Background: To allow an immediate treatment of an infection with suitable antibiotics and bactericides or fungicides, there is an urgent need for fast and precise identification of the causative human pathogens. Methods based on DNA sequence comparison like 16S rRNA analysis have become standard tools for pathogen verification. However, the distinction of closely related organisms remains a challenging task. To overcome such limitations, we identified a new genomic target sequence located in the single copy gene for tRNA nucleotidyltransferase fulfilling the requirements for a ubiquitous, yet highly specific DNA marker. In the present study, we demonstrate that this sequence marker has a higher discriminating potential than commonly used genotyping markers in pro- as well as eukaryotes, underscoring its applicability as an excellent diagnostic tool in infectology. Results: Based on phylogenetic analyses, a region within the gene for tRNA nucleotidyltransferase (CCA-adding enzyme) was identified as highly heterogeneous. As prominent examples for pro- and eukaryotic pathogens, several Vibrio and Aspergillus species were used for genotyping and identification in a multiplex PCR approach followed by gel electrophoresis and fluorescence-based product detection. Compared to rRNA analysis, the selected gene region of the tRNA nucleotidyltransferase revealed a seven to 30-fold higher distinction potential between closely related Vibrio or Aspergillus species, respectively. The obtained data exhibit a superb genome specificity in the diagnostic analysis. Even in the presence of a 1,000-fold excess of human genomic DNA, no unspecific amplicons were produced. Conclusions: These results indicate that a relatively short segment of the coding region for tRNA nucleotidyltransferase has a higher discriminatory potential than most established diagnostic DNA markers. Besides identifying microbial pathogens in infections, further possible applications of this new marker are food hygiene controls or metagenome analyses.

The genome can be considered the blueprint for an organism. Composed of DNA, it harbours all organism-specific instructions for the synthesis of all structural components and their associated functions. The role of carriers of actual molecular structure and functions was believed to be exclusively assumed by proteins encoded in particular segments of the genome, the genes. In the process of converting the information stored genes into functional proteins, RNA – a third major molecule class – was discovered early on to act a messenger by copying the genomic information and relaying it to the protein-synthesizing machinery. Furthermore, RNA molecules were identified to assist in the assembly of amino acids into native proteins. For a long time, these - rather passive - roles were thought to be the sole purpose of RNA. However, in recent years, new discoveries have led to a radical revision of this view. First, RNA molecules with catalytic functions - thought to be the exclusive domain of proteins - were discovered. Then, scientists realized that much more of the genomic sequence is transcribed into RNA molecules than there are proteins in cells begging the question what the function of all these molecules are. Furthermore, very short and altogether new types of RNA molecules seemingly playing a critical role in orchestrating cellular processes were discovered. Thus, RNA has become a central research topic in molecular biology, even to the extent that some researcher dub cells as “RNA machines”. This thesis aims to contribute towards our understanding of RNA-related phenomena by applying Bioinformatics means. First, we performed a genome-wide screen to identify sites at which the chemical composition of DNA (the genotype) critically influences phenotypic traits (the phenotype) of the model plant Arabidopsis thaliana. Whole genome hybridisation arrays were used and an informatics strategy developed, to identify polymorphic sites from hybridisation to genomic DNA. Following this approach, not only were genotype-phenotype associations discovered across the entire Arabidopsis genome, but also regions not currently known to encode proteins, thus representing candidate sites for novel RNA functional molecules. By statistically associating them with phenotypic traits, clues as to their particular functions were obtained. Furthermore, these candidate regions were subjected to a novel RNA-function classification prediction method developed as part of this thesis. While determining the chemical structure (the sequence) of candidate RNA molecules is relatively straightforward, the elucidation of its structure-function relationship is much more challenging. Towards this end, we devised and implemented a novel algorithmic approach to predict the structural and, thereby, functional class of RNA molecules. In this algorithm, the concept of treating RNA molecule structures as graphs was introduced. We demonstrate that this abstraction of the actual structure leads to meaningful results that may greatly assist in the characterization of novel RNA molecules. Furthermore, by using graph-theoretic properties as descriptors of structure, we indentified particular structural features of RNA molecules that may determine their function, thus providing new insights into the structure-function relationships of RNA. The method (termed Grapple) has been made available to the scientific community as a web-based service. RNA has taken centre stage in molecular biology research and novel discoveries can be expected to further solidify the central role of RNA in the origin and support of life on earth. As illustrated by this thesis, Bioinformatics methods will continue to play an essential role in these discoveries. / Das Genom eines Organismus enthält alle Informationen für die Synthese aller strukturellen Komponenten und deren jeweiligen Funktionen. Lange Zeit wurde angenommen, dass Proteine, die auf definierten Abschnitten auf dem Genom – den Genen – kodiert werden, die alleinigen Träger der molekularen - und vor allem katalytischen - Funktionen sind. Im Prozess der Umsetzung der genetischen Information von Genen in die Funktion von Proteinen wurden RNA Moleküle als weitere zentrale Molekülklasse identifiziert. Sie fungieren dabei als Botenmoleküle (mRNA) und unterstützen als Trägermoleküle (in Form von tRNA) die Zusammenfügung der einzelnen Aminosäurebausteine zu nativen Proteine. Diese eher passiven Funktionen wurden lange als die einzigen Funktionen von RNA Molekülen angenommen. Jedoch führten neue Entdeckungen zu einer radikalen Neubewertung der Rolle von RNA. So wurden RNA-Moleküle mit katalytischen Eigenschaften entdeckt, sogenannte Ribozyme. Weiterhin wurde festgestellt, dass über proteinkodierende Abschnitte hinaus, weit mehr genomische Sequenzbereiche abgelesen und in RNA Moleküle transkribiert werden als angenommen. Darüber hinaus wurden sehr kleine und neuartige RNA Moleküle identifiziert, die entscheidend bei der Koordinierung der Genexpression beteiligt sind. Diese Entdeckungen rückten RNA als Molekülklasse in den Mittelpunkt moderner molekularbiologischen Forschung und führten zu einer Neubewertung ihrer funktionellen Rolle. Die vorliegende Promotionsarbeit versucht mit Hilfe bioinformatorischer Methoden einen Beitrag zum Verständnis RNA-bezogener Phänomene zu leisten. Zunächst wurde eine genomweite Suche nach Abschnitten im Genom der Modellpflanze Arabidopsis thaliana vorgenommen, deren veränderte chemische Struktur (dem Genotyp) die Ausprägung ausgewählter Merkmale (dem Phänotyp) entscheidend beeinflusst. Dabei wurden sogenannte Ganz-Genom Hybridisierungschips eingesetzt und eine bioinformatische Strategie entwickelt, Veränderungen der chemischen Struktur (Polymorphismen) anhand der veränderten Bindung von genomischer DNA aus verschiedenen Arabidopsis Kultivaren an definierte Proben auf dem Chip zu detektieren. In dieser Suche wurden nicht nur systematisch Genotyp-Phänotyp Assoziationen entdeckt, sondern dabei auch Bereiche identifiziert, die bisher nicht als proteinkodierende Abschnitte annotiert sind, aber dennoch die Ausprägung eines konkreten Merkmals zu bestimmen scheinen. Diese Bereiche wurden desweiteren auf mögliche neue RNA Moleküle untersucht, die in diesen Abschnitten kodiert sein könnten. Hierbei wurde ein neuer Algorithmus eingesetzt, der ebenfalls als Teil der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde. Während es zum Standardrepertoire der Molekularbiologen gehört, die chemische Struktur (die Sequenz) eines RNA Moleküls zu bestimmen, ist die Aufklärung sowohl der Struktur als auch der konkreten Funktion des Moleküls weitaus schwieriger. Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit ein neuer algorithmischer Ansatz entwickelt, der mittels Computermethoden eine Zuordnung von RNA Molekülen zu bestimmten Funktionsklassen gestattet. Hierbei wurde das Konzept der Beschreibung von RNA-Sekundärstrukturen als Graphen genutzt. Es konnte gezeigt werden, dass diese Abstraktion von der konkreten Struktur zu nützlichen Aussagen zur Funktion führt. Des weiteren konnte demonstriert werden, dass graphen-theoretisch abgeleitete Merkmale von RNA-Molekülen einen neuen Zugang zum Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen ermöglichen. Die entwickelte Methode (Grapple) wurde als web-basierte Anwendung der wissenschaftlichen Welt zur Verfügung gestellt. RNA hat sich als ein zentraler Forschungsgegenstand der Molekularbiologie etabliert und neue Entdeckungen können erwartet werden, die die zentrale Rolle von RNA bei der Entstehung und Aufrechterhaltung des Lebens auf der Erde weiter untermauern. Bioinformatische Methoden werden dabei weiterhin eine essentielle Rolle spielen.

In rheumatoid arthritis (RA), a key event is infiltration of inflammatory immune cells into the synovial lining, possibly aggravated by dysregulation of cellular adhesion molecules. Therefore, single nucleotide polymorphisms of 14 genes involved in cellular adhesion processes (CAST, ITGA4, ITGB1, ITGB2, PECAM1, PTEN, PTPN11, PTPRC, PXN, SELE, SELP, SRC, TYK2, and VCAM1) were analyzed for association with RA. Association analysis was performed consecutively in three European RA family sample groups (Nfamilies = 407). Additionally, we investigated differential allelic expression, a possible functional consequence of genetic variants. SELP (selectin P, CD62P) SNP-allele rs6136-T was associated with risk for RA in two RA family sample groups as well as in global analysis of all three groups (ptotal = 0.003). This allele was also expressed preferentially (p,1026) with a two- fold average increase in regulated samples. Differential expression is supported by data from Genevar MuTHER (p1 = 0.004; p2 = 0.0177). Evidence for influence of rs6136 on transcription factor binding was also found in silico and in public datasets reporting in vitro data. In summary, we found SELP rs6136-T to be associated with RA and with increased expression of SELP mRNA. SELP is located on the surface of endothelial cells and crucial for recruitment, adhesion, and migration of inflammatory cells into the joint. Genetically determined increased SELP expression levels might thus be a novel additional risk factor for RA.

Background: To allow an immediate treatment of an infection with suitable antibiotics and bactericides or fungicides, there is an urgent need for fast and precise identification of the causative human pathogens. Methods based on DNA sequence comparison like 16S rRNA analysis have become standard tools for pathogen verification. However, the distinction of closely related organisms remains a challenging task. To overcome such limitations, we identified a new genomic target sequence located in the single copy gene for tRNA nucleotidyltransferase fulfilling the requirements for a ubiquitous, yet highly specific DNA marker. In the present study, we demonstrate that this sequence marker has a higher discriminating potential than commonly used genotyping markers in pro- as well as eukaryotes, underscoring its applicability as an excellent diagnostic tool in infectology. Results: Based on phylogenetic analyses, a region within the gene for tRNA nucleotidyltransferase (CCA-adding enzyme) was identified as highly heterogeneous. As prominent examples for pro- and eukaryotic pathogens, several Vibrio and Aspergillus species were used for genotyping and identification in a multiplex PCR approach followed by gel electrophoresis and fluorescence-based product detection. Compared to rRNA analysis, the selected gene region of the tRNA nucleotidyltransferase revealed a seven to 30-fold higher distinction potential between closely related Vibrio or Aspergillus species, respectively. The obtained data exhibit a superb genome specificity in the diagnostic analysis. Even in the presence of a 1,000-fold excess of human genomic DNA, no unspecific amplicons were produced. Conclusions: These results indicate that a relatively short segment of the coding region for tRNA nucleotidyltransferase has a higher discriminatory potential than most established diagnostic DNA markers. Besides identifying microbial pathogens in infections, further possible applications of this new marker are food hygiene controls or metagenome analyses.

Streptococcus (S.) agalactiae sind grampositive, in Ketten gelagerte Kokken, die auf Blutagar eine Hämolyse zeigen. Aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur Lancefield-Gruppe B werden sie auch als Gruppe B Streptokokken (GBS) bezeichnet (Hof, 2005). GBS sind die Hauptursache von Sepsis, Meningitis und Pneumonie bei Neugeborenen (Schrag, et al., 2000). Die Arbeit beschäftigte sich mit der Genotypisierung von GBS. Darüber hinaus konnten auch Einblicke in die Phylogenese sowie die Populationsstruktur von GBS gewonnen werden. Ziel war es, einen DNA-Microarray zu entwickeln und zur Genotypisierung von GBS einzusetzen. Während der Evaluierung des DNA Microarray konnten stammspezifische Muster beobachtet werden, diese wurden durch bereits etablierte Typisierungmethoden (MLST) bekannten Genotypen zugeordnet. Die Ergebnisse wurden in einer Datenbank zusammengefasst. Mithilfe der Datenbank konnte die Software zur Auswertung entwickelt werden. (siehe http://alere-technologies.com/en/products/lab-solutions.html). Der DNA-Microarray trägt Sonden für GBS-spezifische Virulenzfaktoren und Oberflächenmarker. Für die auf dem Microarray basierende Typisierung wurden 11 über das ganze Genom verteilte Gene bzw. Gencluster (bac, alp, pil1 locus, pepS8, fBsB, capsule locus, hylB, abiG-I/-II plus Q8DZ34, pil2 locus, nss plus srr plus rogB2 und rgfC/A/D/B) ausgewählt. Ubiquitär vorkommende, konservierte Gene (z. B. cylD/cylE) eignen sich nicht als Marker für eine Typisierung, wurden aber als Kontrollen und zur Normierung eingeschlossen. Zur vollständigen Charakterisierung wurden außerdem Sonden für hochmobile plasmidgebundene Resistenzgene wie z. B. erm(A), erm(B), erm(C), tet(M), emrB/qacA aufgetragen (Aracil, et al., 2002; Betriu, et al., 2003; Uh, et al., 2001). Diese Gene sind nicht für GBS spezifisch. Sie eignen sich z. B. für eine Unterscheidung einzelner Isolate, nicht jedoch für die Unterteilung der GBS Population in verschiedene Stämme. Für die vorliegende Arbeit wurden insgesamt 448 klinische Isolate von GBS ausgewählt und untersucht. Darunter waren Isolate, die schwerwiegende Erkrankungen wie Sepsis und Meningitis verursacht haben, Isolate aus lokalen Infektionen sowie Isolate von asymptomatischen/gesunden Trägern. Zu Vergleichszwecken wurden außerdem Isolate aus der Veterinärmedizin (von bovinen Mastitisfällen) und humane Isolate aus einer geographisch weit entfernten Region (Trinidad und Tobago) genotypisiert. Für 36 ausgewählte Isolate mit repräsentativen Hybridisierungsmustern wurde zusätzlich eine Typisierung mittels Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) (Jones, et al., 2003) durchgeführt. Die Hybridisierungsmuster vom Microarray wurden mit Daten aus diesem bereits etablierten Typisierungssystem verbunden. Durch die Verknüpfung beider Methoden konnte eine Einteilung der GBS Isolate in verschiedene Stämme vorgenommen werden. Mit Hilfe des eBURST-Algorithmus wurde gezeigt, dass einige Hybridisierungsmuster sich zu Gruppen zusammenfügen. Dieses Verfahren veranschaulicht die Populationsstruktur und beschreibt die genetische Vielfalt. Mit den 11 definierten Markern konnten die untersuchten Isolate 76 verschiedenen Stämmen bzw. „hybridization profiles“ (HP) zugeordnet werden. Die Einteilung beruht auf dem Fehlen bzw. Vorhandensein einzelner Gene/Gencluster bzw. deren allelischen Varianten. Diese Stämme korrelieren mit den durch MLST definierten klonalen Komplexen (CC). Isolate mit identischen oder ähnlichen Hybridisierungsprofilen gehören zum selben CC. Dagegen können Isolate mit einem ähnlichen MLST-Profil verschiedene Hybridisierungsmuster zeigen. Es konnte außerdem häufig beobachtet werden, dass ansonsten ähnliche Stämme sich in einzelnen Merkmalen, z. B. Kapsel-Genen, alp- oder pili-Genen, voneinander unterscheiden, und dass diese Gene unabhängig voneinander variieren. Zusätzlich zeigten einige ubiquitäre Gene/Gencluster, die sich in den publizierten Genomsequenzen immer an derselben Position befinden, zahlreiche verschiedene Allele. Welches Allel in einem gegebenen Stamm gerade vorliegt, scheint dabei eher zufällig zu sein. Eine Erklärung dieses Phänomens könnte in vergangenen Rekombinationsereignissen liegen. Auch eine konvergente Evolution könnte diskutiert werden. Ähnliche Stämme/ „hybridization profiles“ wurden in Analogie zu den MLST-definierten klonalen Komplexen zu Gruppen zusammengefügt. Das bedeutet jedoch nicht notwendigerweise eine direkte Verwandtschaft der Isolate im Sinne des Vorhandenseins eines unmittelbaren gemeinsamen Vorfahren. Die Typisierung sowohl über den DNA-Microarray als auch über die MLST kann nicht die „wahre“ Phylogenese im Rahmen der Evolutionsgeschichte und Herkunft widerspiegeln. Sie stellt lediglich ein zufälliges Modell dar, ein Ordnungssystem im Sinne eines genetischen Fingerabdrucks, das einen Vergleich von Isolaten, aber keine Rückschlüsse über deren Abstammung und Herkunft erlaubt.Die untersuchten GBS Isolate konnten in fünf klonale Komplexe (CC19, CC23, CC26, CC103, CC130) eingeteilt werden, deren Häufigkeit unterschiedlich war. Deutsche humanmedizinische Isolate konnten vorwiegend CC19 zugeordnet werden. Karibische humanmedizinische Isolate sind zumeist CC19 und CC23 zugehörig. Bovine Isolate gehören meist zu CC19 und CC103. Unter humanen Isolaten ist CC103 rar. Vermutlich basierend auf der geografischen und wirtsspezifischen Herkunft der untersuchten GBS Isolate gibt es Unterschiede in der Populationsstruktur. In der vorliegenden Arbeit war CC19 der am häufigsten gefundene und außerdem ein genetisch besonders inhomogener CC. Er besteht aus mehreren unterschiedlichen, bisher als eigenständig angesehenen CCs (darunter CC1, CC17, CC19 und CC22). Diese werden von dem zur MLST-Verwandtschaftsanalysen verwendeten eBURST-Algorithmus zu CC19 zusammengefasst, seit die MLST-Profile von 'missing links' zwischen den CCs identifiziert wurden, da eBURST „gemeinsame Vorfahren“ nicht von durch horizontalem Gentransfer bzw. durch Hybridisierungen entstandenen „Chimären“ unterscheiden kann. Da diese Komplexe klar unterscheidbare Hybridisierungsmuster aufweisen, wurden sie hier als CC19/01, CC19/17, CC19/19 und CC19/22 bezeichnet. Einzelne Gene traten in Gruppen von Isolaten aus verschiedener Herkunft unterschiedlich häufig auf. So fand sich der Virulenzfaktor scpB in 412 von 418 humanen Isolaten (98,6 %), aber nur in 10 von 21 Rinderisolaten (48 %). Ferner ließ sich beobachten, dass invasive Isolate weniger wahrscheinlich abiGI-/II und Q8DZ34 tragen, jedoch häufiger pil1 locus, fbsB (515) und Kapseltyp III sowie pil2b, nss/srr und rgf (COH1 like) aufweisen. Einige dieser Marker erscheinen zusammen in CC19/17-Stämmen, welche häufig bei invasiven Krankheitsverläufen beobachtet werden. CC19 (incl. ST01, ST17, ST19) konnte bei neonatalen Sepsis-Fällen in verschiedenen geografischen Regionen isoliert werden (Brzychczy-Wloch, et al., 2012; Ryu, et al., 2014; Sorensen, et al., 2010; Strakova, et al., 2010; Tien, et al., 2011). Zusätzlich wurden andere Virulenzfaktoren wie speM (Exotoxin M) und das cyl-Operon (beta-Hämolysin) untersucht. In lediglich sieben Isolaten wurde speM nachgewiesen. Das cyl-Operon konnte in allen Isolaten gefunden werden, sein Nachweis ist daher für eine Vorhersage der Virulenz eines gegebenen Isolates nicht hilfreich. Es konnte kein einzelner Faktor zur definitiven Unterscheidung zwischen invasiven Isolaten und Trägerisolaten bestimmt werden. Für die Virulenz eines Isolates ist wahrscheinlich nicht das bloße Vorhandensein oder Fehlen eines bestimmten Genes ausschlaggebend, sondern dessen Expression in vivo. Wichtig wäre in diesem Zusammenhang auch die genaue Betrachtung der Sequenz eines als Virulenzfaktor angesehenen Genes sowie die Untersuchung der zugehörigen regulatorischen Gene. Über den Nachweis der Gene erm(A), erm(B) und erm(C) konnte eine Aussage über die Macrolid-/Clindamycinresistenz eines GBS Isolates getroffen werden. Bei keinem der karibischen Isolate wurden erm Gene nachgewiesen. Innerhalb der deutschen GBS Population wurde erm(B) am häufigsten beobachtet. Die Gene erm(A) und erm(C) waren in humanen Isolaten selten und wurden in bovinen Isolaten überhaupt nicht gefunden. Das Tetracyclinresistenzgen tet(M) wurde häufig in humanen Isolaten und sehr selten in veterinärmedizinischen Isolaten gefunden. Für weiterführende Untersuchungen könnte die beschriebene Typisierungsmethode verfeinert werden. So lassen sich z. B. die oben beschriebenen 11 ausgewählten Typisierungsmarker des Microarrays mit denen der MLST zu einem 18 Marker-System verknüpfen. Daneben können auch erm-, cad-, mer- oder tet-Gene zur Feststellung oder zum Ausschluss der Identität verwandter Isolate in vitro oder in silico verwendet werden. Mit der nun einsatzbereiten Genotypisierungsmethode können in Zukunft weitere Studien zur Untersuchung regionaler und wirtsspezifischer Unterschiede der GBS Population durchgeführt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der DNA-Microarray stabile und reproduzierbare Resultate erbringt. Es kann ein detaillierter Befund erstellt werden, die Ergebnisse sind mit denen anderer Typisierungsmethoden und der Genomsequenzierung vergleichbar. Jedoch steht mit dem DNA-Microarray ein wesentlich unkomplizierteres und schnelleres Procedere zur Verfügung, welches zudem geringere Kosten verursacht.:1. Einleitung 5 1.1 Gegenstand der Untersuchung 5 1.2 Entdeckungsgeschichte 6 1.3 Klinische Bedeutung 7 1.4 Veterinärmedizinische Bedeutung 9 1.5 Stand der Forschung mit Hinblick auf Typisierung von GBS 9 1.6 Ziele der vorliegenden Untersuchung 10 1.7 Vorgehensweise 11 1.7.1 Untersuchungsmaterial 11 1.7.2 Untersuchungsmethode 11 1.8 Zur Typisierung ausgewählte Marker 12 2. DNA Microarray-Based Typing of Streptococcus agalactiae Isolates 15 2.1 Abstract 16 2.2 Introduction 17 2.3 Materials and methods 18 2.3.1 Bacterial isolates 18 2.3.2 Ethics statement 18 2.3.3 Preparation of genomic DNA 19 2.3.4 MLST 19 2.3.5 Microarray design and protocol optimization 19 2.3.6 Microarray procedures 20 2.3.7 eBURST 21 2.4 Results 22 2.4.1 Typing GBS by MLST 22 2.4.2 Genotyping GBS by microarray hybridization 22 2.4.3 Population structure 25 2.4.4 Detection of antibiotic resistance markers 25 2.4.5 Detection of heavy metal resistance markers 26 2.5 Discussion 27 2.6 Acknowledgments 30 2.7 References 31 2.8 Tables and figures 33 3. Zusammenfassung 45 3.1 Zusammenfassung 45 3.2 Summary 49 4. Korrespondenz mit dem Editor 53 4.1 Hinweise des Editors und der Gutachter 53 4.2 Antworten an den Editor 56 4.3 Endgültige Annahme 58 Anhang 61 / Streptococcus (S.) agalactiae are Gram-positive, chain-forming cocci, which show hemolysis on blood agar. They are also referred to group B streptococci (GBS) because of their affiliation to Lancefield-group B (Hof, 2005). GBS are the main cause of sepsis, meningitis and pneumonia in newborns (Schrag, et al., 2000). The work focused on genotyping of GBS. The aim was to develop a DNA microarray and to use it for epidemiological typing of GBS. During the evaluation of the microarray, strain-specific patterns could be observed and these patterns assigned to genotypes as defined by other typing methods (MLST). The results were summarized in a database that subsequently was developed into software for automated analysis of experiments (http://alere-technologies.com/en/products/lab-solutions.html). The DNA microarray carries probes for GBS specific virulence factors and surface markers. For the microarray-based typing, 11 genes or gene clusters were selected that are distributed across the entire genome (bac, alp, pil1 locus, pepS8, fBsB, capsule locus, hylB, abiG-I/-II plus Q8DZ34, pil2 locus, nss plus srr plus rogB2 and rgfC/A/D/B). Ubiquitous, conserved genes (e.g. cylD/cylE) were included to be used as species markers and controls. Furthermore, probes for highly mobile plasmid-borne resistance genes such as erm(A), erm(B), erm(C), tet(M), emrB/qacA were also included (Aracil, et al., 2002; Betriu, et al., 2003; Uh, et al., 2001). These genes are not specific to GBS, but they are found in some isolates. They can be used to distinguish individual, related isolates, rather than for a definition of distinct strains. A total of 448 isolates of GBS was selected and examined for the present work. Among them were isolates from severe diseases, such as sepsis and meningitis, isolates from local infections as well as isolates from asymptomatic/healthy carriers. For comparison, isolates from veterinary medicine (from cases of bovine mastitis) and human isolates from a geographically distant region (Trinidad and Tobago) were genotyped. For 36 selected isolates with representative hybridization patterns, parallel typing was performed using a second method, multilocus sequence typing (MLST) (Jones, et al., 2003). Hybridization patterns on the Microarray could thus be linked to this already established typing system. With the array based GBS typing isolates could be divided into 76 different strains or 'hybridization profiles', HP. The classification with both methods is based on the absence or presence of individual genes or gene clusters or their allelic variants. Similar isolates were lumped together. The eBURST algorithm was used to group strain-specific patterns into groups of related strains illustrating the population structure and describing the genetic diversity. Groups of similar hybridization patterns largely correlate with the clonal complexes (CC) defined by MLST. While isolates with identical or similar hybridization profiles belong to the same CC, isolates with a similar MLST profile can show different hybridization patterns. It has also often been observed that otherwise similar strains differ from each other in individual traits, e.g. capsule genes, alp or pili genes, and that these genes vary independently of one another. In addition, some ubiquitous genes/gene clusters, which are always localized at the same position in the published genomic sequences, show numerous different alleles and related strains (that belong to one clonal complex) might differ in the presence of one allele. Alleles are thus not linked to clonal complexes, but rather randomly distributed. An explanation of this phenomenon could be a frequent occurrence of recombination events or horizontal gene transfers. A convergent evolution could also be discussed as an alternative explanation. A similarity of hybridization profiles does not necessarily mean a direct phylogenetic relationship between the isolates in the sense of being derived from a direct common ancestor. Typing both the DNA microarray and the MLST cannot reflect the 'true' phylogenesis, evolutionary history and origin. Assuming frequent recombination i.e., random events, the MLST profiles as well as the hybridization patterns can be used as genetic fingerprints, allowing a comparison of isolates, but no conclusions about their phylogeny and origin. The investigated GBS isolates were classified into five clonal complexes (CC19, CC23, CC26, CC103, CC130) with very different relative abundances indicating differences in the population structure with regard to geographic origin and host organisms. German medical isolates were mainly assigned CC19. Caribbean medical isolates mostly were assigned to CC19 and CC23. Bovine isolates usually belonged to CC19 and CC103. Among human isolates, CC103 was rare. In the present work, CC19 was the most abundant and the genetically most inhomogeneous CC. Several different clusters that previously been regarded as CCs (CC1, CC17, CC19 and CC22) have recently been merged to CC19 by the eBURST algorithm since MLST profiles of missing links between the CCs have been identified. Unfortunately, eBURST cannot distinguish whether two MLST types are linked by true common ancestors or by hybrid or chimera strains originating from horizontal gene transfers or hybridization events. Since these complexes within CC19 have clearly distinguishable hybridization patterns, they have been referred to herein as CC19/01, CC19/17, CC19/19 and CC19/22, and we assume that they are linked by hybridizations or gene transfers rather than by shared ancestry. Few differences were found between isolates from different origins. The virulence factor scpB was found in 412 of 418 human isolates (98.6%), but only in 10 of 21 bovine isolates (48%). Furthermore, it was observed that invasive isolates are less likely to carry abiGI-/II and Q8DZ34, but are more likely to have pil1 locus, fbsB (515) and capsule type III as well as pil2b, nss/srr and rgf (COH1 like). Some of these markers appear together in CC19/17 strains, which are often observed in invasive disease. speM (exotoxin M) was also investigated. It was detected only in seven isolates. Contrarily, the cyl (beta-hemolysin) operon was found in all isolates. Thus, it detection is not helpful for a prediction of the virulence of a given isolate. No single factor could be identified that allowed a definitive distinction between invasive isolates and carrier isolates. Probably, the virulence of an isolate does not depend on the presence or absence of one particular gene. In this context, it would be important to investigate the expression in vivo of the various putative virulence factors as well as the allelic variants of the factors and of their associated regulatory genes. Macrolide-/clindamycin resistance genes erm(A), erm(B) and erm(C) can also be detected by the microarray. None of these genes was identified in any of the Caribbean isolates. Within the German GBS population, erm(B) was most frequently observed. The genes erm(A) and erm(C) were rare in human isolates, and they were not found in bovine isolates. The tetracycline resistance gene tet(M) was observed frequently in human isolates but only very rarely in veterinary isolates. With the genotyping method that was developed during the present work, further studies can be carried out to study regional and host-specific differences in the GBS population. For future investigations, the described typing method could further be refined. For example, the 11 selected typing markers on the microarray can be combined with those from MLST to one comprehensive marker system. In addition, it is also possible to use genes on mobile genetic elements such as resistance genes (erm, cad, mer or tet) to prove or to rule out the identity of related isolates in vitro or in silico. In our study, it was shown that the DNA microarray provides stable and reproducible results that are comparable to those of other typing methods and genome sequencing. However, since the DNA microarray offers a much more uncomplicated and faster procedure, which also results in lower costs, it is more suitable to a routine setting.:1. Einleitung 5 1.1 Gegenstand der Untersuchung 5 1.2 Entdeckungsgeschichte 6 1.3 Klinische Bedeutung 7 1.4 Veterinärmedizinische Bedeutung 9 1.5 Stand der Forschung mit Hinblick auf Typisierung von GBS 9 1.6 Ziele der vorliegenden Untersuchung 10 1.7 Vorgehensweise 11 1.7.1 Untersuchungsmaterial 11 1.7.2 Untersuchungsmethode 11 1.8 Zur Typisierung ausgewählte Marker 12 2. DNA Microarray-Based Typing of Streptococcus agalactiae Isolates 15 2.1 Abstract 16 2.2 Introduction 17 2.3 Materials and methods 18 2.3.1 Bacterial isolates 18 2.3.2 Ethics statement 18 2.3.3 Preparation of genomic DNA 19 2.3.4 MLST 19 2.3.5 Microarray design and protocol optimization 19 2.3.6 Microarray procedures 20 2.3.7 eBURST 21 2.4 Results 22 2.4.1 Typing GBS by MLST 22 2.4.2 Genotyping GBS by microarray hybridization 22 2.4.3 Population structure 25 2.4.4 Detection of antibiotic resistance markers 25 2.4.5 Detection of heavy metal resistance markers 26 2.5 Discussion 27 2.6 Acknowledgments 30 2.7 References 31 2.8 Tables and figures 33 3. Zusammenfassung 45 3.1 Zusammenfassung 45 3.2 Summary 49 4. Korrespondenz mit dem Editor 53 4.1 Hinweise des Editors und der Gutachter 53 4.2 Antworten an den Editor 56 4.3 Endgültige Annahme 58 Anhang 61

In diese Dissertation, Ich konzentriere mich insbesondere darauf, wie die Artbestimmung in der Gattung Eimeria mit der Wirtsspezifität bei Nagetierarten zusammenhängt. Zunächst bietet diese Arbeit eine Reihe von Methoden zur Beurteilung der Prävalenz auf der Ebene der Parasitenarten in Mus musculus. Als Ergebnis war es möglich, drei verschiedene Eimeria-Spezies zu identifizieren, Mäuse mit Doppelinfektionen zu erkennen und die artenspezifische Prävalenz in Abhängigkeit von der Wirtsdichte vorherzusagen. Zur Identifizierung von Eimeria spp. über verschiedene Wirtsarten hinweg wurde eine neuartige Hochdurchsatz-Multi-Locus-Genotypisierungsmethode etabliert und mit der auf zuvor etablierten Markern basierenden Einzelmarker-Genotypisierung verglichen. Dies bestätigte, dass die Art E. falciformis in einer einzigen Wirtsart, der Hausmaus, vorkommt. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breitem Wirtsspektrum hindeutet. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breiter Wirtsverwendung in einem phylogenetischen Artkonzept schließen lässt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hohe Wirtsspezifität, die traditionell für Eimeria-Parasiten angenommen wird, fragwürdig ist und dass die Identifizierung von Arten durch Wirtsassoziation vermieden werden sollte. Durch molekulare Amplifikation, Sequenzierung, Genotypisierung und phylogenetische Analyse war es möglich, Eimerien auf Artniveau zu identifizieren und die Wirtsspezifität in Isolaten aus natürlichen Systemen in Frage zu stellen. In einer breiteren Perspektive betonte diese Arbeit die Notwendigkeit, Strategien bei der Erkennung, Quantifizierung und Identifizierung von Parasiten zu standardisieren und zu kombinieren, um ein besseres Verständnis auf evolutionärer und ökologischer Ebene zu erlangen. / This PhD thesis combines different approaches for parasite identification to assess the diversity of parasites in natural systems. Particularly, I focus on how species identification in the genus Eimeria is linked to its host specificity in rodent species. First, this thesis provides a set of methods to assess prevalence at the species level in Mus musculus systems. The approach integrates morphological description with molecular methods for detection, niche approximation and phylogenetic reconstruction. As a result, three different Eimeria species were identified, mice with double infections were detected and species-specific prevalence were predicted to be host density-dependent. For identification of Eimeria spp. across different host species, a novel high-throughput multi-locus genotyping was established and compared with single-marker genotyping. The multi-locus genotyping approach provided a higher resolution to distinguish closely related Eimeria isolates. This confirmed the species E. falciformis to have a single host species, the house mice. However, E. vermiformis and E. apionodes could not be distinguished suggesting a single species with broader host usage in a phylogenetic species concept. These findings show that the high host specificity traditionally assumed for Eimeria parasites is questionable, and that identification of species by host association should be avoided. The approaches for identification of Eimeria spp. Developed here allowed differentiation of closely related isolates with indistinguishable morphology. Molecular amplification, sequencing, genotyping and phylogeny allowed the identification of Eimeria at species level and to question host specificity in isolates from natural systems. In a broader perspective, this work emphasised the necessity to standardise and combine strategies in parasite detection, quantification and identification to gain better understanding at an evolutionary and ecological level.

Im Bereich der medikamentösen antidepressiven Therapie ist die Bedeutung von erblichen Polymorphismen arzneistoffmetabolisierender Enzyme bereits in vielen Studien untersucht und gezeigt worden. Die meisten Antidepressiva werden über polymorphe Cytochrom-P450-Enzyme verstoffwechselt. Diese Arbeit befasst sich mit der Fragestellung, ob die Häufigkeitsverteilung der CYP2D6-, CYP2C19- und CYP2C9-Allele in der an Depression erkrankten Studienpopulation sich von der in der Normalbevölkerung unterscheidet und ob Veränderungen in der Pharmakokinetik, wie sie durch Cytochrom-P450-Polymorphismen verursacht werden, unter normalen klinischen Bedingungen Auswirkungen auf die Wirksamkeit der antidepressiven Therapie, die Nebenwirkungsrate und den Verlauf der Erkrankung haben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 334 Patienten auf die häufigsten CYP2D6-Allele (*3,*4,*5,*6 und Duplikation) und CYP2C19- und CYP2C9-Allele *2 und *3 mittels Genotypisierung untersucht. Die Bestimmung der seltener auftretender CYP2D6-Allele (*8,*9,*10,*17,*2 und *41) erfolgte zusätzlich bei 200 Patienten. Die entsprechenden klinischen Fragebögen mit Angaben zur Anamnese, Schwere der Erkrankung, Therapieverlauf und Nebenwirkungsprofil wurden von 233 Patienten in Abhängigkeit des CYP2D6- und CYP2C19-Genotyps ausgewertet. Für die Beurteilung des Langzeittherapieverlaufs standen jedoch deutlich weniger Patientendaten zur Verfügung, so dass die Ergebnisse zum Teil nur für den CYPD6-Genotyp ausgewertet werden konnten. Die genetischen Analysen ergaben, dass die Häufigkeitsverteilung der CYP2D6-, CYP2C19- und CYP2C9-Polymorphismen in der untersuchten Studienpopulation keine signifikante Änderung im Vergleich zur Normalbevölkerung aufwies. Während der Einfluss der CYP2D6-Genotypen auf pharmakokinetische Parameter eindeutig nachgewiesen ist, konnten die Ergebnisse dieser Arbeit weitestgehend keinen Zusammenhang zwischen der Schwere der Depression, der Therapieresponse, der Häufigkeit und Schwere der Nebenwirkungen und dem CYP2D6- und CYP2C19-Genotyp herstellen. / The importance of genetic polymorphisms of drug metablizing enzymes have been already investigated und proved in many studies before. Most of antidepressants are metabolized by cytochrome P450 enzymes. The aim of this study was to determine if there is a difference in the distribution of CYP2D6-, CYP2C19- and CYP2C9-allels in inpatients with major depression in comparison to the healthy population and if changes in the pharmacokinatic, created by cytochrome P450 polymorphisms, can be have effects on the efficacy of antidepressant therapy, rate of intolerable side effects and development of the depression. We examined 334 patients by genotyping for the most important CYP2D6-allels (*3,*4,*6,*5 und duplication) and the CYP2C19- and CYP2C9-allels *2 and *3. Further 200 patients were tested for the more infrequent CYP2D6-allels (*8,*9,*10,*17,*2 and *41). The corresponding clinical questionnaires containing informations about the anamnesis, severity of the desease, therapeutic outcome and intolerable side effects have been evaluated of 233 patients in dependence of the CYP2D6- and CYP2C19-genotype. There were significant less clinical datas for the evaluation of long term therapy response be available, so that the results could be partially only analysed for the CYP2D6-genotype. The genetic analysis detected that the distribution of the CYP2D6-, CYP2C19- and CYP2C9-polymorphismen in the study population didn´t reached significant changes in comparison to the healthy population. While the influence of CYP2D6-genotypes on pharmacokinatic parameters is clear demonstrated, the results of this study mainly couldn´t establish a relation between the severity of depression, therapeutic response, frequency and severity of side effects and the CYP2D6 and CYP2C19-genotype.

Today, thermophilic Campylobacter spp. (besides Salmonella) represent one of the most common sources of human bacterial gastrointestinal infection. The main source of human C. jejuni infections is the consumption of insufficient heated chicken meat. Quantitative data on the occurrence of thermophilic Campylobacter spp. on poultry carcasses and poultry meat are needed to perform quantitative risk assessments and to verify the effect of different intervention strategies. The aims of the investigations presented here were (i) to generate accurate qualitative and quantitative data on the occurrence of Campylobacter spp. on within the primary production stage in at the abattoir and food, (ii) to study the behaviour of nine genotypically different C. jejuni strains in chicken meat juice supplemented with different concentrations of sodium chloride, curing salt and sodium nitrite, (iii) to detect the Campylobacter genotype distribution in poultry flocks by applying AFLP analysis and to describe a potential carry-over of Campylobacter strains among sequential and adjacent poultry flocks. For the above mentioned purposes, a number of samples (171 neck skin samples, 1047 samples of different turkey meat products and 112 turkey minced meat samples from an abattoir) were investigated in accordance with themethod of ISO / TS 10272-2: 2006 and ISO10272-1: 2006 to the quantitative and qualitative presence of Campylobacter spp.. The Campylobacter-strains were inoculated in chicken juice at initial concentrations of 102 and 104 CFU/ml and incubated for 24h at 42°C. Furthermore, 18 flocks of four poultry species were monitored to investigate the distribution and spread of Campylobacter genotypes between sequential and adjacent flocks. Caecal and liver samples were obtained at frequent intervals from birds of all flocks and these samples were examined for Campylobacter. The amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis was performed to genotype Campylobacter isolates. The prevalence of Campylobacter on neck skin was 83.0 % and the mean number was 2.00 log10 cfu/g. For turkey meat samples with skin (wings and thighs) the detected prevalence was 68.2 % and mean number 1.73 log10 cfu/g, respectively. Turkey meat samples without skin (breast filet) showed a prevalence of 79.0 % and a mean number of 1.58 log10 cfu/g. No Campylobacters were detectable in the turkey minced meat samples. Large variations between the detectable numbers of Campylobacter spp. were observed (maximum number up to 3.98 log10 cfu/g for turkey meat with skin) and confirm the importance of an early detection (before or during slaughter and processing) of these heavily contaminated slaughter lots. Whereas the strains multiplied in the media supplemented without additional of NaCl or with 1% NaCl, the bacterial population was significantly reduced when 2% NaCl was added. Growth did not occur and the cell number gradually decreased in chicken meat juice containing 3% NaCl. Significant differences in the survival potential among the different strains were only visible in the extreme condition of 3% NaCl supplementation. There was no different behaviour of the strains under the influence of NaCl compared with the behaviour in meat juice containing curing salt. The addition of sodium nitrite did not alter the survival. Of the 1643 caecal and liver samples investigated, 452 (27.5%) caecal samples and 11 (0.7%) liver samples contained Campylobacter. Of the caecal isolates 76.3% were identified as C. jejuni and 23.7% were identified as C. coli. Poultry flocks were largely colonized by more than one AFLP type and an intense exchange of Campylobacter genotypes between different poultry flocks occurred. The results show clearly that poultry and poultry meat are regarded as one of the main sources of thermophilic Campylobacter spp. infection in humans in the food chain. This is evident not only from the high rate of occurrence of these pathogens, but also from the often-high quantitative exposure samples. The risk of a foodborne infection is also enhanced by the comparatively very low minimum infectious dose for humans. At present, a complete elimination of thermophilic Campylobacter spp. from the food chain appears practically unreachable. This difficulty is reduced by the results of genetic strain diversity, because they suggest the existence of a variety of input sources. / hermophile Campylobacter (C.) spp. stellen heute neben den Salmonellen eine der häufigsten Ursachen für bakteriell bedingte Magen-Darm-Erkrankungen beim Menschen dar. Unzureichend erhitztes Geflügelfleisch und Geflügelfleischprodukte stellen eine der Hauptinfektionsquellen für humane C. jejuni-Infektionen dar. Quantitative Daten über die Belastung von Geflügelkarkassen und Geflügelfleisch mit thermophilen Campylobacter spp. werden benötigt, um einerseits quantitative Risikobewertungen durchführen zu können, andererseits aber auch den Erfolg verschiedener Interventionsmaßnahmen messen zu können. Zur Minderung der Zahl alimentär bedingter humaner Campylobacter-Infektionen spielt neben der Senkung der Campylobacter-Belastung von Nutztieren und der Vermeidung von Kreuzkontaminationen auch die Reduktion des Vorkommens des Erregers in der Lebensmittelkette durch technologische Prozesse eine große Rolle. Campylobacter spp. sind während der Be- und Verarbeitung von Lebensmitteln verschiedensten Stressoren ausgesetzt. Ziele der hier vorgestellten Untersuchungen waren, (i) Exakte qualitative und quantitative Daten zum Vorkommen von Campylobacter spp. in der Primärproduktion, auf dem Schlachthof und in Lebensmitteln zu ermitteln. (ii) Die Tenazität ausgewählter, genetisch unterschiedlicher C. jejuni-Stämme gegenüber verschiedenen Natriumchlorid-, Pökelsalz- und Natriumnitrit-Konzentrationen im Geflügelfleischsaftmodell zu untersuchen. (iii) Die Verwandtschaftsgrade der isolierten Stämme mit Hilfe einer molekularbiologischen Fingerprintingmethode (AFLP-Typisierung) darzustellen sowie das Vorkommen von thermophilen Campylobacter in verschiedenen Geflügelarten in einem Betrieb zu ermitteln. Dazu wurden 171 Halshautproben, 783 Proben verschiedener Putenfleischerzeugnisse und 233 Putenhackfleischproben aus einem Schlacht- und Zerlegebetrieb in Anlehnung an die Methode ISO/TS 10272-2: 2006 und ISO10272-1:2006 auf das quantitative und qualitative Vorkommen von Campylobacter spp. untersucht. Der Keimzahlverlauf wurde in experimentell kontaminiertem Geflügelfleischsaft (Zusatz von C. jejuni: 102 und 104 KbE/ml) über einen Zeitraum von 24 h (Bebrütungstemperatur 37°C) untersucht. 19 verschiedene Wirtschaftsgeflügel-Herden wurden untersucht, um die Verteilung und Ausbreitung von Campylobater-Genotypen zwischen sequentiellen und angrenzenden Herden festzustellen. Blinddarm- und Leber-Proben wurden in kurzen Abständen von Vögeln aller Herden gewonnen und untersucht . Für die Genotypisierung von Campylobacter spp. wurde die AFLP-Methode eingesetzt. Im Ergebnis wurden auf 83,0 % der Halshautproben Campylobacter spp. nachgewiesen, wobei der Mittelwert der quantitativen Belastung von Putenhalshautproben bei 2,00 log10 KbE/g lag. Putenfleischproben mit Haut waren zu 54,8 % Campylobacter positiv. Hier betrug die quantitative Belastung 1,79 log10 KbE/g. Bei Putenfleisch ohne Haut lagen die Nachweisraten bei 52,2,% bzw. 2,03 log10 KbE/g. In keiner der Putenhackfleischproben war Campylobacter nachweisbar. Große Schwankungen in der quantitativen Belastung (Maximalwerte bis 4,0 log10 KbE/g bei Putenfleisch mit Haut) bestätigen die Notwendigkeit, vor allem die stark belasteten Schlachtpartien schon vor bzw. während der Schlachtung und Verarbeitung identifizieren zu können. In Geflügelfleischsaft ohne bzw. mit Zusatz von 1% NaCl konnten sich alle Stämme vermehren, während das Wachstum bei 2% NaCl-Zusatz gehemmt wurde. Darüber hinaus konnte bei höherer NaCl-Konzentration (3%) eine Reduktion der Keimzahl nach 6 h Bebrütung bzw. ein Absterben von C.jejuni nach 24 h festgestellt werden. Dabei zeigten die Stämme im Geflügelfleischsaft mit 3% NaCl-Zusatz signifikante Unterschiede in ihrer Absterberate. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedlich ausgeprägte Salztoleranzen innerhalb der untersuchten Stämme mit unterschiedlichem Genotyp existieren, diese jedoch nur unter Extremsituationen signifikant ausgeprägt waren. Durch die Zugabe von praxisüblichen Pökelsalzkonzentrationen anstelle von Kochsalz und von Natriumnitrit konnte das Verhalten von C. jejuni in keinem Versuchsansatz beeinflusst werden. 452 Caecalproben (27,5%) und 11 Leberproben (0,7%) von insgesamt 1643 Caecal- und Leberproben wurden positiv auf Campylobacter spp. getestet. Von den 1643 aus dem Caecum stammenden getesteten Isolaten wurden 76,3% der Isolate als C. jejuni und (23,7%) der Isolate als C. coli identifiziert. Die AFLP- Analyse zeigte einen signifikanten Unterschied in der Diversität der AFLP-Typen aus den individuellen Herden und Proben aus unterschiedlichen Herden. Dies deutet auf eine große Zahl von Infektionsquellen hin. Die Ergebnisse belegen insgesamt sehr deutlich, dass Geflügel- Geflügelfleisch eine bedeutsame Quelle des Eintrags von Campylobacter-Keimen in die Nahrungskette ist. Das geht nicht nur aus der hohen Rate des Vorkommens dieser Erreger hervor, sondern auch aus der oftmals hohen quantitativen Belastung der Proben. Das Risiko einer Lebensmittelinfektion wird zudem durch die vergleichsweise sehr geringe minimale Infektionsdosis für den Menschen erhöht. Eine vollständige Elimination von thermophilen Campylobacter spp. aus der Lebensmittelkette erscheint derzeit praktisch nicht erreichbar. Diese Schwierigkeit wird durch die Ergebnisse zur genetischen Stammdiversität untersetzt, denn sie legen die Existenz einer Vielzahl unterschiedlicher Eintragsquellen nahe.

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Short interspersed nuclear elements (SINEs) are small non-autonomous and heterogeneous retrotransposons, widespread in animals and plants and usually differentially propagated in related species resulting in genome-specific copy numbers. Within the monocots, the Poaceae (sweet grasses) is the largest and economically most important plant family. The distribution of 24 Poaceae SINE (PoaS) families, five of which showing a subfamily structure, was analyzed in five important cereals (Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Zea mays), the energy crop Panicum virgatum and the model grass Brachypodium distachyon. The comparative investigation of SINE abundance and sequence diversity within Poaceae species provides insights into their species‐specific diversification and amplification. The PoaS families and subfamilies fall into two length and structural categories: simple SINEs of up to 180 bp and dimeric SINEs larger than 240 bp. Of 24 PoaS families, 20 are structurally related across species, in particular either in their 5′ or 3′ regions. Hence, reshuffling between SINEs, likely caused by nested insertions of full-lengh and truncated copies, is an important evolutionary mechanism of SINE formation. Most striking, the recently evolved homodimeric SINE family PoaS‐XIV occurs exclusively in wheat (T. aestivum) and consists of two tandemly arranged PoaS‐X.1 copies. Exemplary for deciduous tree species, the evolutionary history of SINE populations was examined in six Salicaceae genomes (Populus deltoides, Populus euphratica, Populus tremula, Populus tremuloides, Populus trichocarpa, Salix purpurea). Four of eleven Salicaceae SINE (SaliS) families exhibit a subfamily organization. The SaliS families consist of two groups, differing in their phylogenetic distribution pattern, sequence similarity and 3’ end structure. These groups probably emerged at different evolutionary periods of time: during the ‘salicoid duplication’ (~ 65 million years ago) in the Salix-Populus progenitor, and during the separation of the genus Salix (~ 45 - 65 million years ago), respectively. Similar to the PoaS families, the majority of the 20 SaliS families and subfamilies share regions of sequence similarity, providing evidence for SINE emergence by reshuffling. Furthermore, they also contain an evolutionarily young dimeric SINE family (SaliS-V), amplified only in two poplar genomes. The special feature of the Salicaceae SINEs is the contrast of the conservation of 5’ start motifs across species and SINE families compared to the high variability of 3’ ends within the SINE families, differing in sequence and length, presumably resulting from mutations in the poly(A) tail as a possible route for SINE elongation. Periods of increased transpositional activity promote the dissemination of novel 3’ ends. Thereby, evolutionarily older motifs are displaced leading to various 3’ end subpopulations within the SaliS families. Opposed to the PoaS families with a largely equal ratio of poly(A) to poly(T) tail SINEs, the SaliS families are exclusively terminated by adenine stretches. Among retrotransposon-based markers, SINEs are highly suitable for the development of molecular markers due to their unidirectional insertion and random distribution mainly in euchromatic genome regions, together with an easy and fast detection of the heterogeneous SINE families. As a prerequisite for the development of SINE-derived inter-SINE amplified polymorphism (ISAP) markers, 13 novel Theaceae SINE families (TheaS-I - TheaS-VII, TheaS-VIII.1 and TheaS-VIII.2, TheaS-IX - TheaS-XIII) were identified in the angiosperm tree species Camellia japonica. Moreover, six Pinaceae SINE families (PinS-I.1 and PinS-I.2, PinS-II – PinS-VI) were detected in the gymnosperm species Larix decidua. Compared to the SaliS and PoaS families, structural relationships are less frequent within the TheaS families and absent in the PinS families. The ISAP analysis revealed the genetic identity of Europe’s oldest historical camellia (C. japonica) trees indicating their vegetative propagation from the same ancestor specimen, which was probably the first living camellia on European ground introduced to England within the 18th century. Historical sources locate the native origin of this ancestral camellia specimen either in the Chinese province Yunnan or at the Japanese Gotō Islands. Comparative ISAPs showed no accordance to the Gotō camellia sample pool and appropriate Chinese reference samples were not available. However, the initial experiments demonstrated the potential of ISAP to resolve variations among natural populations. The ISAP application on angiosperm trees also concerned fast growing Populus clones grown in short rotation coppice plantations for energy production. The species-specific P. tremula ISAP primers might also be applied for the discrimination of hybrid poplar clones involving P. tremuloides genome portions, since SINEs of these two species are highly related. However, due to lineage-specific SINE evolution during speciation, cross-species applications are generally only successful to limited extent. The analysis of poplar hybrids composed of P. maximowiczii with either P. trichocarpa or P. nigra based on P. tremula ISAP primers showed a strongly reduced resolution. In forestry, hybrid larch (e.g. Larix × eurolepis) genotypes have to be selected from the offspring of Japanese (Larix kaempferi) and European larch (Larix decidua) crosses, as they exhibit superior growth rates compared to the parental species. Initial ISAP-based examinations of European larch genotypes provided less polymorphic banding patterns, probably resulting from general high levels of synteny and collinearities reported for gymnosperm species. Hence, the ISAP was combined with the AFLP technique to the novel marker system inter-SINE-restriction site amplified polymorphism (ISRAP). The amplicons originating from genomic regions between SINEs and EcoRI cleavage sites were visualized with the sensitive capillary gel electrophoresis. The ISRAP assays, based on EcoRI adapter primers combined with two different SINE-derived primers, resulted in a sufficient number of polymorphic peaks to distinguish the L. decidua genotypes investigated. Compared to ISAPs, the ISRAP approach provides the required resolution to differentiate highly similar larch genotypes.