O caranguejo de mangue Ucides cordatus é um forte hiper-hipo-osmorregulador que se encontra iso-osmótico ao ambiente na salinidade próxima a 20‰. A osmorregulação é realizada por diversos órgãos, mas principalmente pelas brânquias posteriores, enquanto as brânquias anteriores relacionam-se com a respiração. A regulação iônica é feita por muitas enzimas, sendo a principal a Na+-K+-ATPase (NKA). Tal enzima pode variar sua atividade em diversas condições ambientais, como a salinidade e/ou temperatura; é alterada por características físicas das membranas, como fluidez; e também modulada por ácidos graxos de fosfolipídios de membrana encontrados nas brânquias. O objetivo deste trabalho foi elucidar a conformação dos fosfolipídios de membrana, no que tange aos ácidos graxos destes, em animais submetidos a diferentes salinidades. Os caranguejos foram divididos e submetidos a três situações (n=4 por grupo): controle /iso-osmótico (salinidade 20‰), hipo-osmótico (10‰) e hiper-osmótico (30‰). Um grupo de animais foi exposto a um período de curto prazo (6 horas) e outro grupo a um período de 120 horas. As brânquias foram removidas e as frações lipídicas extraídas para configurar o perfil de ácidos graxos. Após montado o perfil das classes dos ácidos graxos, os mesmos foram determinados por cromatografia gasosa. A atividade específica da NKA foi mensurada com base na diferença entre a taxa de liberação de fosfato a partir de ATP. Os resultados mostraram um aumento dos ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) sob o estresse hipo-osmótico em brânquias posteriores em ambas as frações, fosfatidilcolina (FC) e fosfatidiletanolamina (FE), em animais submetidos ao tratamento de 120 horas. PUFA tende a aumentar a fluidez de membrana, portanto, nesta condição a membrana talvez estivesse sob tal estado, mais permeável. No estresse hiper-osmótico, por outro lado, o FE de brânquias posteriores mostrou um aumento dos ácidos graxos saturados em animais também expostos a 120 horas. Tais ácidos graxos fazem com que a conformação da membrana se torne menos fluida, e menos permeável a solutos. Não houve diferença no perfil de ácidos graxos para animais expostos a 6 horas em diferentes salinidades. A atividade da NKA variou entre as diferentes exposições. / The mangrove\'s crab Ucides cordatus is a good hyper-hyposmoregulator that is isosmotic in a 20‰ salinity environment. The osmoregulation is performed by many organs, however the most important structure is the posterior gills. On the other hand, anterior gills are related to breathing. Ionic regulation is performed by several pumps, primarily by Na+-K+-ATPase (NKA). This enzyme performs its role due to environmental conditions such as salinity and/or temperature, but also to membrane\'s physics characteristics such as fluidity and composition of fatty acids. The purpose of this study was to evaluate the membrane\'s conformation in relation to fatty acids of phospholipids, when acclimated to different salinities. The crabs were divided into three groups (n = 4 per group): isosmotic/control (20‰ salinity), hyposmotic (10‰ salinity) and hyperosmotic (30‰ salinity). A group of animals were exposed to a short-term period (6 hours) and another group to a long-term period (120 hours). The gills were removed and their total lipids was extracted to set up the fatty acids profile (phospholipid class). The fatty acids profile were determined as phospholipid class by gas chromatography. The specific activity of NKA was based upon measurement of the phosphate released through the breakdown of ATP. The results showed that phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylcoline (PC) from posterior gills exposed to 10‰ salinity for long-term had significantly higher levels of polyunsaturated fatty acids (PUFA). PUFA tends to increase membrane\'s fluidity, thus in the hyposmotic stressful situation, the membrane\'s conformation could be more fluid. When exposed to 30‰ salinity for long term, the PE of posterior gills showed increased levels of saturated fatty acids that implies in a less fluid membrane\'s conformation. There were no significant differences among fatty acids of phospholipids in gills of crabs exposed to a short-term period (6 hours). The specific activity of NKA ranged among the different salinities.

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Abiotic factors such as pH, ionic strength, water hardness may change the chemical aggregation of NPs as well as the bioavailability of metals in waters result of speciation and /or complexation with other compounds. Considering the pH variations can occur in the environment naturally or as a result of ecological accidents and the increasing use of NP-TiO2 in many different industries, this study aimed to determine the CL-50; 48 hours of NPTiO2 in different pH (acidic, neutral and basic) in juvenile Prochilodus lineatus (curimbatá) and evaluating the effects of exposure to sublethal NP-TiO2 these pH using biochemical, physiological and morphological biomarkers. After sensitivity test with KCl, the animals were tested with different concentrations of NP-TiO2 at pH 5.0, 7.0 and 8.0 for 48 hours to determine the CL-50; 48h. Subsequently, the animals were exposed to 1 mg L-1 NP-TiO2 for 48 hours at different pH. After the exposure period, blood samples were obtained via caudal puncture for ion plasma analysis and hematologic variables, and samples of gills were collected and fixed. The analytical characterization of NP-TiO2 suggest the aggregation ability are modified of the NP at different pH and at pH 5.0, the hydrodynamic diameter of the NP is much larger then the others pH, which may have create difficults for the entry of NP in organisms and caused less damage. The NP-TiO2 were considered non-toxic in pH 5,0, 7,0 and 8,0. Exposure to NP-TiO2 pH 5.0 and ionic imbalance caused in the exposed animals, possibly due to changes in the concentration of Cl- ions. Exposure to pH 5.0 and 8.0 and NP-TiO2 at pH 7.0 inhibited AC enzyme. In animals exposed to NP at pH 5.0 were not identified cloride cells with crypt surface, possibly due the blocking of these surfaces by the large NP aggregates. Changes in concentrations of ROS and SOD, CAT and GCL activity may indicate an imbalance in antioxidant system due to different pH and NPTiO2 exposure. NP exposure caused major damage at pH 7.0, where have lower hydrodynamic diameter , supporting the hypothesis that the smaller the size of the cluster,it’s easier the NP enter the body of the exposed animals. / As nanopartículas de dióxido de titânio (NP-TiO2) têm alcançado os ecossistemas aquáticos através de diferentes fontes, como esgotos e lixiviação das culturas agrícolas. Fatores abióticos como pH, força iônica, dureza da água podem alterar a agregação química das NPs e a biodisponibilidade de metais nas águas. Considerando as variações de pH que podem ocorrer no ambiente, naturalmente ou não, e a crescente utilização de NP-TiO2 nos mais diferentes segmentos industriais, o presente estudo teve por objetivo determinar a CL-50;48h das NP-TiO2 em diferentes pH (ácido, neutro e básico) em juvenis de Prochilodus lineatus (curimbatá) e avaliar os efeitos da exposição subletal a NP-TiO2 nesses pH, utilizando biomarcadores bioquímicos, fisiológicos e morfológicos. Após a realização do teste de sensibilidade com KCl, os animais foram submetidos a testes com diferentes concentrações de NP-TiO2 nos pH 5,0, 7,0 e 8,0 durante 48h para determinar a CL-50;48h. Posteriormente, os animais foram expostos à concentração de 1 mg L-1 de NP-TiO2 durante 48h nos diferentes pH. Após a exposição, amostras de sangue e de brânquias foram coletadas. Análises de caracterização das NP-TiO2 sugerem que em diferentes pH a capacidade de agregação das NP se modificam e que em pH 5,0, o diâmetro hidrodinâmico das NP é maior em relação aos outros pH, o que pode ter dificultado a entrada das NP nos organismos e causado danos menores. As NP-TiO2 foram consideradas não-tóxicas nos diferentes pH. A exposição a NP-TiO2 e a pH 5,0 causou desequilíbrio iônico nos animais expostos, possivelmente em função das alterações na concentração de Cl-. A exposição a pH 5,0 e 8,0 e a NP-TiO2 em pH 7,0 inibiu a enzima anidrase carbônica. Nos animais expostos a NP em pH 5,0 não foram identificadas CC em cripta, possivelmente devido ao bloqueio das superfícies dessas CC pelos grandes agregados de NP. As alterações nas concentrações de espécies reativas de oxigênio e da atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase e glutamato cisteína ligase podem indicar um desequilíbrio no sistema antioxidante. A exposição as NP causou danos maiores em pH 7,0, onde os agregados apresentam diâmetro hidrodinâmico menor, corroborando com a hipótese de que quanto menor o tamanho dos aglomerado, maior a facilidade das NP entrarem no organismo dos animais expostos.

O município de Bom Repouso, região da nascente do rio Mogi-Guaçu, está localizado a sudoeste do Estado de Minas Gerais, sendo reconhecido nacionalmente pela produção de morango - o município é responsável por 40% da produção nacional - e batata inglesa - o Estado é o primeiro produtor nacional desta cultura. Esses cultivos, porém, geram impactos ambientais em função do uso excessivo de agrotóxicos. Considerando que tais produtos podem se acumular no solo e serem carreados para o ambiente aquático, cujos efeitos danosos podem se estender aos organismos aquáticos, o objetivo deste trabalho foi avaliar os impactos causados pelos agrotóxicos em sistemas naturais, por meio de análises físicas e químicas e da realização de bioensaios ecotoxicológicos com amostras de solo provenientes das duas principais culturas desenvolvidas na região (morango e batata), utilizando-se como organismos-teste juvenis da espécie Danio rerio (Cypriniformes, Cyprinidae). Os resultados mostram que a região sofre com o impacto das lavouras em função não apenas da utilização de agrotóxicos, mas também pelo uso de fertilizantes. Os bioensaios revelaram baixa toxicidade das amostras, porém efeitos sobre o crescimento e alterações histolpatológicas nas brânquias foram observados nos organismos submetidos aos testes. As alterações histológicas foram, em geral, relacionadas à proliferação celular, dilatação de capilares, deslocamento de epitélio branquial, além de aneurismas e fusão de lamelas. / Bom Repouso, region of Mogi-Guaçu river riverhead, is located in the southwest of Minas Gerais State, in Brazil, is widely recognized by the production of strawberry - the municipality is responsible for 40% of the national production - and potato - the State is the first national producer of this culture. However, the intensive use of pesticides in these cultures creates several environmental impacts. Considering that such products can be accumulated in the soil and carried into the aquatic environment, with hazardous effects being extended to the aquatic organisms, the aim of this study was to evaluate the impacts caused by these pesticides in natural systems. Physical and chemical analysis were made, as well as bioassays with soil samples proceeding from the two main cultures (strawberry and potato), using Danio rerio (Cypriniformes, Cyprinidae) juveniles as test-organisms. The results showed that the Mogi-Guaçu basin suffers not only due pesticides applications, but also due to the fertilizer use. The bioassays revealed low toxicity of the samples. Despite of it, some negative effects in the growth and histopathological alterations in the gills were observed in the organisms submitted to the tests.

Os crustáceos são originariamente marinhos; ao longo da evolução, diversas espécies invadiram ambientes de salinidades menores, chegando à água doce. A capacidade dos crustáceos colonizarem com sucesso o ambiente dulcícola depende do desenvolvimento de mecanismos eficientes de hiperosmorregulação. A osmolalidade e a composição iônica da hemolinfa de um crustáceo, em meios diluídos, refletem o equilíbrio dinâmico entre a perda de íons por difusão e pela urina e sua reabsorção do meio externo, através das brânquias. A (Na,K)-ATPase branquial desempenha um papel chave no processo de captura de Na+ a partir de ambientes diluídos e suas características cinéticas vem sendo investigadas recentemente, embora as enzimas de caranguejos dulcícolas sejam pouco conhecidas. Segundo o modelo atual, a afinidade por Na+ é o parâmetro cinético mais variável entre as enzimas de diferentes espécies, refletindo a salinidade do habitat do animal, de modo que enzimas de espécies bem adaptadas à água doce apresentam afinidades maiores por Na+. Entretanto, vários resultados conflitantes têm sido relatados nos últimos anos. Recentemente, foi proposto que uma V-ATPase também desempenha papel essencial na captação de Na+ através das brânquias dos crustáceos dulcícolas. Esta enzima ainda é praticamente desconhecida: suas características cinéticas não foram estudadas e a relação entre a magnitude da sua atividade e a salinidade do meio externo não está estabelecida. Este projeto teve por objetivo a caracterização das enzimas (Na,K)-ATPase e V-ATPase das brânquias posteriores do caranguejo hololimnético Dilocarcinus pagei, considerado um antigo invasor da água doce. A (Na,K)-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce, a fim de comparar suas propriedades cinéticas com aquelas das enzimas de outras espécies de caranguejos, habitantes de meios mais salinos, visando melhorar o entendimento das adaptações bioquímicas associadas à invasão da água doce. A V-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce ou expostos por diferentes intervalos de tempo à salinidade de 21‰ ou ainda aclimatados por 10 dias a diferentes salinidades (5-21‰), visando estabelecer uma relação entre a magnitude da atividade e a salinidade do meio, além de investigar os mecanismos de regulação da atividade da enzima. A análise da fração microsomal branquial de D. pagei mantido em água doce em gradiente contínuo de sacarose mostrou dois picos protéicos (25-35% e 35-45% de sacarose), ambos com atividades K+-fosfatase, (Na,K)-ATPase e V-ATPase. Estes resultados indicam a presença de frações de membrana com densidades distintas, apresentando, em ambos os casos, as principais bombas de íons envolvidas na captação de Na+. Estas membranas podem ser originárias de locais distintos do epitélio branquial posterior assimétrico deste caranguejo. A análise por Western blotting revelou duas bandas imunoespecíficas (Mr 116 kDa e 105 kDa) correspondentes à subunidade α da (Na,K)-ATPase, sugerindo a presença de duas isoformas nas brânquias posteriores do animal. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase pelo PNFF envolveu interações sítio-sítio (nH= 1,4), com V= 43,4 ± 2,2 U mg-1 e K0,5= 1,13 ± 0,06 mmol L-1. A estimulação da atividade da enzima por K+ (V= 39,9 ± 1,9 U mg-1 e K0,5= 4,2 ± 0,2 mmol L-1), Mg2+ (V= 45,0 ± 2,2 U mg-1, K0,5= 0,82 ± 0,04 mmol L-1) e NH4+ (V= 31,7 ± 1,6 U mg-1, K0,5= 19,0 ± 0,9 mmol L-1) também ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente da enzima pelo PNFF e Mg2+ foi similar às relatadas para enzimas de outros crustáceos, incluindo caranguejos habitantes de meios mais salinos. Entretanto, a enzima de D. pagei apresentou menor afinidade aparente por íons K+ que as outras espécies já estudadas. A atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce foi estimulada sinergicamente por K+ e NH4+ sugerindo a presença de dois sítios de ligação para estes íons na molécula da enzima. Ouabaína (4 mmol L-1) inibiu a atividade PNFFase total da preparação (≈ 89%), por meio de uma curva monofásica (KI= 225,6, ± 11,3 µ mol L-1), sugerindo que, se presentes na fração microsomal, as duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase apresentam sensibilidades próximas para o inibidor. Ortovanadato (1µmol L-1) inibiu 95% da atividade PNFFase total por meio de uma curva bifásica, reforçando a sugestão da presença de duas isoenzimas na preparação. A hidrólise do ATP pela (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce ocorreu em sítios de alta (V= 6,4 ± 0,32 U mg-1 e K0,5 = 0,34 ± 0,02 µmol L-1) e baixa afinidade (V= 127,1 ± 6,2 U mg-1e KM = 84 ± 4,1 µmol L-1). Não foi encontrada uma correlação direta entre a afinidade pelo ATP e o habitat de diferentes espécies de caranguejos. A atividade (Na,K)-ATPase específica de D. pagei mantido em água doce foi cerca de 3 vezes menor que relatada para Potamon edulis, única espécie de caranguejo dulcícola para a qual este parâmetro foi relatado. Atividades específicas muito maiores foram encontradas para caranguejos estuarinos, particularmente quando aclimatados a salinidades baixas. A baixa atividade específica determinada para D. pagei pode ser atribuída ao baixo gradiente osmoiônico que este animal mantém entre a hemolinfa e o meio externo, comparado a outros caranguejos dulcícolas, que o caracteriza como uma espécie particularmente bem adaptada ao ambiente dulcícola. A estimulação da atividade da enzima por íons Na+ (V = 133,8 ± 7,3 U mg-1e K0,5= 4,7 ± 0,3 mmol L-1), Mg2+ (V= 136,5 ± 8,0 U mg-1, K0,5= 0,62 ± 0,04 mmol L-1), K+ (V = 131,7± 7,9 U mg-1 e K0,5= 0,47 ± 0,03 mmol L-1) e NH4+ (V= 125,6 ± 6,3 U mg-1, K0,5= 1,90 ± 0,09 mmol L-1) ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente por Na+ da enzima de D. pagei é baixa, se comparada às relatadas para outros animais dulcícolas, e similar às encontradas para espécies estuarino/marinhas. Em contraste, a afinidade aparente por K+ é 2,5 a 5 vezes maior que as determinadas para espécies habitantes de meios mais salinos e aparentemente está mais relacionada ao habitat do animal que a afinidade por Na+. Esta possibilidade é coerente com o fato da (Na,K)-ATPase branquial dos crustáceos apresentar os sítios de ligação de K+ expostos para a hemolinfa, o que possibilita a modulação da atividade da enzima pela concentração de K+ na hemolinfa. Ao contrário do observado para várias outras espécies de caranguejos, a atividade (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei não foi estimulada sinergisticamente por K+ e NH4+. Entretanto, a presença de um dos íons no meio reacional provoca o aumento da afinidade aparente da enzima pelo outro em cerca de 3 vezes. Fisiologicamente, esta característica cinética pode ser importante para garantir o transporte de ambos os íons pela enzima, mesmo em presença de concentrações relativamente elevadas do outro. Ouabaína (3 mmol L-1) inibiu a atividade ATPase total (≈ 78%) por meio de uma curva bifásica (KI= 6,21 ± 0,32 µmol L-1 e 101,2 ± 5,1 µmol L-1), reforçando os resultados anteriores no sentido de demonstrar a existência de duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei. Observou-se também uma inibição bifásica por ortovanadato (10 µmol L-1), que inibiu a atividade ATPase total em 85%. O pH ótimo para a atividade V-ATPase branquial de D. pagei foi de 7,5. A modulação da atividade V-ATPase do animal mantido em água doce por ATP (V= 26,5 ± 1,3 U mg-1; K0,5= 3,9 ± 0,2 mmol L-1) e Mg2+ (V = 27,9 ± 1,4 U mg-1; K0,5 =0,80 ± 0,04 mmol L-1) ocorreu por meio de interações cooperativas. Já a inibição da atividade ATPase insensível ao ortovanadato por bafilomicina A1 ocorreu segundo uma curva monofásica (KI= 55,0 ± 2,8 nmol L-1). Cerca de 44 % da atividade ATPase total foi inibida, correspondendo à V-ATPase. A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21‰. Após 1h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o que indica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21‰, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre 1h e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e Mg2+ (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21‰. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina A1. Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em V1 (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e Mg2+) quanto V0 (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por Mg2+ e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após 1h de exposição, este mecanismo parece ser independente da expressão protéica e, portanto, não estaria relacionado à expressão de isoformas diferentes de alguma das subunidades da enzima. A diminuição da atividade V-ATPase branquial de D. pagei em resposta à exposição a uma salinidade elevada é compatível com os mecanismos propostos para a atuação desta enzima no processo de captura ativa de Na+ em crustáceos dulcícolas. Após 10 dias de aclimatação ainda se tem atividade V-ATPase detectável nas frações microsomais das brânquias posteriores do animal, possivelmente envolvida nas funções de regulação ácido-base e excreção de amônia. Os resultados obtidos para a aclimatação de D. pagei por um período de 10 dias a salinidades entre 5 e 21‰ mostraram também uma diminuição acentuada da atividade V-ATPase em resposta ao aumento da salinidade. Entretanto, com exceção da salinidade mais baixa (5‰) não se observou aumento da afinidade da enzima por bafilomicina, sugerindo que esta alteração seja limitada a tempos de aclimatação mais curtos. Entretanto, também se verificou um aumento acentuado da afinidade da enzima por ATP e Mg2+. / Crustacean arose in the sea but, during evolution, several species invaded lower salinity biotopes, reaching fresh water. The ability of crustaceans to successfully colonize the freshwater biotope depends on efficient mechanisms of hyperosmoregulation. In dilute media, crustaceans\' hemolymph osmolality and ionic composition reflect a balance between diffusive and urinary ion losses, and active ion capture through the gills. The gill (Na,K)- ATPase plays a pivotal role in Na+ capture from dilute environments and its kinetic characteristics are under investigation in recent years, although freshwater crab enzymes are poorly known. According to the most recent model, the apparent affinity for Na+ is the most variable kinetic parameter among gill enzymes from different species, and reflects the salinity of the species\' habitat. Thus, enzymes from species which are well adapted to freshwater usually present higher affinities for Na+. However, several recent results are incompatible with this model. On the other hand, it has been proposed that a V-ATPase is also involved in Na+ capture through the gills of hololimnetic crustaceans. This enzyme is almost completely unknown: its kinetic characteristics have not been studied yet and the relationship between the magnitude of its activity in the gills and the external medium salinity has not been established. This work aimed to characterize the (Na,K)-ATPase and V-ATPase from the posterior gill from the holimnetic crab Dilocarcinus pagei, considered an old fresh water colonizer. The (Na,K)- ATPase was characterized in animals maintained in fresh water, in order to establish a comparison of its kinetic properties with those of enzymes from other crab species that inhabit more saline media. This comparison may enhance our understanding of the biochemical adaptations associated to fresh water invasion. V-ATPase was characterized in animals kept in fresh water or exposed for varying time intervals to a medium of 21? salinity, or else acclimated for 10 days to media of different salinities (5-21?), aiming to establish a relationship between the enzyme specific activity in the gill tissue and the external salinity, and also investigate the mechanisms involved in enzyme activity regulation. The analysis of D. pagei gill microsomes in a continuous-density sucrose gradient revealed two protein peaks (25-35% and 35-45% sucrose), both showing K+-phosphatase, (Na,K)-ATPase and V-ATPase activities. These results indicate the presence of membrane fractions of distinct densities, both presenting the main ion pumps involved in Na+ capture. These membranes may originate from different places in the asymmetric posterior gill epithelium from this crab. Western compared to those reported for other freshwater animals, but similar to those found for estuarine/marine species. In contrast, the apparent affinity for K+ is 2.5 to 5-fold higher than those estimated for species that inhabit more saline media, and is apparently more related to the animals\' habitat than Na+ affinity. This possibility is consistent with the location of the (Na,K)-ATPase in crabs gill tissue, with K+ binding sites exposed to the hemolymph, allowing the direct modulation of enzyme activity by hemolymph K+ concentration. In contrast to data reported for other crab species, D. pagei gill (Na,K)-ATPase activity was not synergistically stimulated by K+ and NH4 +. However, the presence of one of these ions in the reaction medium results in an increase of about 3-fold in the apparent affinity of the enzyme for the other. This kinetic characteristic may be physiologically relevant to assure the transport of both ions, even in the presence of elevated concentrations of the other. Ouabain (3 mmol L-1) inhibited total ATPase activity (? 78%) through a biphasic curve (KI= 6.21 ± 0.32 mol L-1 and 101.2 ± 5.1 mol L-1) reinforcing previous results suggesting the presence of two isoenzymes in the microsomal preparations. A biphasic inhibition by orthovanadate (10 mol L-1) to about 15% residual activity was also observed. Optimal pH for D. pagei gill V-ATPase activity was 7.5. The modulation of enzyme activity of the animal kept in fresh water by ATP (V= 26.5 ± 1.3 U mg-1; K0.5= 3.9 ± 0.2 mmol L-1) and Mg2+ (V = 27.9 ± 1.4 U mg-1; K0.5 =0.80 ± 0.04 mmol L-1) occurred with positive cooperativity. The inhibition of the orthovanadate insensitive ATPase activity by bafilomycin A1 followed a monophasic curve (KI= 55.0 ± 2.8 nmol L-1). About 44 % of total ATPase activity was inhibited, corresponding to the V-ATPase. Dilocarcinus pagei gill V-ATPase activity substantially decreased in response to animal\'s exposure to 21? salinity. After 1h exposure, the activity diminished about 3-fold, reaching 4- fold after 24h, indicating the action of efficient short-time regulation mechanisms. Interestingly, V-ATPase activity was about 2-fold higher after 120h exposure, compared to 24h, although 2- fold lower compared to that estimated in fresh water. After 240h, the activity returned to the low levels observed for 1 and 24 h, indicating efficient long-term regulation. Besides the decrease in specific activity, it was also observed an increase in enzyme\'s apparent affinity for ATP (12 fold) and Mg2+ (3 fold) in response to animal\'s exposure to 21? salinity. Simultaneously, the enzyme\'s affinity for bafilomycin A1 increased up to 190-fold. We propose that, in response to salinity alteration, conformational changes take place both in V1 (in which the ATP and Mg2+ binding sites are located) and V0 (which contains the bafilomycin A1 bindind site), resulting in higher exposition of the inhibitor binding site and also higher affinity for Mg2+ and ATP. As the affinity increases are observed after just 1h exposure, this regulatory mechanism seems to be independent of protein expression and, thus, should not be related to the expression of distinct isoforms of some enzyme subunit. The lowering of gill V-ATPase activity in D. pagei in response to exposure to an elevated salinity is consistent with the mechanisms proposed for the role of this enzyme in active Na+ capture in hololimnetic crustaceans. After 10 days at 21, the gill microsomal fractions still show a little V-ATPase activity, possibly related to acid-base regulation and ammonia excretion processes. The results obtained for the acclimation of D. pagei for 10 days at salinities in the range 5 to 21? also showed a substantial decrease of V-ATPase activity in response to the increase in medium salinity. However, except for 5?, it was not observed an increase of enzyme\'s affinity for bafilomycin, suggesting that this alteration is limited to shorter periods of exposure. However, a significant increase in the enzyme\'s affinity for ATP and Mg2+ was also observed.

A avaliação da qualidade da água do rio Piracicaba foi realizada utilizando diferentes metodologias e organismos teste, e para tanto, de fevereiro de 2011 a janeiro de 2012 amostras de água foram coletadas em seis locais de amostragens ao longo do rio Piracicaba. Parâmetros físicos e químicos da água foram mensurados e de acordo com a condutividade elétrica e demanda bioquímica de oxigênio, baixa qualidade foi observada em locais próximos a Americana e Piracicaba. Efeitos sobre a reprodução de Ceriodaphnia dubia e Ceriodaphnia silvestrii foram observados em fevereiro e março de 2011 e janeiro de 2012, e ocorreram em amostras coletadas próximas às cidades de Americana e Piracicaba. A avaliação das brânquias do peixe Danio rerio mostrou que para todos os meses, exceto fevereiro, setembro e outubro para alguns pontos, as alterações não foram significativas. Amostras de água coletada em todos os locais, assim como em todos os meses apresentaram valores de clorofila a abaixo do estabelecido pela legislação ambiental brasileira. A água coletada nos meses de outubro e novembro e aquelas amostradas à montante e à jusante de Piracicaba apresentaram maiores valores de índice de estado trófico comparado aos outros pontos e meses do ano, no entanto, não foram classificadas como eutrofizadas. Concentrações dos herbicidas atrazina e ametrina também foram determinadas na água do rio Piracicaba e variaram de 0,11 a 1,92 \'mü\'g L-1 e 0,25 a 1,44 \'mü\'g L-1, respectivamente, e mostraram ter potencial mutagênico e genotóxico para D. rerio. Um estudo avaliando a toxicidade da vinhaça antes e após a correção do pH também foi realizado já que o rio Piracicaba está localizado em uma região influenciada por plantações de cana-de-açúcar. Os resultados apresentados confirmam que a vinhaça possui alta toxicidade aguda para organismos aquáticos, no entanto, esta pode ser reduzida através da correção do seu pH para 6,5 / An assessment of water quality of the Piracicaba River was performed using different methodologies and organisms, and therefore, from February 2011 to January 2012 water samples were collected at six sampling sites along the Piracicaba River. Physical chemical parameters of the water were measured and demonstred low water quality according to the conductivity and biochemical oxygen in places close to Americana and Piracicaba. Effects on the reproduction of Ceriodaphinia dubia and Ceriodaphnia silvestrii were observed in February and March 2011, and January 2012 and occurred in samples collected close to Americana and Piracicaba cities. Evaluation of the gills of Danio rerio showed no significant difference during all months, except in February, September and October for some locations. During the study period, water samples collected in all sampling sites and months presented values of chlorophyll a below the limit set by the Brazilian environmental law. Water collected in October and November and those sampled upstream and downstream of Piracicaba presented higher values of throfic state index than the other sites and months, however, were not classified as euthrofic. Concentrations of atrazine and ametrine during the sampling period were also measured and ranged from 0.11 to 1.92 \'mü\'g L-1 and from 0.25 to 1.44 \'mü\'g L-1, respectively, and showed genotoxic and mutagenic potentials to D. rerio. A study evaluating the acute toxicity of vinasse before and after the pH correction was conducted due to the influence of sugar cane cultures on the Piracicaba River area. The results confirmed the high acute toxicity of vinasse to aquatic organisms, however, this can be reduced by correcting its pH to 6.5

O caranguejo de mangue Ucides cordatus é um forte hiper-hipo-osmorregulador que se encontra iso-osmótico ao ambiente na salinidade próxima a 20‰. A osmorregulação é realizada por diversos órgãos, mas principalmente pelas brânquias posteriores, enquanto as brânquias anteriores relacionam-se com a respiração. A regulação iônica é feita por muitas enzimas, sendo a principal a Na+-K+-ATPase (NKA). Tal enzima pode variar sua atividade em diversas condições ambientais, como a salinidade e/ou temperatura; é alterada por características físicas das membranas, como fluidez; e também modulada por ácidos graxos de fosfolipídios de membrana encontrados nas brânquias. O objetivo deste trabalho foi elucidar a conformação dos fosfolipídios de membrana, no que tange aos ácidos graxos destes, em animais submetidos a diferentes salinidades. Os caranguejos foram divididos e submetidos a três situações (n=4 por grupo): controle /iso-osmótico (salinidade 20‰), hipo-osmótico (10‰) e hiper-osmótico (30‰). Um grupo de animais foi exposto a um período de curto prazo (6 horas) e outro grupo a um período de 120 horas. As brânquias foram removidas e as frações lipídicas extraídas para configurar o perfil de ácidos graxos. Após montado o perfil das classes dos ácidos graxos, os mesmos foram determinados por cromatografia gasosa. A atividade específica da NKA foi mensurada com base na diferença entre a taxa de liberação de fosfato a partir de ATP. Os resultados mostraram um aumento dos ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) sob o estresse hipo-osmótico em brânquias posteriores em ambas as frações, fosfatidilcolina (FC) e fosfatidiletanolamina (FE), em animais submetidos ao tratamento de 120 horas. PUFA tende a aumentar a fluidez de membrana, portanto, nesta condição a membrana talvez estivesse sob tal estado, mais permeável. No estresse hiper-osmótico, por outro lado, o FE de brânquias posteriores mostrou um aumento dos ácidos graxos saturados em animais também expostos a 120 horas. Tais ácidos graxos fazem com que a conformação da membrana se torne menos fluida, e menos permeável a solutos. Não houve diferença no perfil de ácidos graxos para animais expostos a 6 horas em diferentes salinidades. A atividade da NKA variou entre as diferentes exposições. / The mangrove\'s crab Ucides cordatus is a good hyper-hyposmoregulator that is isosmotic in a 20‰ salinity environment. The osmoregulation is performed by many organs, however the most important structure is the posterior gills. On the other hand, anterior gills are related to breathing. Ionic regulation is performed by several pumps, primarily by Na+-K+-ATPase (NKA). This enzyme performs its role due to environmental conditions such as salinity and/or temperature, but also to membrane\'s physics characteristics such as fluidity and composition of fatty acids. The purpose of this study was to evaluate the membrane\'s conformation in relation to fatty acids of phospholipids, when acclimated to different salinities. The crabs were divided into three groups (n = 4 per group): isosmotic/control (20‰ salinity), hyposmotic (10‰ salinity) and hyperosmotic (30‰ salinity). A group of animals were exposed to a short-term period (6 hours) and another group to a long-term period (120 hours). The gills were removed and their total lipids was extracted to set up the fatty acids profile (phospholipid class). The fatty acids profile were determined as phospholipid class by gas chromatography. The specific activity of NKA was based upon measurement of the phosphate released through the breakdown of ATP. The results showed that phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylcoline (PC) from posterior gills exposed to 10‰ salinity for long-term had significantly higher levels of polyunsaturated fatty acids (PUFA). PUFA tends to increase membrane\'s fluidity, thus in the hyposmotic stressful situation, the membrane\'s conformation could be more fluid. When exposed to 30‰ salinity for long term, the PE of posterior gills showed increased levels of saturated fatty acids that implies in a less fluid membrane\'s conformation. There were no significant differences among fatty acids of phospholipids in gills of crabs exposed to a short-term period (6 hours). The specific activity of NKA ranged among the different salinities.

Mytilus edulis est un mollusque bivalve de grand intérêt économique et écotoxicologique. Cette espèce sentinelle est connue pour sa résistance aux contaminants chimiques et biologiques. Néanmoins, depuis quelques années la moule bleue est touchée par des mortalités dans les élevages des Pertuis Charentais ayant pour dénominateur commun la présence de bactéries virulentes de type Vibrio. Le premier axe de cette thèse décrit les interactions des isolats de V. Splendidus avec la moule bleue au niveau cellulaire et physiologique. Les infections expérimentales ont permis la sélection de deux isolats bactériens affiliés à V. splendidus/V. hemicentroti : une souche virulente codée 10/068 1T1 et une souche inoffensive codée 12/056 M24T1. Ces deux bactéries ont été marquées à la GFP et validées en tant que modèles authentiques d’exposition à travers leurs caractéristiques de croissance et de virulence. Par ailleurs, V. hemicentroti 10/068 1T1 est capable d’altérer différentes fonctions hémocytaires incluant la motilité, l’adhésion, l’internalisation, la production de ROS, la maturation du phagosome et la viabilité contrairement à la bactérie non virulente. Les produits extracellulaires bactériens semblent être toxiques et inhibent certaines réponses cellulaires (internalisation et production de ROS). Enfin, nous avons reproduis avec succès l’infection des animaux par le pathogène via un modèle expérimental de cohabitation. Le suivi de l’infection montre que V. hemicentroti 10/068 1T1 a pour cible principale les branchies. Le deuxième axe explore le fonctionnement du système MXR (MultiXenobiotic Resistance) chez la moule bleue. La séquence codante complète d’un nouveau transporteur ABCG2 a été établie et la protéine résultante a été identifiée. La caractérisation moléculaire montre la présence du transcrit dans les hémocytes ainsi que dans les branchies et son homologie avec les autres protéines appartenant à diverses espèces. L’utilisation des sondes fluorescentes bodipy prazosin et pheophorbide A, combinées avec des bloqueurs spécifiques, démontre l’activité d’efflux de ce transporteur et son hétérogénéité dans les tissus et cellules. Par ailleurs, il est également démontré que l’expression des trois transporteurs ABC (abcb, abcc, abcg2) identifiés chez la moule bleue est modulée par les contaminants chimiques. Les animaux exposés au BaP au laboratoire ou prélevés sur un terrain contaminé montrent une surexpression des transcrits abc dans les branchies et une sous expression dans les hémocytes. La saisonnalité, sur le terrain, a également un effet sur les niveaux des transcrits et interfère avec les réponses liées aux contaminants. Seul le transporteur abcb exprimé dans les branchies n’est pas affecté par des variations saisonnières et montre une surexpression dans le site contaminé tout au long de l’année. En conclusion, nos résultats démontrent la vulnérabilité de la moule bleue face un pathogène. L'impact immunotoxique des xénobiotiques et le rôle que peuvent jouer les transporteurs ABC dans le fonctionnement du système immunitaire des moules reste à explorer. / Mytilus edulis is a bivalve mollusc representing an economic and ecotoxicological interest. This sentinel species is known for its resistance to chemical and biological contaminants. However, for few years, abnormal mortality events have been reported for farmed blue mussels in France where different Vibrio strains were isolated. The first section of this thesis describes cellular and physiological interactions of V. Splendidus isolates with the blue mussel. Experimental infections allowed the selection of two isolates affiliated to V. splendidus/V. hemicentroti type strains: a virulent 10/068 1T1 and an innocuous 12/056 M24T1. These two strains were GFP-tagged and validated for their growth characteristics and virulence as genuine models for exposure. V. splendidus 10/068 1T1 is capable to alter different functions of hemocytes including motility, adhesion, internalization, ROS production, phagosome maturation and viability, unlike the avirulent strain. Furthermore, bacterial extracellular products appeared toxic and inhibit cellular responses (internalization and ROS production). Finally, we successfully reproduced experimental infection by water tank cohabitation assays with septic animals. Infection monitoring shows the targeting of gills by bacteria. The second section explores the MXR (MultiXenobiotic Resistance) system functioning in the blue mussel. For the first time, a complete ABCG2 amino acid sequence was established. Molecular characterization shows the presence of the abcg2 transcript in hemocytes and gills and its homology with other proteins from various species. The combination of the fluorescent probes bodipy prazosin and pheophorbide A with specific blockers demonstrate the transporter efflux activity and its heterogeneity in tissues and cells. Moreover, the expression of three ABC transporters (abcb, abcc, abcg2) identified in the blue mussel has been shown to be modulated by chemical contaminants. Mussels exposed to BaP in the laboratory or collected from contaminated mussel beds in the field show upregulated abc transcripts in gills whereas these mRNA undergone a downregulation in hemocytes. Season had also an effect on mRNA levels and interacted with site effects. Only the abcb gene displayed a more abundant mRNA level in gills dissected from animals collected in the more polluted area all over the diachronic study. In conclusion, our results demonstrate the vulnerability of the blue mussel towards a pathogen. The immunotoxic impact of environmental xenobiotics and the precise role of ABC efflux pumps in the immune system of the mussel has yet to be explored.

Diese Habilitationsschrift konzentriert sich auf die Evolution osteologischer Korrelate, anhand derer Rückschlüsse auf die Struktur der Haut sowie die Art der Atmung und der Nahrungsaufnahme früher Tetrapoden gezogen werden können. Die äußere Skulptur der Hautknochen früher Tetrapoden trug zur Konsolidierung der darüber liegenden Dermis bei; dies und die zahlreichen Hautverknöcherungen deuten darauf hin, dass Hautatmung im Gegensatz zu heutigen Lissamphibien keinen wesentlichen Teil des Gasaustausches ausmachen konnte. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass eine weitere Funktion der Knochenskulptur in der Pufferung von CO2-induzierter Azidose bestand, wenn sich die Tiere an Land aufhielten. Mehrere Gruppen früher Tetrapoden entwickelten unabhängig voneinander Osteoderme im Rumpf, die unter anderem die Wirbelsäule bei der Fortbewegung an Land unterstützen konnten oder als Kalzium-Reservoir dienten. Die Veränderungen in der Morphologie, Histologie und Anordnung der Dermalschuppen während des Fisch-Tetrapoden-Überganges erfolgte etwa simultan zur Entwicklung der Tetrapodenextremität und ermöglichte eine größere Flexibilität des Körpers und der Beine. Der Bau des Kiemenskeletts ihrer Fischvorfahren wurde bei einer unerwartet großen Anzahl früher Tetrapoden beibehalten. Dies zeigt, dass viele frühe Tetrapoden sowohl der Stamm- als auch der Kronengruppe als Adulte über innere Kiemen atmeten, während ihre Larven äußere Kiemen besaßen. Das Kiemenskelett und die Rekonstruktion assoziierter Muskeln zeigen, dass viele aquatische frühe Tetrapoden ihre Nahrung durch akinetisches Saugschnappen erbeuteten. Trotz spärlicher Fossilüberlieferung gibt es Hinweise darauf, dass die ersten an Land fressenden Tetrapoden noch keine bewegliche Zunge besaßen. Ein ontogenetischer Umbau des larvalen, kiementragenden Kiemenskelets in einen zungenstützenden Apparat kann bei frühen Tetrapoden nur in Ausnahmefällen belegt werden. / This habilitation thesis focuses on the evolution of skeletal correlates from which the integumentary structure and the mode of breathing and feeding in early tetrapods can be inferred. Sculpture on the external surface of dermal bones contributed to the consolidation of a dense integument; this and numerous dermal ossifications render substantial cutaneous respiration as in extant lissamphibians unlikely. It is hypothesised that a further function of dermal bone sculpture was to buffer CO2-induced acidosis while the animals were on land. Numerous early tetrapods independently developed osteoderms in the trunk that may have served among other things for support of the vertebral column in terrestrial locomotion or as a physiological calcium reservoir. The alterations in morphology, histology and arrangement of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition occurred at roughly the same time when digits appeared and enabled greater flexibility of body and limbs. The structure of the hyobranchium of their fish-like ancestors was retained in an unexpected large number of early tetrapods, showing that many early tetrapods of both the stem- and crown-group breathed via the associated internal gills as adults, and via external gills as larvae. The hyobranchial apparatus and reconstruction of the associated musculature indicate that many aquatic early tetrapods fed by akinetic suction feeding. There is evidence that the earliest terrestrial tetrapods captured prey on land by jaw prehension rather than by tongue based feeding. Ontogenetic remodelling into a tongue supporting adult hyobranchium in early tetrapods can only be demonstrated in exceptional cases.

In August 2014 a total die-off of fish stock occurred in Záhumenní velký, a pond with a surface area of 5.85 ha. The investigation of the fish kill revealed that the Jabkenice WWTP located above the pond area had discharged water of inappropriate quality (N-NH4+ -99.3 mg/l-1) into the pond. This event resulted in the monitoring of physical and chemical parameters of water quality, zooplankton sampling and measuring of growth dynamics of fish stock by using control reduction fishing. The survey conducted in 2015 studied three different ponds (Ohrada 0.85 ha, Záhumenní velký 5.85 ha and Vlkava 22.1 ha), located in the fertile lowland areas around Mladá Boleslav where pre-cleaned sewage water from the sewage treatment plants flows. The water samples taken both at the outflow of the waste water treatment plant and in the pond were analysed in an accredited laboratory. The following parameters were examined: BOD5, TN, CODCr, ammoniacal nitrogen, TP, nitrites, nitrates and others.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:31:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2308.pdf: 3472152 bytes, checksum: de972462448f54f70c4fafbbaf2ba066 (MD5) Previous issue date: 2008-07-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / The aim of this study was to evaluate the morphofunctional structure of the gills and the hematological variables of Astyanax fasciatus and Pimelodus maculatus living on Furnas Dam Reservoir (Minas Gerais State, Brazil) and analyses the influence of water quality on these parameters. The fishes were collected in five sites (FU10: Turvo; FU20: Guapé; FU30: Barranco Alto; FU40: Fama and FU50: Porto Fernandes) during June and December/2006. Physico-chemical variables and organochlorides content of the water and heavy metals on the sediment were performed. Gills and blood samples were taken for check inquire of the composition of the water on the presence of histopathologys and differentiation of chloride and mucous cells and differences on the hematological variables of the fishes collected on the different sites. Hyperplasia and hypertrophy of the respiratory epithelium, lamellar fusion, epithelial lifting, oedema and chloride cells proliferation were the most common histopathological damages observed on the gills for both species. The histopathological alteration index of the gills indicates some degree of lesions that engage the normal function of the organ in A. fasciatus collected in June. Heavy metals, as copper seems to promote alterations on the red blood cells for both fishes during the sampling. While, some pollutants as endosulfan, metolachloride, copper and chromium seems to causes a stimulation of the immune system of the fishes; this effect was most common on the fishes collected in the sites: FU10, FU20 and FU30. The condition factor (K and Kn) of the fishes has been affected by the presence of chromium on the sediment, especially in the site FU30 during the two months. Over all, these results indicates that the water quality in June and December (2006) of Furnas Dam reservoir could promote physiological and morphological alterations on the gills fishes to maintain the homeostase. / O presente estudo teve como objetivo avaliar a estrutura morfuncional das brânquias e as variáveis hematológicas de exemplares de duas espécies de peixes, Astyanax fasciatus e Pimelodus maculatus, coletados na UHE de Furnas, MG e a possível interferência da qualidade da água nos parâmetros estudados. Peixes, amostras de água e de sedimento foram coletados em cinco pontos de amostragem na UHE de Furnas (FU10: Turvo; FU20: Guapé; FU30: Barranco Alto; FU40: Fama e FU50: Porto Fernandes) nos meses de Junho e Dezembro/2006. Foram realizadas análises físicas e químicas da água, determinar a concentração de organoclorados e a presença de elementos-traço. Amostras de brânquias e de sangue foram retiradas para verificar possíveis interações entre organoclorados na água e elementos-traço no sedimento e a presença de histopatologias e diferenciação de células cloreto e mucosa e diferenças nas variáveis hematológicas (série vermelha e série branca) dos peixes coletados nos diferentes locais. Hipertrofia e proliferação de células pavimentosas, fusão lamelar, descolamento do epitélio lamelar, edema e proliferação de células cloreto foram as histopatologias mais encontradas nas brânquias das duas espécies. O IAH (Índice de Alterações Histopatológicas) apontou lesões que comprometem o funcionamento normal do órgão em indivíduos de A. fasciatus coletados em Junho. A presença de elementos-traço, como o cobre, parece promover alteração na série vermelha de A. fasciatus e P. maculatus coletados durante os dois meses. Organoclorados como o endosulfan e metolacloro e elementos traço como cobre e cromo parecem causar uma estimulação do sistema imunológico das duas espécies, especialmente nos locais FU10, FU20 e FU30. Alterações no K e Kn dos animais aparentemente foram influenciados pela presença de cromo no sedimento, especialmente no local FU30 durante os dois meses. O conjunto de todas as alterações observadas indica que a qualidade da água nos diferentes locais durante os dois meses de coleta podem promover alterações nos organismos a fim de manter a homeostasia interna.