Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoseEGJ.pdf: 604842 bytes, checksum: a34879bd40606d248f800a49ed111824 (MD5) Previous issue date: 2006-12-06 / This report shows 2232 times purification of a βNAcetylhexosaminidase from hepatic extracts from the sea mammal Sotalia fluviatilis homogenate with final recovery of 8,4%. Sequenced steps were utilized for enzyme purification: ammonium sulfate fractionation, Biogel A 1.5 m, chitin, DEAESepharose and hydroxyapatite chromatographies. The protein molecular mass was estimated in 10 kDa using SDSPAGE and confirmed by MALDITOF. It was found to have an optimal pH of 5.0 and a temperature of 60?C. Using pnitrophenylNAcetylβDglycosaminide apparent Km and Vmax values were of 2.72 mM and 0.572 nmol/mg/min, respectively. The enzyme was inhibited by mercury chloride (HgCl2) and sodium dodecil sulfate (SDS) / Este trabalho mostra a purifica??o de 2232 vezes de uma βNAcetilhexosaminidase obtida a partir dos extratos hep?ticos do mam?fero marinho Sotalia fluviatilis com recupera??o final de 8,4%. Passos seq?enciais foram utilizados para a purifica??o enzim?tica: fracionamento com sulfato de am?nio e as cromatografias de Biogel A 1.5 m, Quitina, DEAESepharose e Hidroxiapatita. A massa molecular prot?ica foi estimada em 10 kDa usando SDSPAGE e confirmada por MALDITOF. Foi encontrado como pH e temperatura ?timos, 5,0 e 60?C, respectivamente. Os valores de Km e Vm?x aparentes foram 2,72 mM e 0,572 nmol/mg/min, sendo utilizado o pnitrofenilNAcetilβDglicosamin?deo como substrato. A enzima foi inibida pelo cloreto de merc?rio (HgCl2) e dodecil sulfato de s?dio (SDS)

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdilaLML.pdf: 743306 bytes, checksum: 8c2b4b2827dafcc2f2edd7664a266e10 (MD5) Previous issue date: 2006-11-30 / Two b-N-acetylhexosaminidases (F11 e F15) were purified from Echinometra lucunter gonads extracts. The purified enzymes were obtained using ammonium sulfate fractionation, followed by gel filtration chromatographies (Sephacryl S-200, Sephadex G-75 and Sephacryl S-200). The F11 fraction was purified 192.47 -fold with a 28.5% yield, and F15 fraction 85.41 -fold with a 32.3% yield. The molecular weights of the fractions were 116 kDa for F11 and 42 kDa for F15 using SDS-PAGE. In Sephacryl S-200, F15 was 84 kDa, indicating that it is a dimeric protein. When p-nitrophenyl-?-D-glycosaminide was used as substrate, we determined an apparent Km of 0.257 mM and Vmax of 0.704 for F11 and for F15 the Km was 0.235 mM and Vmax of 0.9 mM of product liberated by hour. Both enzymes have optimum pH and temperature respectively at 5.0 and 45 ?C. The enzymes showed inhibition by silver nitrate, while the glucuronic acid was a potent activator. The high inhibition of F15 by N-etylmaleimide indicates that sulphydril groups are involved in the catalysis of synthetic substrate / Neste trabalho foram purificadas e caracterizadas parcialmente duas N-acetil-b- hexosaminidases (F11 e F15) extra?das de g?nadas do equinoderma marinho Echinometra lucunter. As enzimas foram purificadas com protocolo seq?encial por precipita??o com sulfato de am?nio e cromatografias de exclus?o molecular (Sephacryl S-200, Sephadex G-75 e Sephacryl S-200). A fra??o F11 foi purificada 192,47 vezes com recupera??o de 28,5% e F15 85,41 vezes com recupera??o de 32,3%. Suas massas moleculares, determinadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, foram respectivamente 116 e 42 kDa. Em Sephacryl S-200 F15 apresentou massa molecular de 84 KDa, sugerindo que esta enzima possui forma dim?rica. Utilizando-se p-nitrofenil N-acetil-b-glicosamin?deo como substrato obtivemos Km aparente de 0,257 mM e Vmax de 0,704 unidades de absorb?ncia a 405 nm / h para a fra??o 11, e 0,235 mM e Vmax de 0,9 unidades de absorb?ncia a 405 nm / h para F15. Ambas fra??es apresentaram pH e a temperatura ?tima de cat?lise 5,0 e 45 ?C, respectivamente. A atividade N-acetil-b-glicosaminid?sica foi potencialmente inibida por prata, iodoacetamida, N-etilmaleimida e PMSF. A forte inibi??o de F15 por N-etilmaleimida indica o envolvimento de radicais sulfidrila na hidr?lise do substrato sint?tico, caracterizando tamb?m ser uma enzima altamente sensitiva a este sal

A insuficiência renal crônica (IRC) é caracterizada por alterações glomerulares secundárias aos mecanismos adaptativos ocasionados por perda de néfrons funcionantes. Alterações na hemodinâmica glomerular, proliferação celular, influxo de células inflamatórias, desequilíbrio na síntese de proteínas da matriz extracelular glomerular (MECG) e perda da seletividade de carga e/ou tamanho da membrana basal glomerular têm sido apontados como mecanismos envolvidos na expansão mesangial e conseqüente glomeruloesclerose. A participação dos hormônios sexuais na função renal e na evolução da insuficiência renal crônica tem sido sugerida. Os glicosaminoglicanos, especialmente o heparan sulfato (HS), têm sido associados à seletividade glomerular de macromoléculas. O remodelamento podocitário precoce e a proteinuria (PTN) se relacionam com a progressão da IRC. Neste contexto, o acúmulo de MECG, proliferação de miofibroblastos e PTN têm sido apontados como mediadores precoces que precedem as lesões glomerulares e túbulo-intersticiais. Neste estudo, avaliamos as alterações renais precoces (30 dias de IRC) gênero-dependentes em ratos (M) e ratas (F) Wistar submetidos à redução de 5/6 da massa renal (IRC) e à castração (c). Os animais foram divididos em 10 grupos: Controles (C) (CM, CF, CMc, CFc) e sham (CM sham, CF sham); e aqueles submetidos à nefrectomia 5/6: IRCM, IRCF, IRCMc, IRCFc. Os animais foram castrados com 5 semanas e submetidos à nefrectomia 5/6 com 7 semanas de idade. Resultados significativos mostraram que os machos com IRC apresentaram maior PTN, acompanhada de maior comprometimento mesangial, imunomarcação positiva para &#945;-actina e maior concentração de heparan sulfato (HS) comparados com as fêmeas IRC (p<0,05). Estas alterações foram reduzidas nos machos castrados. A análise da morfologia podocitária mostrou raras regiões onde ocorreram alterações podocitárias nos grupos IRC. O conjunto de dados sugere que o hormônio masculino pode participar na manutenção do equilíbrio mesangial e que a PTN participa do processo de expansão mesangial. Adicionalmente, a maior concentração de HS nos machos com IRC sugere que durante o processo de remodelação da MEG, tenha ocorrido geração de HS de novo, funcionalmente defeituoso, comprometendo a barreira de filtração glomerular, corroborando com a perda de seletividade da mesma e, contribuindo para maior PTN neste grupo. As fêmeas com IRC apresentaram alterações mais discretas quando comparadas aos machos; apresentaram decréscimo de HS renal associado a PTN e a castração não alterou este perfil. Em resumo, a PTN ocorre precocemente na IRC, contribuindo para o desequilíbrio da MECG. Os mecanismos envolvidos nestes processos parecem sofrer influência dos hormônios sexuais; e os hormônios masculinos parecem agravar estas alterações, contribuindo possivelmente para um pior prognóstico da doença renal nos machos. / Chronic renal failure (CRF) is characterized by adaptive mechanisms secondary to the loss of functioning nephrons. Glomerular hemodynamics alterations, cellular proliferation, inflammatory cells influx, imbalance between synthesis and degradation of the glomerular extracellular matrix (GECM) and loss of charge and/or size selectivity of the glomerular basal membrane are pointed as mechanisms leading to mesangial expansion and glomerulosclerosis. Additionally, participation of gender related hormones on renal function and progression of CRF have been suggested. We evaluated the effect of castration in renal alterations in males (M) and females (F) Wistar rats, after 30 days of 5/6 reduction of renal mass (CRF). The animals were castrated (c) at 5 weeks old and 7 weeks old 5/6 and sham nephrectomy were done. Groups: Control (C) CM, CM sham, CMc, CF, CF sham, CFc, CRFM, CRFMc, CRFF, CRFFc. CRFM group showed higher proteinuria followed by increased mesangial expansion and &#945;-actin immunostaining. Concomitant higher concentration of heparan sulfate (HS) was also observed when compared to CRFF (p<0.05). These alterations were reduced in CRFMc group. Podocyte morphology analysis through electronic microscopy showed few disorders of foot processes in CRF groups Overall, CRFF group showed fewer alterations compared to males, and a reduction of HS was observed in association with PTN. Castration did not change this profile in female rats. Data suggest that male hormones may participate in the maintenance of the mesangial equilibrium and that PTN collaborated with the mesangial expansion process. Additionally, the higher concentration of HS in CRFM suggest that the remodeling process of the GECM, included a synthesis of de novo HS, that presented a functioning defect, compromising the glomerular filtration barrier and, ultimately corroborated with the loss of its selectivity and consequently with a higher PTN. This set of results leads us to conclude that PTN appears early in the course of CRF, may contribute to renal GECM imbalance and, the mechanisms involved in these processes seem to be influenced by gender-related hormones. In addition, male hormones seem to aggravate renal alterations contributing to a poor prognosis of CRF progression in male rats.