Utilizando uma bibioteca de expressão feita a partir do epitélio do intestino médio da larva de Diatraea saccharalis, nós clonamos e sequenciamos 3 cDNAs completos (DsβglyA, DsβglyB e DsβglyC), além de uma seqüência parcial que teoricamente codificam β-glicosidases. As sequências dos peptídeos obtidos após digestão por tripsina das β-glicosidases βgly1 e βgly2 de D. saccharalis mostraram que DsβglyA codifica a βgly1, caracterizada anteriormente. DsβglyB e DsβglyC provavelmente codificam duas β-glicosidases solúveis com massas moleculares teóricas de, respectivamente, 57,5 KDa e 56,2 KDa. Levando em consideração as semelhanças entre βgly1 e βgly3 e entre DsβglyA e DsβglyC, é razoável supor que DsβglyC codifique a βgly3. Os peptídeos produzidos após a hidrólise de βgly2 por tripsina não são codificados por nenhum dos cDNAs que nós sequenciamos. βgly2 provavelmente é codificada pelo cDNA cuja seqüência ainda está incompleta. A inativação da βgly2 por carbodiimida usando o tio-glicosídeo sinigrina e o O-glicosídeo p-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo resulta na mesma constante de inativação, indicando que o mesmo sítio ativo é responsável pela hidrólise dos dois substratos. A mesma conclusão é obtida calculando o Km de βgly2 para os dois substratos e o Ki da inibição que cada um deles causa na hidrólise do outro. Os resultados indicam que uma só enzima é responsável pela hidrólise de sinigrina e p-nitrofenil β-D-glicosídeo com atividade semelhante. Essa propriedade nunca foi descrita para outra tio- ou O-glicosidase. / We used an expression library made from Diatraea saccharalis midgut epithelium and succeeded in cloning and sequencing three complete cDNAs (DsβGlyA; DsβGlyB; DsβGlyC) plus a partial sequence that hypothetically code for β-glycosidases. The sequence of peptides obtained from the purified D. saccharalis β-glycosidases (βGly1 and βGly2) after trypsin digestion shows that DsβGlyA codes for βGly1, an enzyme that had already been characterized. DsβGlyB and DsβGlyC probably code for two soluble β-glycosidases with, respectively, 503 and 493 amino acid residues and theoretical molecular weighs of 57.5 kDa and 56.2 kDa. Taking into account the similarities of βGly1 and βGly3 and of DsβGlyA and DsβGlyC it is reasonable to suppose that DsβGlyC codes for βGly3. The peptides produced after βGly2 hydrolysis by trypsin could not coded by any of the complete sequenced cDNAs, although they might be code by the still partial sequence we have. We determined the chemical inactivation of βGly2 using the thio-glucoside sinigrin and the O-glycoside p-nitrophenyl-β-D-galactoside, and found the same inactivation constant, indicating that the same active site is responsible for the hydrolysis of the two substrates. The same conclusion is reached determining βGly2 Km for both substrates and the Ki for inhibition of the hydrolysis of one substrate using the other as inhibitor. These results indicated that only one enzyme is responsible for the hydrolysis of sinigrin and p-nitrophenyl-β-D-galactoside with similar activities, which is not a property reported before for any O- or S- β-glycosidase.

Utilizando uma bibioteca de expressão feita a partir do epitélio do intestino médio da larva de Diatraea saccharalis, nós clonamos e sequenciamos 3 cDNAs completos (DsβglyA, DsβglyB e DsβglyC), além de uma seqüência parcial que teoricamente codificam β-glicosidases. As sequências dos peptídeos obtidos após digestão por tripsina das β-glicosidases βgly1 e βgly2 de D. saccharalis mostraram que DsβglyA codifica a βgly1, caracterizada anteriormente. DsβglyB e DsβglyC provavelmente codificam duas β-glicosidases solúveis com massas moleculares teóricas de, respectivamente, 57,5 KDa e 56,2 KDa. Levando em consideração as semelhanças entre βgly1 e βgly3 e entre DsβglyA e DsβglyC, é razoável supor que DsβglyC codifique a βgly3. Os peptídeos produzidos após a hidrólise de βgly2 por tripsina não são codificados por nenhum dos cDNAs que nós sequenciamos. βgly2 provavelmente é codificada pelo cDNA cuja seqüência ainda está incompleta. A inativação da βgly2 por carbodiimida usando o tio-glicosídeo sinigrina e o O-glicosídeo p-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo resulta na mesma constante de inativação, indicando que o mesmo sítio ativo é responsável pela hidrólise dos dois substratos. A mesma conclusão é obtida calculando o Km de βgly2 para os dois substratos e o Ki da inibição que cada um deles causa na hidrólise do outro. Os resultados indicam que uma só enzima é responsável pela hidrólise de sinigrina e p-nitrofenil β-D-glicosídeo com atividade semelhante. Essa propriedade nunca foi descrita para outra tio- ou O-glicosidase. / We used an expression library made from Diatraea saccharalis midgut epithelium and succeeded in cloning and sequencing three complete cDNAs (DsβGlyA; DsβGlyB; DsβGlyC) plus a partial sequence that hypothetically code for β-glycosidases. The sequence of peptides obtained from the purified D. saccharalis β-glycosidases (βGly1 and βGly2) after trypsin digestion shows that DsβGlyA codes for βGly1, an enzyme that had already been characterized. DsβGlyB and DsβGlyC probably code for two soluble β-glycosidases with, respectively, 503 and 493 amino acid residues and theoretical molecular weighs of 57.5 kDa and 56.2 kDa. Taking into account the similarities of βGly1 and βGly3 and of DsβGlyA and DsβGlyC it is reasonable to suppose that DsβGlyC codes for βGly3. The peptides produced after βGly2 hydrolysis by trypsin could not coded by any of the complete sequenced cDNAs, although they might be code by the still partial sequence we have. We determined the chemical inactivation of βGly2 using the thio-glucoside sinigrin and the O-glycoside p-nitrophenyl-β-D-galactoside, and found the same inactivation constant, indicating that the same active site is responsible for the hydrolysis of the two substrates. The same conclusion is reached determining βGly2 Km for both substrates and the Ki for inhibition of the hydrolysis of one substrate using the other as inhibitor. These results indicated that only one enzyme is responsible for the hydrolysis of sinigrin and p-nitrophenyl-β-D-galactoside with similar activities, which is not a property reported before for any O- or S- β-glycosidase.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MULTIFUNCIONAcrescentus.pdf: 2433174 bytes, checksum: e25ac7003e428ac0baf41c43a48f0e42 (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / The genetic manipulation of microorganisms has provided great advances in the production of enzymes involved in the bioconversion of biomass to fuels and chemicals. The main component of hemicellulose that compose the plant biomass is xylan, and its degradation dependent on the synergistic action of several enzymes, including xylanases and β-xylosidases stand as the major. The analysis of the genome of Caulobacter crescentus showed that this bacterium has at least eight genes encoding enzymes involved in the degradation of xylan, three coding for endo-xylanases and five β-xylosidases. In the present report, the enzymatic characterization of a C. crescentus β-glucosidase/β-xylosidase V was performed. For this purpose the xynB5 gene (CCNA 03149) was cloned into pJET1.2 /blunt and subcloned into the expression vector pTricHisA for producing a recombinant protein fused to an amino-terminal His-tag. The recombinant enzyme was induced with IPTG in E. coli (TOP10 strain) and the protein was purified using pre-packaged nickel-sepharose column. The characterization of the pure enzyme showed an optimum pH of 6 for both enzyme activity and a temperature optimum of 50 ° C to β-glucosidase and 60 ° C to β-xylosidase in the presence of NPG and NPX substrates, respectively, while also there has been a small activity in the presence of NPA. The multifunctional protein had its predominant enzyme activity to β-glucosidase (7.6 U ml-1) and a secundary β-xylosidase activity (4.3 U ml-1). In addition to greater specificity for NPG (Km = 0.24  0.008 mM) compared to that obtained for NPX (Km = 0.64  0.032 mM) although the Vmáx for both substrates was not statistically significant difference in optimal conditions of each enzyme (NPG = 0.041  0.001 M min-1 and NPX = 0.055  0.002 M min-1). In fact, data to enzymatic characterization corroborated the suggested in genomic annotation to C. crescentus. These multifunctional characteristics of the protein are important for biotechnological applications like the future reuse of agroindustrial residues / A manipulação genética de microrganismos tem propiciado grandes avanços para a produção de enzimas que possam auxiliar na bioconversão da biomassa vegetal a combustíveis e químicos. O principal componente da hemicelulose que compõem a biomassa vegetal é o xilano, e sua degradação depende da ação sinérgica de várias enzimas, das quais Xilanases e β-Xilosidases destacam-se como as principais. A análise do genoma de Caulobacter crescentus revelou que esta bactéria apresenta pelo menos oito genes envolvidos com a degradação do xilano, três deles codificam para endo-Xilanases, e cinco codificam para β-Xilosidases. O presente trabalho objetivou a caracterização enzimática de uma destas enzimas, a β-Glicosidase/β-Xilosidase de C. crescentus. Para isto o gene xynB5 (CCNA 03149) foi clonado em pJET1.2/blunt e subclonado no vetor de expressão pTricHisA para a produção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidinas amino-terminal. A enzima recombinante foi induzida com IPTG na cepa TOP10 de E. coli e a proteína foi purificada com o auxílio de colunas pré-empacotadas de níquel-sepharose. A caracterização da enzima pura mostrou um pH ótimo igual a 6 para ambas as atividades enzimáticas e uma temperatura ótima de 50 C para -Glicosidase e 60 C para -Xilosidase, na presença dos substratos NPG e NPX, respectivamente, embora também tenha ocorrido uma pequena atividade na presença de NPA. A proteína multifuncional teve sua atividade enzimática preponderante para -Glicosidase (7,6 U mL-1) em relação a atividade de -Xilosidase (4,3 U mL-1). Além de maior especificidade para NPG (Km = 0,24  0,008 mM) em relação à obtida para NPX (Km = 0,64  0,032 mM) embora a Vmáx para ambos substratos não tenham apresentado diferença significativa nas condições ótimas de cada enzima (NPG = 0,041  0,001 M min-1 e NPX = 0,055  0,002 M min-1). Os dados de caracterização confirmaram os sugeridos na anotação genômica para C. crescentus. Estas características multifuncionais da proteína são importantes para futuras aplicações biotecnológicas como o reaproveitamento dos resíduos agroindustriais.

Made available in DSpace on 2017-07-10T13:59:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MULTIFUNCIONAcrescentus.pdf: 2433174 bytes, checksum: e25ac7003e428ac0baf41c43a48f0e42 (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / The genetic manipulation of microorganisms has provided great advances in the production of enzymes involved in the bioconversion of biomass to fuels and chemicals. The main component of hemicellulose that compose the plant biomass is xylan, and its degradation dependent on the synergistic action of several enzymes, including xylanases and β-xylosidases stand as the major. The analysis of the genome of Caulobacter crescentus showed that this bacterium has at least eight genes encoding enzymes involved in the degradation of xylan, three coding for endo-xylanases and five β-xylosidases. In the present report, the enzymatic characterization of a C. crescentus β-glucosidase/β-xylosidase V was performed. For this purpose the xynB5 gene (CCNA 03149) was cloned into pJET1.2 /blunt and subcloned into the expression vector pTricHisA for producing a recombinant protein fused to an amino-terminal His-tag. The recombinant enzyme was induced with IPTG in E. coli (TOP10 strain) and the protein was purified using pre-packaged nickel-sepharose column. The characterization of the pure enzyme showed an optimum pH of 6 for both enzyme activity and a temperature optimum of 50 ° C to β-glucosidase and 60 ° C to β-xylosidase in the presence of NPG and NPX substrates, respectively, while also there has been a small activity in the presence of NPA. The multifunctional protein had its predominant enzyme activity to β-glucosidase (7.6 U ml-1) and a secundary β-xylosidase activity (4.3 U ml-1). In addition to greater specificity for NPG (Km = 0.24  0.008 mM) compared to that obtained for NPX (Km = 0.64  0.032 mM) although the Vmáx for both substrates was not statistically significant difference in optimal conditions of each enzyme (NPG = 0.041  0.001 M min-1 and NPX = 0.055  0.002 M min-1). In fact, data to enzymatic characterization corroborated the suggested in genomic annotation to C. crescentus. These multifunctional characteristics of the protein are important for biotechnological applications like the future reuse of agroindustrial residues / A manipulação genética de microrganismos tem propiciado grandes avanços para a produção de enzimas que possam auxiliar na bioconversão da biomassa vegetal a combustíveis e químicos. O principal componente da hemicelulose que compõem a biomassa vegetal é o xilano, e sua degradação depende da ação sinérgica de várias enzimas, das quais Xilanases e β-Xilosidases destacam-se como as principais. A análise do genoma de Caulobacter crescentus revelou que esta bactéria apresenta pelo menos oito genes envolvidos com a degradação do xilano, três deles codificam para endo-Xilanases, e cinco codificam para β-Xilosidases. O presente trabalho objetivou a caracterização enzimática de uma destas enzimas, a β-Glicosidase/β-Xilosidase de C. crescentus. Para isto o gene xynB5 (CCNA 03149) foi clonado em pJET1.2/blunt e subclonado no vetor de expressão pTricHisA para a produção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidinas amino-terminal. A enzima recombinante foi induzida com IPTG na cepa TOP10 de E. coli e a proteína foi purificada com o auxílio de colunas pré-empacotadas de níquel-sepharose. A caracterização da enzima pura mostrou um pH ótimo igual a 6 para ambas as atividades enzimáticas e uma temperatura ótima de 50 C para -Glicosidase e 60 C para -Xilosidase, na presença dos substratos NPG e NPX, respectivamente, embora também tenha ocorrido uma pequena atividade na presença de NPA. A proteína multifuncional teve sua atividade enzimática preponderante para -Glicosidase (7,6 U mL-1) em relação a atividade de -Xilosidase (4,3 U mL-1). Além de maior especificidade para NPG (Km = 0,24  0,008 mM) em relação à obtida para NPX (Km = 0,64  0,032 mM) embora a Vmáx para ambos substratos não tenham apresentado diferença significativa nas condições ótimas de cada enzima (NPG = 0,041  0,001 M min-1 e NPX = 0,055  0,002 M min-1). Os dados de caracterização confirmaram os sugeridos na anotação genômica para C. crescentus. Estas características multifuncionais da proteína são importantes para futuras aplicações biotecnológicas como o reaproveitamento dos resíduos agroindustriais.

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-05-25T18:55:01Z No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-05-30T12:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T12:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAFB.pdf: 2608429 bytes, checksum: 95d0acfb93ac8153ab8599ee86111dff (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Metagenomics studies allow the direct analysis of a genetic material in an environmental sample and when linked to bioinformatics it gives a powerful tool to explore the role of new genes and proteins not studied before. Constant decreases in the quantity of fossil fuels and their effects in the global economy and natural environment has accelerated researches in alternative fuels such as the second generation ethanol, which can be produced by vegetation biomass. However, this process demands previous hydrolysis of the lignocellulolytic material by hydrolytic enzymes to provide fermentable sugar. β-glucosidases are enzymes which plays an important role at the final step of cellulose breakdown to glucose, thus being considered the rate limiting enzyme in this process of biomass degradation. Many β-glucosidases are already known, however there is an interest to find new enzymes which are tolerant to glucose inhibition and which exhibits high activity at lower temperatures. In this study we searched for β-glucosidases (GH1) using sequences from a metagenomics database from rivers and lakes in the Amazon region developed in our laboratory. We found 3 complete open reading frames (ORFs) related to β-glucosidases and one of them was selected to be produced in E.coli in a heterologous way and to be biochemically characterized. The coding sequence of the protein named AmBgl1-LP was cloned in the plasmid pET-28a and produced an enzyme which has a molecular mass of 53,7 kDa. The enzymatic assays showed that the enzyme was active with an optimum pH of 5.5, optimum temperature of 35 °C and had a Ki for glucose of 23 mM. The enzyme does not apparently perform transgycosylation, according to the assays for pNPβGlu substrate. Supposedly, AmBgl1-LP suffers inhibition by pNPβGlu on concentrations higher than 10 mM. The enzyme showed to be capable of hydrolyzing cellobiose, pNPβGal and pNPβFuc. Thus, the enzyme is promising for use in cocktails for degradation of biomass. / A metagenômica permite estudar diretamente o material genético presente em uma amostra ambiental e quando aliada à bioinformática possibilita explorar o papel de novos genes e proteínas. A constante diminuição na quantidade de combustíveis fósseis e seus efeitos na economia global e no meio ambiente têm acelerado as pesquisas sobre combustíveis alternativos como, por exemplo, o etanol de segunda geração, o qual pode ser obtido a partir de biomassa vegetal. No entanto, o processo necessita que o material lignocelulolítico seja hidrolisado previamente por enzimas, para o fornecimento de açúcares fermentescíveis. As β-glicosidases são enzimas que participam da etapa final de degradação de celulose em glicose e são, portanto, consideradas passo limitante no processo. Muitas β-glicosidases já foram descritas, entretanto ainda há o interesse em encontrar enzimas que sejam resistentes à inibição por glicose e que exerçam sua atividade em temperaturas mais baixas. Neste sentido, o presente trabalho tratou da busca por β-glicosidases da família GH1 utilizando sequências obtidas a partir de um estudo metagenômico de rios e lagos da Amazônia, realizado em nosso laboratório. Foram encontradas 3 fases abertas de leitura (ORFs) correspondentes à esta classe de enzimas e uma delas foi selecionada para ser produzida em E.coli de forma recombinante e ser caracterizada bioquimicamente. A sequência que codifica a proteína denominada AmBgl1-LP foi clonada em vetor pET-28a e expressa em E.coli, rendendo uma enzima com massa molecular de 53,7 kDa. Os ensaios de atividade enzimática revelaram que a enzima é ativa em pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 35 °C. Além disso, a enzima possui um Ki para glicose de 23 mM. A enzima aparentemente não realiza transglicosilação, frente aos ensaios com o substrato pNPβGli. Aparentemente a enzima sofre inibição por este substrato em concentrações maiores que 10 mM. A AmBgl1-LP mostrou-se capaz de hidrolisar celobiose, além de pNPβGal e pNPβFuc. Desta forma, a enzima mostra-se promissora para utilização em coquetéis para degradação de biomassa.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RigobertoGC_DISSERT.pdf: 2462609 bytes, checksum: 1753126d41dc7df59645485b6308c3f5 (MD5) Previous issue date: 2011-05-30 / Background. Gaucher Disease (GD) is a hereditary lysosomal storage disorder characterized by the accumulation of glucosylceramide, mainly in the cells of the reticuloendothelial system, due to a deficiency of the enzyme acid &#946;-glucosidase (GBA). Diagnosis is usually based on measurement of GBA activity in peripheral leukocytes. The purpose of this study was to evaluate the ability of screening for GBA and chitotriosidase activity using Dried Blood Spots on Filter Paper (DBS-FP) to identify individuals at high risk for GD in high-risk populations such as that of Tabuleiro do Norte, a small town in Northeastern Brazil. Methods. Between June 1, 2007 and May 31, 2008, 740 consented residents and descendants of traditional families from Tabuleiro do Norte were submitted to screening with DBS-FP. Subjects with GBA activity <2.19 nmol/h/mL were referred to analysis of GBA and chitotriosidase activity in peripheral leukocytes and in plasma, respectively. Subjects at highest risk for GD (GBA activity in peripheral leukocytes <5.6 nmol/h/mg protein) were submitted to molecular analysis to confirm diagnosis. Results. Screening with DBS-FP identified 135 subjects (18.2%) with GBA activity <2.19 nmol/h/mL, 131 of whom remained in the study. In 10 of these (7.6%), GBA activity in leukocytes was 2.6 5.5 nmol/h/mg protein. Subsequent molecular analysis confirmed 6 cases of heterozygosity and 4 normals for GD. Conclusion. DBS-FP assay was shown to be an effective initial GD screening strategy for high-prevalence populations in developing regions. Diagnosis could not be established from GBA activity in leukocytes alone, but required confirmation with molecular analysis / A doen?a de Gaucher (DG) ? uma patologia de dep?sito de gordura nos lisossomos, de heran?a autoss?mica recessiva, caracterizada pelo ac?mulo do substrato glicosilceramida, principalmente nas c?lulas do sistema reticuloendotelial, em raz?o da defici?ncia da enzima &#946;-glicosidase ?cida (GBA). O diagn?stico, comumente, ? feito pela dosagem da atividade da GBA em leuc?citos perif?ricos. Tabuleiro do Norte (TN), Cear?, Brasil, ? um munic?pio com cerca de 28.000 habitantes com a preval?ncia da DG de 1:4.000 habitantes, possivelmente a mais elevada do Brasil. O objetivo da disserta??o ? avaliar o rastreamento para DG realizado em TN com base na an?lise das atividades enzim?ticas da GBA e da quitotriosidase em amostras Sangue Seco em Papel de Filtro (SSPF). Entre 01 de junho de 2007 a 31 de maio de 2008, 740 indiv?duos residentes e descendentes de fam?lias de TN participaram do rastreamento para DG a partir de amostras de SSPF. Indiv?duos com atividade GBA<2,19 nmol/h/mL foram selecionados para an?lise da atividade da GBA e da quitotriosidase em leuc?citos perif?ricos e no plasma, respectivamente. Os indiv?duos com maiores riscos de DG (atividade de GBA em leuc?citos perif?ricos <5,6 nmol/h/mg de prote?na) foram referenciados para an?lise molecular para confirma??o diagn?stica. A triagem com amostras de SSPF identificou 135 indiv?duos (18,2%) com atividade da GBA<2,19 nmol/h/mL, dos quais 131 permaneceram no estudo. Em dez destes (7,6%), a atividade da GBA em leuc?citos variou de 2,6-5,5 nmol/ h/mg de prote?na, considerados suspeitos da DG. A an?lise molecular subsequente revelou, entretanto, que se tratava de seis indiv?duos heterozigotos para a muta??o G377S e, em quatro deles, n?o foram identificadas muta??es da DG. A an?lise enzim?tica de amostras de SSPF mostrou ser uma estrat?gia eficaz de triagem da DG em popula??es com alto risco, mas a medida da atividade da GBA em leuc?citos deve ser realizada para confirma??o diagn?stica. O diagn?stico de DG em indiv?duos assintom?ticos n?o deve ser firmado baseando-se apenas na an?lise da atividade da GBA em leuc?citos, sendo necess?ria, tamb?m, a confirma??o diagn?stica pela an?lise molecular

Made available in DSpace on 2016-08-16T18:18:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_TONICLEY ALEXANDRE DA SILVA.pdf: 1267921 bytes, checksum: 5198168103d56188dc3c8fa6fbffc2fb (MD5) Previous issue date: 2015-06-26 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / Diabetes mellitus is a chronic disorder affecting the metabolism of carbohydrates, fats and proteins, leading to hyperglycemia, due to reduced sensitivity, or insufficient insulin production. Plant species are often used by the population as a complementary treatment of diabetes among the most cited epecies is Anacardium occidentale L. This study evaluated the effect of hydroalcoholic extract of Anacardium occidentale L. and compounds on the α-amylase and α-glucosidase in vitro and the effects of A. occidentale on the production of insulin and blood glucose levels in murine diabetes. For this systematized up the information on scientific and ethnobotanical data on the anti-diabetes activity A. occidentale, considering the toxicity and pharmacological effects. We evaluated the effect of the aerial parts of A. occidentale and its major compounds (anacardic acid, shikimic, gallic and ellagic) on inhibition of α-glucosidase and α-amylase enzymes in vitro. Evaluated the effect of the extract of A. occidentale flowers in controlling type 2 diabetes, considering the production of glucose, insulin, and in vivo cytokines. To achieve the in vitro assays hydroalcoholic extracts of flowers were prepared (EFL), leaves (EF) and shell (EC) stem of A. occidentale, preparations containing compounds present in the extracts as well as mixtures of such compounds: anacardic acid (AA ), shikimic (AC), gallic (AG) and ellagic (AE) tested in various concentrations (0.5, 5, 50 and 500 mg/Kg). In vitro assays have evaluated the effect of extracts and compounds on the inhibition of α-amylase and human salivary α-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae. To conduct in vivo testing diabetes was induced in male Swiss mice, three months old, with fructose and streptozotocin. The animals were divided into 6 groups of 5 animals each, treated with saline, metformin and EFL in concentrations of 0.5; 5; 50 and 500 mg/Kg evaluated by oral tolerance test glucose, glycemic variation, consumption of water and feed, changes in body weight, concentration of glycated hemoglobin, insulin, frutosaminas, triglycerides, total cholesterol and HDL and LDL fractions, production of cytokines IFN-, TNF-, IL-4 and IL-10. The in vitro results showed that the EFL showed the highest inhibitory effect on the activity of α-amylase and α-glucosidase than the other extracts enzymes even at low concentrations, possibly due to the presence of anacardic acid and ellagic acid, since these two compounds present in the crude extract, when evaluated alone, or in combination with shikimic acid showed a similar effect to the EFL. In vivo the EFL reduced the glycemic peak, consumption of water and feed, the concentration of glycated hemoglobin, frutosaminas, triglycerides, total cholesterol and LDL. On the other hand, occurred in the same group increase in the HDL fraction, and increase in the concentration of anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-4. Together, the results indicate that the EFL with proven effectiveness in controlling diabetes mellitus due to enzyme inhibition, and reducing glucose homeostasis in insulin production, possibly due to the increase in peripheral sensitivity. / A diabetes mellitus é um distúrbio crônico, que afeta o metabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas, ocasionando hiperglicemia, em virtude de redução da sensibilidade ou da produção insuficiente de insulina. Espécies vegetais são frequentemente utilizadas pela população como tratamento complementar da diabetes entre as epecies mais citadas está Anacardium occidentale L. O presente estudo avaliou o efeito do extrato hidroalcoólico de Anacardium occidentale L. e de compostos sobre as enzimas α-amilase e α-glicosidase in vitro e os efeitos de A. occidentale sobre a produção de insulina e a glicemia sanguinea no diabetes murino. Para isso sistematizou-se as informações sobre dados etnobotânicos e científicos acerca da atividade anti-diabetes de A. occidentale, considerando a toxicidade e os efeitos farmacológicos. Avaliou-se o efeito das partes aéreas de A. occidentale e de seus compostos majoritários (ácidos anacárdico, chiquímico, gálico e elágico), sobre inibição das enzimas α-glicosidase e α-amilase in vitro. E avaliou-se o efeito do extrato das flores de A. occidentale no controle da diabetes tipo 2, considerando a produção de glicose, insulina e citocinas in vivo. Pra realização dos ensaios in vitro foram preparados os extratos hidroalcoólicos das flores (EFL), folhas (EF) e casca (EC) do caule de A. occidentale e preparações com compostos presentes nos extratos, bem como misturas desses compostos: ácido anacárdico (AA), chiquímico (AC), gálico (AG) e elágico (AE) testados em varias concentrações (0,5; 5; 50 e 500 mg/Kg). Os ensaios in vitro avaliaram a ação dos extratos e dos compostos sobre a inibição da α-amilase de saliva humana e a α-glicosidase de Saccharomyces cerevisiae. Para realização dos ensaios in vivo foi induzida diabetes em camundongos Swiss machos, três meses de idade, com frutose e estreptozotocina. Os animais foram divididos em 6 grupos com 5 animais cada, tratados com salina, metformina e EFL nas concentrações de 0,5; 5; 50 e 500 mg/Kg avaliados por do teste de tolerância oral a glicose, variação glicêmica, consumo de água e ração, variação ponderal, concentração de hemoglobina glicada, insulina, frutosaminas, triglicérides, colesterol total e frações HDL e LDL, produção das citocinas IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10. Os resultados in vitro mostraram que o EFL apresentou o maior efeito inibitório da atividade das enzimas α-amilase e α-glicosidase do que os demais extratos, mesmo nas menores concentrações, possivelmente devido a presença do ácido anacárdico e elágico, já que estes dois compostos presentes no extrato bruto, quando avaliados isoladamente, ou em associação com o ácido chiquímico, apresentaram efeito similar ao EFL. Na avaliação in vivo o EFL reduziu o pico glicêmico, o consumo de água e de ração, a concentração de hemoglobina glicada, frutosaminas, triglicérides, colesterol total e fração LDL. Por outro lado, ocorreram nesse mesmo grupo aumento da fração HDL do colesterol e aumento na concentração de citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-4. Em conjunto, os resultados indicam que o EFL apresenta ação efetiva no controle da diabetes mellitus, devido a inibição enzimática, regulação glicêmica e redução da produção de insulina, possivelmente em decorrência do aumento da sensibilidade periférica.

Na última década, a análise da estrutura proteica baseada em teoria de redes/grafos tem emergido. A abstração da estrutura tridimensional proteica em forma de uma rede, leva em consideração os resíduos de aminoácidos e suas interações através do espaço, e apresenta um conjunto de conexões e propriedades mais complexas do que aquelas visualizadas apenas com a estrutura covalente. A análise da estrutura proteica identificou que as proteínas pertencem às redes de classes de \"mundo pequeno\" (small-world) e \"sem escala\" (scale-free), o que significa que seus resíduos de aminoácidos são altamente agregados e que existem poucas conexões entre 2 resíduos quaisquer da proteína. A identificação dos resíduos com alto grau de conexão, chamados centrais (\"resíduos hubs\"), é feita pela determinação do caminho mais curto que conecta um dado resíduo aos demais compreendidos nesta rede. A remoção destes resíduos centrais (hubs) afeta a integridade da rede de forma mais contundente diferentemente da remoção de resíduos que não são centrais. Até o momento estes \"resíduos hubs\" ainda não foram experimentalmente correlacionados com as propriedades enzimáticas de proteínas. Para tal finalidade, a estrutura terciária de uma &#946;-glicosidase de Spodoptera frugiperda (Sf&#946;gli) foi analisada como uma rede. Após calcular-se os caminhos médios entre todos os pares de aminoácidos da &#946;-glicosidase, encontrou-se 11 resíduos centrais (\"resíduos hubs\"). Alinhamento de sequências e comparações estruturais indicaram alta conservação destes \"resíduos hubs\". Nosso objetivo foi produzir esta &#946;-glicosidase mutando-se a maioria dos \"resíduos hubs\" e 3 aminoácidos não centrais (\"não hubs\"), expressar estes mutantes em E. coli, determinar suas propriedades enzimáticas como atividade catalítica e preferência pelo substrato e verificar a estabilidade destes mutantes em experimentos de inativação térmica. Os resultados obtidos sugerem que mutações nos \"resíduos hubs\" não afetam as propriedades catalíticas, contudo as enzimas com mutações nos \"resíduos hubs\" apresentaram uma menor estabilidade térmica. Estes resultados sugeriram que os \"resíduos hubs\" são relevantes na difusão da energia cinética (vibração) introduzida na estrutura desta &#946;-glicosidase pelo seu aquecimento / In recent years, graph-theoretic approaches have established that protein structures can be modeled as complex networks of interacting residues. Proteins structures can be represented as small-world and scale-free networks that are usually highly clustered with few links connecting any pair of nodes. The identification of nodes with high connection degrees, called hubs, is made by determining the shortest path linking one amino acid to the further nodes comprising the network. Targeted removal of the hubs has greater affect on the integrity of the network structure in contrast to a random removal of amino acid residues comprising the network. Nevertheless these hubs had not previously been correlated with enzymatic properties. The tertiary structure of &#946;-glycosidase from S. furgiperda (Sf&#946;gly) was analyzed as a network. After calculating the averaged paths between all pairs of amino acid residues of Sfgly, we defined 11 hubs, which have the highest centrality on the network. Sequence alignment and structural comparison showed that these hubs residue are conserved among &#946;-glycosidases. Our goal was to mutate most hubs and 3 ´non-hubs´ residues from Sf&#946;gly, express these mutant enzymes in E. coli, test their enzymatic properties as catalytic efficiency and substrate preference, and verify the thermal stability of these mutants. The results implied that mutations in these hubs do not cause changes in catalytic properties although enzymes containing mutations in hubs showed lower thermal stability. Based on that, it was suggested that hub residues are important in the diffusion of kinetic energy (vibrations) introduced in the Sf&#946;gly structure by heating

Submitted by Gabriela Lopes (gmachadolopesufpel@gmail.com) on 2016-09-26T14:16:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Simone_Pacheco_Frutos da família Myrtaceae_Caracterização físico-química e potencial .pdf: 1364587 bytes, checksum: 6df19769efc9216d28d9614070c8e6af (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2016-09-26T18:34:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Simone_Pacheco_Frutos da família Myrtaceae_Caracterização físico-química e potencial .pdf: 1364587 bytes, checksum: 6df19769efc9216d28d9614070c8e6af (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T18:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação_Simone_Pacheco_Frutos da família Myrtaceae_Caracterização físico-química e potencial .pdf: 1364587 bytes, checksum: 6df19769efc9216d28d9614070c8e6af (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / As espécies vegetais Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), Eugenia uniflora (pitanga), Eugenia pyriformis (uvaia), Psidium cattleianum (araçá) e Syzygium cumini (jambolão) estão presentes na Floresta Atlântica e são utilizadas pela população, para tratar diversas patologias, especialmente o diabetes melito tipo 2. Entretanto, a eficácia destes tratamentos e o mecanismo envolvido ainda não foram totalmente elucidados. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo principal avaliar o potencial dos compostos naturais destes frutos em inibir as enzimas α-amilase e α- glicosidase que estão envolvidas no metabolismo de carboidratos. Estes frutos também foram avaliados físico-quimicamente, realizando-se dentre outras análises a quantificação dos compostos fenólicos totais e a determinação da atividade antioxidante (métodos ABTS e DPPH). Os extratos metanólicos de P. cattleianum (acesso 44), S. cumini e E. pyriformis (acessos 11 e 15) inibiram de forma significativa a atividade da α-amilase. Os extratos metanólicos de P. cattleianum (acessos 44 e 87) também inibiram a atividade da α-glicosidase, utilizando-se os substratos maltose e sacarose. Em virtude da atividade antioxidante, da elevada quantidade de compostos fenólicos e da capacidade de inibição das enzimas digestivas do metabolismo de carboidratos, os frutos de P. cattleianum (acessos 44 e 87), S. cumini e E. pyriformis (acessos 11 e 15) podem apresentar potencial uso no manejo da hiperglicemia pós-prandial. / Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), Eugenia uniflora (pitanga), Eugenia pyriformis (uvaia), Psidium cattleianum (araçá) and Syzygium cumini (jambolão) grow in the Brazilian Atlantic Forest and their fruits are commonly used as medicine to treat diseases related to carbohydrate metabolism, such as diabetes. The effectiveness of these treatments has not been demonstrated neither the biochemical mechanism involved. Therefore this study was devised to evaluate the potential of natural compounds of these fruits to inhibit key enzymes α-amylase and α- glucosidase involved in the carbohydrate metabolism. The fruits were also subjected to physicochemical characterization, quantification of phenolics compounds and antioxidant activity (ABTS and DPPH methods). The methanolic extracts of P. cattleianum (access 44), S. cumini, E. pyriformis (accesses 11 and 15) distinctively inhibited α-amylase activity. The methanolic extracts of P. cattleianum. (accesses 44 and 87) also inhibited α-glycosidase activity, with either maltose or sucrose as substrate. By having antioxidant activities, a fairly content of phenolic compounds, and capacity to inhibit carbohydrate digestive enzymes, P. cattleianum (access 44 and 87), S. cumini and E. pyriformis (accesses 11 and 15) could be good candidates to be used in the management of postprandial hyperglycemia.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KatiaCB_DISSERT.pdf: 2815552 bytes, checksum: 5538a2db54454e17355a1ea7d2b7b8e5 (MD5) Previous issue date: 2011-02-15 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Fruits are rich sources of bioactive compounds, including phenolic compounds. Tropical fruit cultivation is an important productive segment in Brazilian Northeast. Its industrialization generates solid wastes as co-products, with potential environmental impact. Considering the recognized bioactive content of fruit and its derivatives, this research has the objective of investigating acerola (Malpighia glabra L.), caj?-umbu (Spondia ssp), jambolan (Syzygium cumini) and pitanga (Eugenia uniflora) dried wastes obtained by spouted bed drier. It was analyzed the physical-chemical composition, solubility and microphotographic aspect of these dried wastes. Besides this, it was also evaluated the bioactive content, antioxidant activity and inhibitory activity against aamylase and a-glycosidase enzymes of water and ethanol (70%, 80% e 100% v/v) extracts prepared from fruit dried wastes, as well as their possible correlations. The dried fruit wastes showed high phenolic (606.04 to 3074.6 mg GAE eq/100 g sample), anthocyanin (478.7 mg/100 g for jambolan) and ascorbic acid (2748.03 mg/100 g for acerola) contents, as well as high antioxidant DPPH activity (14.27 a 36.30 mg Trolox eq/g sample). The extracts exhibited moderate to high a-amylase inhibition (23.97% a 76.58%) and high &#945;-glycosidase inhibition, which 99.32% peak was reached for ethanol 70% pitanga extracts. It was also observed great positive correlation between phenolic content and DPPH activity (0.97 for acerola), anthocyanin (0.95 for jambolan) and &#945;- glycosidase inhibition (0.98 for acerola). The &#945;-glycosidase inhibition also correlated well with the antioxidant activity for all fruit extracts. The results show that these dried fruit wastes are valuable material for further applications as functional ingredients / As frutas possuem importantes compostos bioativos, dentre eles os compostos fen?licos. O cultivo de frutas tropicais ? um importante segmento produtivo do Nordeste Brasileiro, mas sua industrializa??o gera res?duos s?lidos como c?-produtos da atividade, pass?veis de gerar impacto ambiental. Tendo em vista o reconhecido conte?do bioativo de frutas e seus c?-produtos, objetivou-se estudar o baga?o desidratado da acerola (Malpighia glabra L.), caj?-umbu (Spondia ssp), jambol?o (Syzygium cumini) e pitanga (Eugenia uniflora) obtidos em secador de leito de jorro. A partir disso, foi analisada a composi??o f?sico-qu?mica, solubilidade e aspecto microfotogr?fico dos baga?os secos. Al?m disso, foi avaliada a concentra??o de compostos bioativos, atividade antioxidante e atividade inibit?ria contra as enzimas &#945;-amilase e &#945;-glicosidase do extrato aquoso e extratos etan?licos (70%, 80% e 100% v/v) preparados a partir dos baga?os desidratados, bem como suas correla??es. Os p?s de fruta apresentaram elevado teor de compostos fen?licos (606,04 a 3074,6 mg GAE eq/100 g amostra), antocianinas (478,7 mg/100 g para jambol?o) e ?cido asc?rbico (2748,03 mg/100 g), bem como expressiva atividade antioxidante medida pelo m?todo DPPH (14,27 a 36,30 &#956;g Trolox eq/g amostra). Os extratos foram capazes de expressar inibi??o da &#945;-amilase de moderada a alta (23,97% a 76,58%) e expressiva inibi??o da &#945;-glicosidase, cujo m?ximo de 99,32% foi alcan?ado pelos extratos etan?licos 70% da pitanga. Foi observada correla??o positiva entre o teor fen?lico e atividade antioxidante (0,97 para acerola), antocianinas (0,95 para jambol?o), inibi??o da &#945;-amilase (0,99 para jambol?o) e inibi??o da &#945;-glicosidase (0,93 para pitanga) e dessas duas ?ltimas com a atividade antioxidante para todos os frutos estudados. Os dados apresentados demonstram que os res?duos desidratados constituem valioso material de estudo para aplica??es como ingredientes funcionais