. To verify the genes presence the strains were examined by Polimerase Chain Reaction (PCR) technique, singly and multiplex. The event of invA gene was in 100% (120/120) of strains, the spvC gene was in 94% (113/120) of strains, the sefC gene was in 97.5% (117/120) of strains and the pefA gene was in 97% (116/120) of strains. There were discovered five different profiles. The pattern one, P1, was positive for invA, spvC, sefC e pefA. The P2 was positive for invA, spvC and pefA. The P3 was positive for invA, sefC e pefA. The P4 was positive for invA and sefC and the last one, P5, was positive for invA and spvC. For the PT4RT1 strains, the P1 profile was present in 94% (64/68) of strains; P2 profile was in 1.5% (1/68); P3 in 3% (2/68); and P4 in 1.5% (1/68) of strains. For the PT4RT2 strains, the P1 profile was present in 86% (18/21) of strains; P3 profile was in 5% (1/21); and P4 in 9% (2/21) of strains. For the PT4RT3 strains, the P1 profile was present in 80% (4/5) of strains, and P2 in 20% (1/5) of strains. For the PT4RT9 strains, the P1 profile was present in 91% (10/11) of strains, and P3 in 9% (1/11) of strains. The strains: PT4RT5, PT7RT1 e PT4RT10 belongs at the P1 profile, and only the PT1 strain belongs at the P5’s profile. The virulence was evaluated challenging the birds orally and subcutaneous, through the colonization of the caecum, liver and spleen invasion. The gene spvC was related with the survivance and the increase of the average grow of the bacteria in the liver and spleen, but this study doesn’t demonstrate the difference in the percentage of positive birds for the bacteria in their organs. The sefC and pefA genes were important to promote the caecum colonization, because only when both genes were present simultaneously in the profile, obtain the caecum isolation when the birds were been by orally challenged this way the main route of the infection of this pathogen.

A família de genes HOX compreende um conjunto de fatores de transcrição altamente conservados evolutivamente. Em mamíferos, os genes HOX se subdividem em 4 clusters: HOXA, HOXB, HOXC e HOXD, atuando no desenvolvimento embrionário com a regulação de processos biológicos como proliferação, diferenciação, migração, angiogênese e apoptose que são reativados durante a carcinogênese. Estudos recentes apontam que os genes HOX podem exercer papel relevante na formação de diversos tumores sólidos, todavia ainda não foi possível caracterizar sistematicamente a expressão dos genes HOX em tumores bem como determinar seus alvos em tumores. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho consistiu na caracterização in silico do modelo de atuação genes HOX na carcinogênese. Para cumprir este objetivo foi identificado o perfil diferencial dos genes HOX entre amostras normais e tumorais. Alvos de genes HOX foram identificados e, quando diferencialmente expressos, foram associados com os genes HOX, independentemente dos índices de metilação e CNA. Por fim, as associações finais entre os genes HOX e seus alvos foram enriquecidas com os bancos de dados KEGG e GO. Identificou-se diferentes assinaturas de expressão de genes HOX em diferentes tumores, associadas com o eixo ântero-posterior do corpo humano, bem como os folhetos embrionários originários aos tecidos tumorais, compatível com o padrão de expressão no desenvolvimento embrionário. Um número considerável de genes HOX atuam preferencialmente via enhancers na regulação de seus alvos. Como exemplo, os genes HOXB7 e HOXC11, que funcionam como moduladores anti tumorais. Finalmente, o estudo mostra que diante do número crescente de dados genômicos públicos, é possível viabilizar projetos de grande valor científico. / The HOX gene family comprises a set of evolutionarily highly conserved transcription factors. In mammals, HOX genes are subdivided into four clusters: HOXA, HOXB, HOXC and HOXD, acting on the embryonic development with regulation of biological processes such as proliferation, differentiation, migration, angiogenesis and apoptosis that are reactivated during carcinogenesis. Recent studies indicate that HOX genes may play a relevant role in the formation of several solid tumors, but it has not been possible to systematically characterize the expression of HOX genes in tumors as well as to determine their targets in tumors. Thus, the general aim of this project was to characterize the in vivo model of HOX genes in carcinogenesis. To accomplish this goal the differential profile of HOX genes was identified between normal and tumor samples. HOX gene targets were identified and, when differentially expressed, were associated with HOX genes regardless of methylation and CNA indices. Finally, the final associations between the HOX genes and their targets were enriched with the KEGG and GO databases. Different signatures of HOX gene expression were identified in different tumors, associated with the anteroposterior axis of the human body, as well as the embryonic leaflets originating from the tumor tissues, compatible with the expression pattern in the embryonic development. A considerable number of HOX genes preferentially act via enhancers in the regulation of their targets. As an example, the HOXB7 and HOXC11 genes, which function as pro-tumor modulators. Finally, the study shows that in view of the growing number of public genomic data, it is possible to make feasible projects of great scientific value.

A periodontite é uma doença multifatorial, iniciada pela presença de biofilme bacteriano que interage com os mecanismos de defesa do hospedeiro e ocasiona resposta inflamatória quantificável exibindo destruição tecidual. As evidências indicam que a doença periodontal tem estados dinâmicos de exacerbação e remissão. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a dinâmica da resposta inflamatória ao longo de 45 dias, desde a indução da perda óssea experimental até a crônificação do processo, em modelo de doença periodontal induzido por ligadura. Cinquenta ratos receberam ligadura no 1º molar inferior e foram sacrificados nos seguintes tempos: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 e 45 dias. Após obtenção das amostras da mandíbula, as peças e as biópsias de gengiva foram processadas para obteção das medidas histomorfométricas e análises microtomográficas e de expressão gênica. Os resultados confirmaram perda óssea progressiva e infiltrado inflamátorio até o tempo de 20 dias (p<0.05). Após 21 dias, observou-se a estabilização da perda óssea. Nos períodos inicias, observou-se predominante expressão de genes pró-inflamatórios, relacionados com a destruição tecidual como: CCL2, CCL3, CCL4, IL1B, IL6, MMP-8, MMP-9 e, nos momentos tardios, uma maior expressão de genes anti-inflamatórios como IL4 e IL10. Através da análise de regressão linear observou-se que a MMP-8 está correlacionada com a expressão de IL1&beta;, TNFa, IL17, MCP1, MIP1a e MIP1b. A MIP1a está correlacionada com MMP2 e RANKL está correlacionada com IL1&beta;, IL17, IL-6, e MIP1b MIP1a. Correlações que mostram uma maior associação a perda óssea nos períodos ativos da doença induzida. Assim, conclui-se que a periodontite experimental, por um período de até 45 dias, passa pelas fazes de exacerbação e remissão. Esse processo dinâmico pode ser monitorado por marcadores moleculares e morfométricos e contribuir para o melhor entendimento da patogênese da doença, contribuindo para a determinação do melhor momento para se avaliar cada biomarcador ou processo biológico. / Periodontitis is a multifactorial disease initiated by the presence of bacterial biofilms hat interacts with the defense mechanisms of the host and causes intense inflammatory response and tissue destruction. Evidence suggests that periodontal disease has dynamic states of exacerbation and remission. Fifty rats received ligation in 1 molar and were sacrificed at the following times: 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 and 45 days, 6 rats per time evaluation. After obtaining the jaw samples, parts and biopsies gum form processed for histomorphometric measures analysis with microtomography and gene expression. Histological results showed microtromograficos and progressive bone loss and inflammation to the influx time of 20 days (p <0.05). After this time it was observed stabilization of bone loss. In the initial periods observed expression of pro-inflammatory genes associated with tissue destruction as CCL2, CCL3, CCL4, IL1B, IL6, MMP8, MMP9 and late times greater expression of anti-inflammatory genes such as IL4 and IL10. Linear regression analysis was used to investigate the possible correlation between levels of MMP expression, FOXP3 and RANKL. MMP8 is correlated with IL1&beta;, TNFa, IL17, MCP1, MIP1a and MIP1b. MIP1a is also correlated with MMP2. RANKL is correlated with IL1&beta;, IL17, IL-6, and MIP1b MIP1a. Correlations that show a greater association with bone loss in active periods of induced disease. Experimental periodontitis, in a period of 45 days, passes through periods of exacerbation and remission. This dynamic process can be monitored by molecular and morphometric markers and contribute to a better understanding of the pathogenesis of the disease, helping to etermine the best time to evaluate each biomarker, or biological process.