Inanga (Galaxias maculatus) is an amphidromous fish species that is able to successfully inhabit a variety of salinities. Using an integrated approach this thesis has characterised for the first time the physiological characteristics that facilitate acclimation in inanga. Structural studies using scanning electron microscopy (SEM) and laser scanning confocal microscopy (LSCM) revealed freshwater-acclimated inanga have a high density of apical pits and freshwater-type mitochondria-rich cells (MRCs) that can facilitate ion absorption from the hypo-osmotic environment. In seawater, inanga remodel their gills by increased proliferation of seawater-type MRCs to facilitate ion secretion in the hyper-osmotic environment. Concentration-dependent sodium (Na+) kinetic analysis revealed that at a whole body level, inanga regulate Na+ using a saturable, high affinity, low capacity uptake system which makes them extremely adept at extracting Na+ from very dilute freshwater environments. In fact inanga displayed an uptake affinity (Km) of 52 ± 29 µM, which is one of the lowest ever recorded in freshwater fish. The sodium/potassium ATPase transporter (NKA) is central to Na+ regulation within the gill. In high salinties inanga displayed increased NKA activity (6.42 ± 0.51 µmol ADP mg protein-1 h-1) in an effort to excrete the excess Na+, diffusively gained from the hyper-osmotic environment. This increase in NKA was most likely a reflection of the proliferation of NKA-containing MRCs. The NKA activities seen in freshwater- and 50% seawater-acclimated inanga were similar (2.54 ± 0.19 and 2.07 ± 0.22 µmol ADP mg protein-1 h-1 respectively) to each other suggesting the inanga gill is capable of supporting ion regulation in brackish waters without a significant increase in NKA activities, and the energetically-expensive changes in gill structure and function that accompany such a change. Molecular investigation of NKA isoform expression using quantitative PCR (qPCR) showed that inanga displayed salinity-induced changes in the expression of the three α NKA isoform variants investigated. Isoform α1a exhibited a pattern consistent with an important role in freshwater, confirming results from other fish species. While it is generally accepted that α1b isoform is the predominant NKA isoform in seawater, inanga did not display this pattern with a freshwater dominance seen. None of the salinity-induced changes could quantitatively explain the increased NKA activity in seawater suggesting that different isoforms may convey different activities, that there is also regulation of NKA at a post-transcriptional level, and/or other isoforms or subunits may have a significant role. The importance of the osmoregulatory hormone cortisol and prolactin is widely accepted and inanga were treated with cortisol, prolactin and a combination of the two in an effort to further elucidate their role. NKA activity and NKA isoform expression were assessed but no specific patterns were deduced, except for a decrease in both NKA activity and isoform expression in 100% seawater-acclimated inanga treated with cortisol and prolactin. The reasons for this decrease were not evident, although the impact of stress induced by the injection protocol was likely to be a confounding factor. The development of a new confocal-based technique in this study was able to describe, for the first time, intracellular sodium levels ([Na+]i) as a function of salinity in an intact euryhaline fish gill cell. Using the fluorescent Na+ indicator dye CoroNa Green this study demonstrated the ability of inanga gill cells to maintain [Na+]i in the face of environmental change. Freshwater-acclimated inanga displayed basal [Na+]i of 5.2 ± 1.8 mM, with 12 ± 2.3 mM and 16.2 ± 3.0 mM recorded in 50% seawater- and 100% seawater-acclimated cells, respectively. Low [Na+]i is advantageous in hypo-osmotic environments as it provides a gradient between the cell and the blood which is essential for generating electrochemical gradients cell volume regulation and other cellular homeostatic mechanisms. A slightly elevated [Na+]i seen at the higher sanities would help minimise the diffusive gradient for passive influx from the environment which would be of benefit in hyper-osmotic environments. Upon salinity challenge 50% seawater cells were equally adept at maintaining a constant [Na+]i at any salinity, suggesting these cells are have the necessary constituents to regulate Na+ in both lower and higher salinities. This novel LSCM approach is advantageous relative to existing transport models as it will allow the observation of cellular ion transport in real time, within a native filament structure displaying functional interaction of different cell types. The extreme ion uptake characteristics of the inanga and their amenability to in situ confocal-based studies demonstrated in this study, confirm inanga as a valuable model species for future research.

Animais presentes em regiões de maior contaminação apresentam diferenças fisiológicas, quando comparados com animais de regiões menos contaminadas, provavelmente permitindo a sua sobrevivência em ambientes poluídos. Assim, o objetivo da tese foi caracterizar o transporte de cádmio em brânquias e hepatopâncreas de Ucides cordatus, como também comparar o transporte nestes órgãos, em animais de regiões poluídas (Itanhaém) e não poluídas (Juréia), além de analisar a porcentagem de ácidos graxos na membrana, níveis de metalotioneína (MT), lipoperoxidação (LPO) e mecanismo de acúmulo do metal. Assim, as células de brânquias anteriores (BA), posteriores (BP) e hepatopâncreas (H) foram separadas. Em seguida, realizou-se o transporte de cádmio em BA, BP, e em cada tipo celular do H, com ou sem a utilização de inibidores; o mesmo procedimento foi utilizado para caracterizar o transporte de cádmio em cada região estudada. Também foram analisadas a porcentagem de ácidos graxos, níveis de MT, LPO e mecanismos de detoxificação de cádmio. Observou-se um maior transporte através de canais de cálcio e trocadores Na+/Ca2+ em BP e nas células E, R e F de H, pois são células específicas para as trocas iônicas. Em animais de regiões poluídas, observou-se um maior transporte que ocorreu nos mesmos parâmetros, devido aos tipos celulares específicos envolvidos. Em animais de regiões contaminadas verificou-se maior porcentagem de MUFA em hepatopâncreas, acarretando em menor fluidez na membrana, e maior índice de LPO, devido ao estresse causado pela presença do contaminante no meio. Já em animais de regiões não poluídas, observou-se maior porcentagem de PUFA, com maior fluidez na membrana, e maior quantidade de MT, principalmente no hepatopâncreas, resultando na detecção de pequenas alterações ambientais. Nas brânquias, o cádmio se acumula em organelas intracelulares, enquanto em hepatopâncreas se ligam a MTs do citoplasma celular. Portanto, acredita-se que estes animais apresentaram diferentes mecanismos fisiológicos que permitiram a sua sobrevivência na região poluída / Animals resident in regions polluted by metals must have physiological mechanisms for survival, compared with animals from unpolluted regions. Therefore, the objective of this study was to characterize cadmium transport in gills and hepatopancreas of Ucides cordatus, and to compare this transport in animals from polluted (Itanhaém) and unpolluted (Juréia) regions. In addition, the animals were analyzed for cell membrane fatty acids composition, metallothionein levels (MT), lipid peroxidation (LPO) and mechanisms of accumulation of intracellular Cd. The anterior gills (BA), posterior gills (BP) and hepatopancreas (H) cells were separated. After, the transport of cadmium was realized in BA, BP and in each cellular type of H, with or without various inhibitors present. The same approach was utilized to characterize cadmium transport from crabs of polluted and unpolluted regions: fatty acids composition, MT levels, LPO and cadmium detoxification mechanisms were also analyzed. An increase in the transport of cadmium was observed through calcium channels and Na+/Ca2+ exchangers, in BP and in E, R and F cells of H, probably because they are specific cells for ion transport. In animals from polluted regions, we observed an increase in cell cadmium transport when compared with animals from unpolluted regions. Animals from polluted environments also presented more MUFA in H, leading to lower membrane fluidity, and higher LPO, probably due to the stress caused by pollution. In animals from unpolluted regions, we observed more PUFA in the plasma membrane, resulting in higher membrane fluidity, and more MT levels, mainly in H. In gills, intracellular cadmium accumulation occurred in organelles, whereas in H, Cd binding to MT in cellular cytoplasm was more evident. Therefore, we believe that animals from metal polluted environments present the above-described physiological mechanisms to deal with Cd, allowing their survival in this environment

O impacto dos metais na fisiologia de peixes tem sido considerado preocupante, pois são contaminantes críticos nos ecossistemas aquáticos devido ao seu alto potencial de entrar no organismo, acumular-se e ser transferido na cadeia trófica e muitos estudos têm demonstrado os efeitos sobre várias funções em animais, quando expostos a estes metais. O rio Paraíba do Sul vem apresentando concentrações de alumínio (Al) e manganês (Mn) acima dos valores permitidos pela legislação Brasileira e, além disso, fatores abióticos tais como a acidez da água, podem contribuir para alteração do potencial de toxicidade, podendo acarretar em danos à biota aquática. As respostas desencadeadas pelos animais a estas mudanças ambientais podem levá-los a um estado de estresse, que é altamente energético devido à realocação de substratos inicialmente destinados às atividades de elevada demanda energética, como crescimento e reprodução, em direção às atividades que requerem intensificação para restaurar a homeostase. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos dos metais Al e Mn em pH ácido, isoladamente e em combinação, durante 96 horas (teste agudo) nas brânquias e nos substratos metabólicos de fêmeas vitelogênicas de Astyanax bimaculatus e, adicionalmente após um período de 96 horas em água limpa, verificar a habilidade dos animais em se recuperar na ausência destes metais. Os animais foram divididos em 5 grupos experimentais: CTR em pH neutro; pH ácido; Al; Mn; e Mn+Al. Os dados mostram que quando expostos a estes metais isoladamente, a atividade enzimática da bomba Na+/K+ ATPase e a quantidade de células de cloreto foram diminuídas, no entanto quando combinados, estes efeitos não foram observados. O Al isolado e em associação com o Mn promoveu peroxidação de fosfolipídios de membrana. Além disso nos animais expostos aos dois metais juntos, houve um aumento de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e saturados (STA) acompanhado pela diminuição dos ácidos graxos polinsaturados (PUFA) o que pode ter evitado alterações na atividade de bomba e na quantidade de células de cloreto na combinação destes metais. Considerando-se os substratos metabólicos, a exposição ao Al diminuiu a concentração de proteínas nos ovários e no plasma, glicogênio muscular, além de alterar as porcentagens de MUFA e PUFA no fígado, e PUFA nos ovários. O Al também promoveu lipoperoxidação hepática, e no período de recuperação houve diminuição da concentração de lipídios em vários tecidos analisados. A exposição ao Mn promoveu diminuição das concentrações de proteínas totais em todos os tecidos analisados, seja no período de exposição agudo ou de recuperação, não havendo a recuperação deste substrato no fígado e nos ovários; o Mn promoveu lipoperoxidação nos fosfolipídios das membranas do fígado e, em associação com o Al, pareceu interferir na dinâmica dos PUFA das membranas dos ovários. Várias interações foram observadas entre o Al e Mn, demonstrando casos de antagonismo, potenciação e até mesmo de sinergismo entre estes metais, dependendo do parâmetro fisiológico analisado, evidenciando que a exposição de fêmeas vitelogênicas a estes metais pode ser prejudicial ao processo reprodutivo principalmente devido à ação observada, inclusive nos ovários / The impact of metals in fish physiology has been considered worrying due to their high potential of entering in the organism, to accumulate and be transferred through the food chain and many studies have shown the effects on several functions in animals, when exposed to these metals. The Paraíba do Sul river showed aluminum (Al) and manganese (Mn) concentrations above the values allowed by the Brazilian law and moreover abiotic factors, such as acidic water, can contribute to changing the toxicity potential and can result in damage to aquatic biota. The answers triggered by the animals to these environmental changes can lead to a stress state which has a high energetic cost due to the substrate reallocation, initially designated to activities with high energetic demand, as growth and reproduction, to activities that need to be intensified, to reestablish the homeostasis. The main goals of this study were to evaluate the effects of the metals Al and Mn in acidic pH, alone and in combination, during 96 hours (acute test) in the gills and in metabolic substrates in Astyanax bimaculatus vitelogenic females and, additionally, verify the ability of the animals to recover in the absence of the metals after the 96 hours in clear water. The animals were divided in 5 groups : CTR in neutral pH; acidic pH; Al; Mn; and Mn+Al. The results showed that when the animals were exposed to the isolate metals, there was a decrease in the Na+/K+ ATPase pump activity and in the amount of chloride cells, however when combined, these effects were not observed. Al, isolated or in association with Mn, promoted phospholipids peroxidation in gill membranes. Furthermore, in the animals exposed to both metals together, there were an increase in monounsaturated fatty acids (MUFA) and saturated fatty acids (STA) and decrease in polyunsaturated fatty acids (PUFA) which may have avoided alterations in pump activity and in the amount of chloride cells. In the metabolic substrates, Al exposition decreased plasma and ovaries protein concentration, muscle glycogen, and altered the percentage of MUFA and PUFA in the liver, and PUFA in the ovaries. Al also promoted liver lipoperoxidation, and in the recovery period lipid content decreased in most tissues analyzed. Mn exposition promoted a decrease in total protein content in all tissue analyzed, both in the acute and recovery periods, and there was no recovery of this substrate in liver and ovaries; Mn promoted lipoperoxidation in liver phospolipids and, in association with Al, interfered in the PUFA dynamic in ovaries membranes. Many interactions were observed between Al and Mn, evidencing antagonism, potentiation and also synergism, depending on the physiologic parameter analyzed, showing that the exposition of vitellogenic females to these metals can be harmful to reproductive process due to the observed actions, including in ovaries

Les crevettes Palaemonidae sont issues d'un clade ancestral marin, qui a montré une tendance évolutive remarquable à s'adapter à des conditions non-marines, envahissant avec succès les milieux estuariens et limniques. Adulte, Macrobrachium amazonicum (A) est une espèce d'eau douce (ED) avec une stratégie d'exportation vers les estuaires des larves qui ont besoin d'eau salée pour se développer. Des populations se sont trouvées au cours du temps isolées en ED ; elles ont récemment été décrites comme une nouvelle espèce, M. pantanalense (P), qui a acquis au cours de son évolution la capacité d'effectuer tout son cycle en ED, grâce à l'acquisition de l'hyper-osmorégulation en ED dès l'éclosion, et en perdant l'hypo-osmorégulation en eau salée. Ces deux espèces représentent un bon modèle pour la reconstruction des transitions évolutives des crevettes de l'eau salée à l'ED. L'objectif de ce travail est de comprendre les différences liées à l'adaptation physiologique et moléculaire à l'ED et donc à l'osmorégulation entre les deux espèces au cours de l'ontogénèse. Pour cela nous avons étudié l'ontogenèse comparative des organes osmorégulateurs, en particulier de la cavité branchiale, et la localisation et expression de différents transporteurs ioniques. Au niveau structural, aux stades larvaires, P a un développement branchial plus précoce que A. La Na+/K+ ATPase (NKA) a été essentiellement immunolocalisée au niveau des branchies chez P et au niveau des branchiostégites chez A aux mêmes stades larvaires. Ceci suggère que la forte capacité d'hypo-osmorégulation durant l'ontogenèse de A est liée aux transports ioniques dans les branchiostegites, alors que les lamelles branchiales ne sont pas complètement développées. Sur le plan ultrastructural, les lamelles branchiales des deux espèces comportent deux types de cellules associées, les cellules septales et les cellules piliers qui toutes deux présentent des caractéristiques d'ionocytes. Une différentiation ultrastructurale a été observée au niveau des cellules piliers et de l'épithélium interne des branchiostégites suite à une acclimatation en ED. Ces cellules présentent des microvillosités apicales, profondes et nombreuses, ce qui semble être une adaptation aux faibles salinités permettant une absorption efficace d'ions. Les transporteurs ioniques impliqués dans l'osmorégulation ont été étudiés. La V-H+ ATPase (VHA) a été détectée au niveau des cellules piliers et de l'épithélium interne des branchiostégites. La NKA et l'échangeur Na+/H+ (NHE-3) ont été localisés au niveau des cellules septales. Des différences d'expressions géniques de la VHA, du NHE-3 et de la NKA ont été mesurées en comparant les 2 espèces à certains stades de développement. La distribution différentielle de ces transporteurs entre les cellules piliers et septales suggère que ces deux cellules pourraient fonctionner comme un complexe cellulaire pour absorber ou sécréter des ions. Chez P, la capacité de tous les stades à hyper-réguler en ED peut provenir du développement précoce des branchies fonctionnelles, et la perte de l'hypo-régulation peut être liée au manque de transports ioniques au niveau des branchiostégites. Enfin, les glandes excrétrices antennaires produisent de l'urine hypotonique chez les juvéniles et adultes des deux espèces en ED, ce qui diminue les pertes ioniques. Ces résultats illustrent des adaptations évolutives (perte et gain de fonctions) qui ont permis l'invasion des habitats d'ED. / Palaemonid shrimps originate from an ancestral marine clade showing a remarkable evolutionary ability to adapt to non-marine conditions, successfully invading estuarine and limnic habitats. Macrobrachium amazonicum (A) is a freshwater (FW) species as an adult with an export strategy toward estuaries of larvae requiring salt water for their development. Over time, some populations ended up isolated in FW; recently, they have been described as a new species, M. pantanalense (P), which during its evolution has become able to complete its entire life cycle in FW, thanks to the acquisition of hyper-osmoregulation in FW from hatching, while loosing hypo-osmoregulation in salt water. The two species offer a valuable model to reconstruct the evolutionary transitions of shrimps from salt water to FW. The objective of this study was to decipher the differences in physiological and molecular adaptations to FW, thus in osmoregulation, between both species during ontogeny. We studied the comparative ontogeny of osmoregulatory organs, particularly the branchial chamber, and the localization and expression of ion transporters. During the larval phase, we found that the gill development starts earlier in P than in A. Na+/K+ ATPase (NKA) was mainly localized in gills of P and in branchiostegites of A at the same larval stages. This suggests that the high capacity to hypo-osmoregulate during the ontogeny of A originates from ionic transports in branchiostegites, while gill lamellae are not fully developed. In both species, the gill lamellae contain two associated cells types, septal and pillar cells, displaying features of ionocytes. After FW acclimation, ultrastructural differences were observed in pillar cells and in the inner epithelium of branchiostegites. These cells possess numerous deep apical microvilli, a possible adaptation to low salinities for efficient ion uptake. Regarding ion transporters involved in osmoregulation, V-H+ ATPase (VHA) was detected in pillar cells and in the inner branchiostegite epithelium. NKA and Na+/H+ exchanger (NHE-3) were localized in septal cells. Differences in VHA, NHE-3 and NKA gene expression were observed by comparing the two species at certain developmental stages. The differential distribution of these transporters between pillar and septal cells suggest that these two cells may function as a cell complex for ion absorption or secretion. In P, the capacity of all stages to hyper-regulate in FW may originate from the early development of functional gills; and the loss of hypo-regulation may originate from an absence of ion transport in branchiostegites. Finally, the excretory antennal glands produce hypotonic urine in juveniles and adults of both species in FW, thus reducing ion loss. These results illustrate evolutionary adaptations (gain and loss of functions) that have permitted the invasion of FW habitats.

Many tropical aquatic environments worldwide are characterized by intermittent or prolonged hypoxia (low dissolved oxygen). Nevertheless, many tropical freshwater fishes are able to inhabit these challenging environments via a range of morphological, physiological and behavioral adaptations. Brachyhypopomus is a diverse genus of weakly electric fishes represented by 28 known species distributed from Panama to Argentina. 17 species are restricted to permanently normoxic habitats (blackwater rivers and terra firme streams), eight species are restricted to seasonally or perennially hypoxic habitats (whitewater floodplains of large tropical rivers or permanent swampy habitats), and three species are eurytopic (occur in both seasonally hypoxic and normoxic habitats). These habitat distributions offer the opportunity to explore both species- and population-level variation in adaptive responses to hypoxia. Across 25 of the 28 known species in the genus (for which specimens were available), one- and two-way ANOVA was used to correlate total gill filament length (a metric of gill surface area) with lifestyle-divided into four categories: 1) stenotopic species (i.e. species occurring in a narrow range of habitats) restricted to hypoxic habitats; 2) stenotopic species restricted to normoxic habitats; 3) populations of eurytopic species from hypoxic habitats, and; 4) populations of eurytopic species from normoxic habitats. One-way ANOVA revealed that populations of eurytopic species from hypoxic habitats had significantly larger total gill filament lengths than stenotopic species from the same habitat (P = 0.0169). Likewise, populations of eurytopic from normoxic habitats had significantly larger total gill filament lengths than stenotopic species from normoxic habitats (P[less than] 0.005). Two-way ANOVA showed that eurytopic species had significantly larger total gill filament lengths than stenotopic species, independent of the disparity in total gill filament length associated with either hypoxic or normoxic habitats. Results indicate a strong correlation between gill surface area and oxygen-habitat among species and populations, which supports the hypothesis that an enlarged gill surface area increases oxygen uptake and serves as an adaptive response to seasonal hypoxia.

The objective of this study was to evaluate the impact of extreme acidic and alkaline pH excursions of fish populations in streams receiving fly ash settling basin effluent. Fish communities were sampled above and below the effluent outfall in a mountain stream, Adair Run, adjacent to the coal-fired Glen Lyn Power Plant in southwestern Virginia. This effluent, which exhibited a pH increase of up to pH 9.3 as the basin nearly filled, contributed to a downstream decline in species diversity and an increased dominance of the stoneroller (Campostoma anomalum), which displaced more sensitive species. Laboratory avoidance studies, utilizing a steep-gradient trough apparatus, were used to investigate the potential role of avoidance behavior that may alter fish distributions in acidic and alkaline waters. Stonerollers, rainbow trout (Salmo gairdneri), golden shiners (Notemigonus crysoleucas) and spotfin shiners (Notropis spilopterus) exhibited first significant avoidance responses to continuously decreasing pH conditions at pH 6.0-7.0, well above the 96-hr LC50 values of 4.05 and 4.24 for trout and golden shiners, respectively. When the pH was gradually increased, avoidance thresholds of pH 9.5- 11.0 were observed, beyond the 96-hr LC50 values of 9.13 and 8.86 for trout and golden shiners. Single acute alkaline exposures initially yielded more rapid avoidance responses, with acclimation to alkaline conditions frequently occurring within 30 minutes. Gill histological alterations, as observed by transmission electron microscopy, were detected following exposure to extreme pH excursions, with more rapid changes occurring with alkaline exposures. Gill tissue showed marked recovery within 8-14 days. / Master of Science

No description available.

A avaliação da qualidade da água do rio Piracicaba foi realizada utilizando diferentes metodologias e organismos teste, e para tanto, de fevereiro de 2011 a janeiro de 2012 amostras de água foram coletadas em seis locais de amostragens ao longo do rio Piracicaba. Parâmetros físicos e químicos da água foram mensurados e de acordo com a condutividade elétrica e demanda bioquímica de oxigênio, baixa qualidade foi observada em locais próximos a Americana e Piracicaba. Efeitos sobre a reprodução de Ceriodaphnia dubia e Ceriodaphnia silvestrii foram observados em fevereiro e março de 2011 e janeiro de 2012, e ocorreram em amostras coletadas próximas às cidades de Americana e Piracicaba. A avaliação das brânquias do peixe Danio rerio mostrou que para todos os meses, exceto fevereiro, setembro e outubro para alguns pontos, as alterações não foram significativas. Amostras de água coletada em todos os locais, assim como em todos os meses apresentaram valores de clorofila a abaixo do estabelecido pela legislação ambiental brasileira. A água coletada nos meses de outubro e novembro e aquelas amostradas à montante e à jusante de Piracicaba apresentaram maiores valores de índice de estado trófico comparado aos outros pontos e meses do ano, no entanto, não foram classificadas como eutrofizadas. Concentrações dos herbicidas atrazina e ametrina também foram determinadas na água do rio Piracicaba e variaram de 0,11 a 1,92 \'mü\'g L-1 e 0,25 a 1,44 \'mü\'g L-1, respectivamente, e mostraram ter potencial mutagênico e genotóxico para D. rerio. Um estudo avaliando a toxicidade da vinhaça antes e após a correção do pH também foi realizado já que o rio Piracicaba está localizado em uma região influenciada por plantações de cana-de-açúcar. Os resultados apresentados confirmam que a vinhaça possui alta toxicidade aguda para organismos aquáticos, no entanto, esta pode ser reduzida através da correção do seu pH para 6,5 / An assessment of water quality of the Piracicaba River was performed using different methodologies and organisms, and therefore, from February 2011 to January 2012 water samples were collected at six sampling sites along the Piracicaba River. Physical chemical parameters of the water were measured and demonstred low water quality according to the conductivity and biochemical oxygen in places close to Americana and Piracicaba. Effects on the reproduction of Ceriodaphinia dubia and Ceriodaphnia silvestrii were observed in February and March 2011, and January 2012 and occurred in samples collected close to Americana and Piracicaba cities. Evaluation of the gills of Danio rerio showed no significant difference during all months, except in February, September and October for some locations. During the study period, water samples collected in all sampling sites and months presented values of chlorophyll a below the limit set by the Brazilian environmental law. Water collected in October and November and those sampled upstream and downstream of Piracicaba presented higher values of throfic state index than the other sites and months, however, were not classified as euthrofic. Concentrations of atrazine and ametrine during the sampling period were also measured and ranged from 0.11 to 1.92 \'mü\'g L-1 and from 0.25 to 1.44 \'mü\'g L-1, respectively, and showed genotoxic and mutagenic potentials to D. rerio. A study evaluating the acute toxicity of vinasse before and after the pH correction was conducted due to the influence of sugar cane cultures on the Piracicaba River area. The results confirmed the high acute toxicity of vinasse to aquatic organisms, however, this can be reduced by correcting its pH to 6.5

Os crustáceos são originariamente marinhos; ao longo da evolução, diversas espécies invadiram ambientes de salinidades menores, chegando à água doce. A capacidade dos crustáceos colonizarem com sucesso o ambiente dulcícola depende do desenvolvimento de mecanismos eficientes de hiperosmorregulação. A osmolalidade e a composição iônica da hemolinfa de um crustáceo, em meios diluídos, refletem o equilíbrio dinâmico entre a perda de íons por difusão e pela urina e sua reabsorção do meio externo, através das brânquias. A (Na,K)-ATPase branquial desempenha um papel chave no processo de captura de Na+ a partir de ambientes diluídos e suas características cinéticas vem sendo investigadas recentemente, embora as enzimas de caranguejos dulcícolas sejam pouco conhecidas. Segundo o modelo atual, a afinidade por Na+ é o parâmetro cinético mais variável entre as enzimas de diferentes espécies, refletindo a salinidade do habitat do animal, de modo que enzimas de espécies bem adaptadas à água doce apresentam afinidades maiores por Na+. Entretanto, vários resultados conflitantes têm sido relatados nos últimos anos. Recentemente, foi proposto que uma V-ATPase também desempenha papel essencial na captação de Na+ através das brânquias dos crustáceos dulcícolas. Esta enzima ainda é praticamente desconhecida: suas características cinéticas não foram estudadas e a relação entre a magnitude da sua atividade e a salinidade do meio externo não está estabelecida. Este projeto teve por objetivo a caracterização das enzimas (Na,K)-ATPase e V-ATPase das brânquias posteriores do caranguejo hololimnético Dilocarcinus pagei, considerado um antigo invasor da água doce. A (Na,K)-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce, a fim de comparar suas propriedades cinéticas com aquelas das enzimas de outras espécies de caranguejos, habitantes de meios mais salinos, visando melhorar o entendimento das adaptações bioquímicas associadas à invasão da água doce. A V-ATPase foi caracterizada em animais mantidos em água doce ou expostos por diferentes intervalos de tempo à salinidade de 21‰ ou ainda aclimatados por 10 dias a diferentes salinidades (5-21‰), visando estabelecer uma relação entre a magnitude da atividade e a salinidade do meio, além de investigar os mecanismos de regulação da atividade da enzima. A análise da fração microsomal branquial de D. pagei mantido em água doce em gradiente contínuo de sacarose mostrou dois picos protéicos (25-35% e 35-45% de sacarose), ambos com atividades K+-fosfatase, (Na,K)-ATPase e V-ATPase. Estes resultados indicam a presença de frações de membrana com densidades distintas, apresentando, em ambos os casos, as principais bombas de íons envolvidas na captação de Na+. Estas membranas podem ser originárias de locais distintos do epitélio branquial posterior assimétrico deste caranguejo. A análise por Western blotting revelou duas bandas imunoespecíficas (Mr 116 kDa e 105 kDa) correspondentes à subunidade α da (Na,K)-ATPase, sugerindo a presença de duas isoformas nas brânquias posteriores do animal. A estimulação da atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase pelo PNFF envolveu interações sítio-sítio (nH= 1,4), com V= 43,4 ± 2,2 U mg-1 e K0,5= 1,13 ± 0,06 mmol L-1. A estimulação da atividade da enzima por K+ (V= 39,9 ± 1,9 U mg-1 e K0,5= 4,2 ± 0,2 mmol L-1), Mg2+ (V= 45,0 ± 2,2 U mg-1, K0,5= 0,82 ± 0,04 mmol L-1) e NH4+ (V= 31,7 ± 1,6 U mg-1, K0,5= 19,0 ± 0,9 mmol L-1) também ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente da enzima pelo PNFF e Mg2+ foi similar às relatadas para enzimas de outros crustáceos, incluindo caranguejos habitantes de meios mais salinos. Entretanto, a enzima de D. pagei apresentou menor afinidade aparente por íons K+ que as outras espécies já estudadas. A atividade K+-fosfatase da (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce foi estimulada sinergicamente por K+ e NH4+ sugerindo a presença de dois sítios de ligação para estes íons na molécula da enzima. Ouabaína (4 mmol L-1) inibiu a atividade PNFFase total da preparação (≈ 89%), por meio de uma curva monofásica (KI= 225,6, ± 11,3 µ mol L-1), sugerindo que, se presentes na fração microsomal, as duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase apresentam sensibilidades próximas para o inibidor. Ortovanadato (1µmol L-1) inibiu 95% da atividade PNFFase total por meio de uma curva bifásica, reforçando a sugestão da presença de duas isoenzimas na preparação. A hidrólise do ATP pela (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei mantido em água doce ocorreu em sítios de alta (V= 6,4 ± 0,32 U mg-1 e K0,5 = 0,34 ± 0,02 µmol L-1) e baixa afinidade (V= 127,1 ± 6,2 U mg-1e KM = 84 ± 4,1 µmol L-1). Não foi encontrada uma correlação direta entre a afinidade pelo ATP e o habitat de diferentes espécies de caranguejos. A atividade (Na,K)-ATPase específica de D. pagei mantido em água doce foi cerca de 3 vezes menor que relatada para Potamon edulis, única espécie de caranguejo dulcícola para a qual este parâmetro foi relatado. Atividades específicas muito maiores foram encontradas para caranguejos estuarinos, particularmente quando aclimatados a salinidades baixas. A baixa atividade específica determinada para D. pagei pode ser atribuída ao baixo gradiente osmoiônico que este animal mantém entre a hemolinfa e o meio externo, comparado a outros caranguejos dulcícolas, que o caracteriza como uma espécie particularmente bem adaptada ao ambiente dulcícola. A estimulação da atividade da enzima por íons Na+ (V = 133,8 ± 7,3 U mg-1e K0,5= 4,7 ± 0,3 mmol L-1), Mg2+ (V= 136,5 ± 8,0 U mg-1, K0,5= 0,62 ± 0,04 mmol L-1), K+ (V = 131,7± 7,9 U mg-1 e K0,5= 0,47 ± 0,03 mmol L-1) e NH4+ (V= 125,6 ± 6,3 U mg-1, K0,5= 1,90 ± 0,09 mmol L-1) ocorreu por meio de interações sítio-sítio. A afinidade aparente por Na+ da enzima de D. pagei é baixa, se comparada às relatadas para outros animais dulcícolas, e similar às encontradas para espécies estuarino/marinhas. Em contraste, a afinidade aparente por K+ é 2,5 a 5 vezes maior que as determinadas para espécies habitantes de meios mais salinos e aparentemente está mais relacionada ao habitat do animal que a afinidade por Na+. Esta possibilidade é coerente com o fato da (Na,K)-ATPase branquial dos crustáceos apresentar os sítios de ligação de K+ expostos para a hemolinfa, o que possibilita a modulação da atividade da enzima pela concentração de K+ na hemolinfa. Ao contrário do observado para várias outras espécies de caranguejos, a atividade (Na,K)-ATPase branquial de D. pagei não foi estimulada sinergisticamente por K+ e NH4+. Entretanto, a presença de um dos íons no meio reacional provoca o aumento da afinidade aparente da enzima pelo outro em cerca de 3 vezes. Fisiologicamente, esta característica cinética pode ser importante para garantir o transporte de ambos os íons pela enzima, mesmo em presença de concentrações relativamente elevadas do outro. Ouabaína (3 mmol L-1) inibiu a atividade ATPase total (≈ 78%) por meio de uma curva bifásica (KI= 6,21 ± 0,32 µmol L-1 e 101,2 ± 5,1 µmol L-1), reforçando os resultados anteriores no sentido de demonstrar a existência de duas isoenzimas da (Na,K)-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei. Observou-se também uma inibição bifásica por ortovanadato (10 µmol L-1), que inibiu a atividade ATPase total em 85%. O pH ótimo para a atividade V-ATPase branquial de D. pagei foi de 7,5. A modulação da atividade V-ATPase do animal mantido em água doce por ATP (V= 26,5 ± 1,3 U mg-1; K0,5= 3,9 ± 0,2 mmol L-1) e Mg2+ (V = 27,9 ± 1,4 U mg-1; K0,5 =0,80 ± 0,04 mmol L-1) ocorreu por meio de interações cooperativas. Já a inibição da atividade ATPase insensível ao ortovanadato por bafilomicina A1 ocorreu segundo uma curva monofásica (KI= 55,0 ± 2,8 nmol L-1). Cerca de 44 % da atividade ATPase total foi inibida, correspondendo à V-ATPase. A atividade V-ATPase branquial de D. pagei diminuiu acentuadamente em resposta à exposição à salinidade de 21‰. Após 1h de exposição, a atividade diminuiu cerca de 3 vezes, chegando a 4 vezes após 24h, o que indica a atuação de mecanismos eficientes de regulação a curto prazo. Curiosamente, a atividade V-ATPase foi cerca de 2 vezes maior para um tempo de aclimatação de 120h a 21‰, comparado a 24 h, embora 2 vezes menor que a estimada em água doce. Passadas 240 h, a atividade voltou aos baixos níveis observados entre 1h e 24h, o que indica a ação de mecanismos de regulação a longo prazo. Além da diminuição da atividade específica também foi observado aumento da afinidade da enzima por ATP (12 vezes) e Mg2+ (3 vezes) em resposta à exposição dos animais a 21‰. Similarmente, ocorreu um aumento de até 190 vezes na afinidade da enzima por bafilomicina A1. Propõe-se que, em resposta à alteração de salinidade, ocorrem mudanças conformacionais tanto em V1 (onde se encontram os sítios de ligação de ATP e Mg2+) quanto V0 (onde se localiza o sítio de ligação de bafilomicina), resultando numa maior exposição do sítio para o inibidor e no aumento da afinidade por Mg2+ e ATP. Como os aumentos de afinidade são observados já após 1h de exposição, este mecanismo parece ser independente da expressão protéica e, portanto, não estaria relacionado à expressão de isoformas diferentes de alguma das subunidades da enzima. A diminuição da atividade V-ATPase branquial de D. pagei em resposta à exposição a uma salinidade elevada é compatível com os mecanismos propostos para a atuação desta enzima no processo de captura ativa de Na+ em crustáceos dulcícolas. Após 10 dias de aclimatação ainda se tem atividade V-ATPase detectável nas frações microsomais das brânquias posteriores do animal, possivelmente envolvida nas funções de regulação ácido-base e excreção de amônia. Os resultados obtidos para a aclimatação de D. pagei por um período de 10 dias a salinidades entre 5 e 21‰ mostraram também uma diminuição acentuada da atividade V-ATPase em resposta ao aumento da salinidade. Entretanto, com exceção da salinidade mais baixa (5‰) não se observou aumento da afinidade da enzima por bafilomicina, sugerindo que esta alteração seja limitada a tempos de aclimatação mais curtos. Entretanto, também se verificou um aumento acentuado da afinidade da enzima por ATP e Mg2+. / Crustacean arose in the sea but, during evolution, several species invaded lower salinity biotopes, reaching fresh water. The ability of crustaceans to successfully colonize the freshwater biotope depends on efficient mechanisms of hyperosmoregulation. In dilute media, crustaceans\' hemolymph osmolality and ionic composition reflect a balance between diffusive and urinary ion losses, and active ion capture through the gills. The gill (Na,K)- ATPase plays a pivotal role in Na+ capture from dilute environments and its kinetic characteristics are under investigation in recent years, although freshwater crab enzymes are poorly known. According to the most recent model, the apparent affinity for Na+ is the most variable kinetic parameter among gill enzymes from different species, and reflects the salinity of the species\' habitat. Thus, enzymes from species which are well adapted to freshwater usually present higher affinities for Na+. However, several recent results are incompatible with this model. On the other hand, it has been proposed that a V-ATPase is also involved in Na+ capture through the gills of hololimnetic crustaceans. This enzyme is almost completely unknown: its kinetic characteristics have not been studied yet and the relationship between the magnitude of its activity in the gills and the external medium salinity has not been established. This work aimed to characterize the (Na,K)-ATPase and V-ATPase from the posterior gill from the holimnetic crab Dilocarcinus pagei, considered an old fresh water colonizer. The (Na,K)- ATPase was characterized in animals maintained in fresh water, in order to establish a comparison of its kinetic properties with those of enzymes from other crab species that inhabit more saline media. This comparison may enhance our understanding of the biochemical adaptations associated to fresh water invasion. V-ATPase was characterized in animals kept in fresh water or exposed for varying time intervals to a medium of 21? salinity, or else acclimated for 10 days to media of different salinities (5-21?), aiming to establish a relationship between the enzyme specific activity in the gill tissue and the external salinity, and also investigate the mechanisms involved in enzyme activity regulation. The analysis of D. pagei gill microsomes in a continuous-density sucrose gradient revealed two protein peaks (25-35% and 35-45% sucrose), both showing K+-phosphatase, (Na,K)-ATPase and V-ATPase activities. These results indicate the presence of membrane fractions of distinct densities, both presenting the main ion pumps involved in Na+ capture. These membranes may originate from different places in the asymmetric posterior gill epithelium from this crab. Western compared to those reported for other freshwater animals, but similar to those found for estuarine/marine species. In contrast, the apparent affinity for K+ is 2.5 to 5-fold higher than those estimated for species that inhabit more saline media, and is apparently more related to the animals\' habitat than Na+ affinity. This possibility is consistent with the location of the (Na,K)-ATPase in crabs gill tissue, with K+ binding sites exposed to the hemolymph, allowing the direct modulation of enzyme activity by hemolymph K+ concentration. In contrast to data reported for other crab species, D. pagei gill (Na,K)-ATPase activity was not synergistically stimulated by K+ and NH4 +. However, the presence of one of these ions in the reaction medium results in an increase of about 3-fold in the apparent affinity of the enzyme for the other. This kinetic characteristic may be physiologically relevant to assure the transport of both ions, even in the presence of elevated concentrations of the other. Ouabain (3 mmol L-1) inhibited total ATPase activity (? 78%) through a biphasic curve (KI= 6.21 ± 0.32 mol L-1 and 101.2 ± 5.1 mol L-1) reinforcing previous results suggesting the presence of two isoenzymes in the microsomal preparations. A biphasic inhibition by orthovanadate (10 mol L-1) to about 15% residual activity was also observed. Optimal pH for D. pagei gill V-ATPase activity was 7.5. The modulation of enzyme activity of the animal kept in fresh water by ATP (V= 26.5 ± 1.3 U mg-1; K0.5= 3.9 ± 0.2 mmol L-1) and Mg2+ (V = 27.9 ± 1.4 U mg-1; K0.5 =0.80 ± 0.04 mmol L-1) occurred with positive cooperativity. The inhibition of the orthovanadate insensitive ATPase activity by bafilomycin A1 followed a monophasic curve (KI= 55.0 ± 2.8 nmol L-1). About 44 % of total ATPase activity was inhibited, corresponding to the V-ATPase. Dilocarcinus pagei gill V-ATPase activity substantially decreased in response to animal\'s exposure to 21? salinity. After 1h exposure, the activity diminished about 3-fold, reaching 4- fold after 24h, indicating the action of efficient short-time regulation mechanisms. Interestingly, V-ATPase activity was about 2-fold higher after 120h exposure, compared to 24h, although 2- fold lower compared to that estimated in fresh water. After 240h, the activity returned to the low levels observed for 1 and 24 h, indicating efficient long-term regulation. Besides the decrease in specific activity, it was also observed an increase in enzyme\'s apparent affinity for ATP (12 fold) and Mg2+ (3 fold) in response to animal\'s exposure to 21? salinity. Simultaneously, the enzyme\'s affinity for bafilomycin A1 increased up to 190-fold. We propose that, in response to salinity alteration, conformational changes take place both in V1 (in which the ATP and Mg2+ binding sites are located) and V0 (which contains the bafilomycin A1 bindind site), resulting in higher exposition of the inhibitor binding site and also higher affinity for Mg2+ and ATP. As the affinity increases are observed after just 1h exposure, this regulatory mechanism seems to be independent of protein expression and, thus, should not be related to the expression of distinct isoforms of some enzyme subunit. The lowering of gill V-ATPase activity in D. pagei in response to exposure to an elevated salinity is consistent with the mechanisms proposed for the role of this enzyme in active Na+ capture in hololimnetic crustaceans. After 10 days at 21, the gill microsomal fractions still show a little V-ATPase activity, possibly related to acid-base regulation and ammonia excretion processes. The results obtained for the acclimation of D. pagei for 10 days at salinities in the range 5 to 21? also showed a substantial decrease of V-ATPase activity in response to the increase in medium salinity. However, except for 5?, it was not observed an increase of enzyme\'s affinity for bafilomycin, suggesting that this alteration is limited to shorter periods of exposure. However, a significant increase in the enzyme\'s affinity for ATP and Mg2+ was also observed.

O município de Bom Repouso, região da nascente do rio Mogi-Guaçu, está localizado a sudoeste do Estado de Minas Gerais, sendo reconhecido nacionalmente pela produção de morango - o município é responsável por 40% da produção nacional - e batata inglesa - o Estado é o primeiro produtor nacional desta cultura. Esses cultivos, porém, geram impactos ambientais em função do uso excessivo de agrotóxicos. Considerando que tais produtos podem se acumular no solo e serem carreados para o ambiente aquático, cujos efeitos danosos podem se estender aos organismos aquáticos, o objetivo deste trabalho foi avaliar os impactos causados pelos agrotóxicos em sistemas naturais, por meio de análises físicas e químicas e da realização de bioensaios ecotoxicológicos com amostras de solo provenientes das duas principais culturas desenvolvidas na região (morango e batata), utilizando-se como organismos-teste juvenis da espécie Danio rerio (Cypriniformes, Cyprinidae). Os resultados mostram que a região sofre com o impacto das lavouras em função não apenas da utilização de agrotóxicos, mas também pelo uso de fertilizantes. Os bioensaios revelaram baixa toxicidade das amostras, porém efeitos sobre o crescimento e alterações histolpatológicas nas brânquias foram observados nos organismos submetidos aos testes. As alterações histológicas foram, em geral, relacionadas à proliferação celular, dilatação de capilares, deslocamento de epitélio branquial, além de aneurismas e fusão de lamelas. / Bom Repouso, region of Mogi-Guaçu river riverhead, is located in the southwest of Minas Gerais State, in Brazil, is widely recognized by the production of strawberry - the municipality is responsible for 40% of the national production - and potato - the State is the first national producer of this culture. However, the intensive use of pesticides in these cultures creates several environmental impacts. Considering that such products can be accumulated in the soil and carried into the aquatic environment, with hazardous effects being extended to the aquatic organisms, the aim of this study was to evaluate the impacts caused by these pesticides in natural systems. Physical and chemical analysis were made, as well as bioassays with soil samples proceeding from the two main cultures (strawberry and potato), using Danio rerio (Cypriniformes, Cyprinidae) juveniles as test-organisms. The results showed that the Mogi-Guaçu basin suffers not only due pesticides applications, but also due to the fertilizer use. The bioassays revealed low toxicity of the samples. Despite of it, some negative effects in the growth and histopathological alterations in the gills were observed in the organisms submitted to the tests.