Diversos estudos buscam identificar novas moléculas com ações regulatórias sobre a via de sinalização da insulina e consequentemente na homeostase da glicose. Assim, este trabalho visa avaliar o potencial de extratos de frutos no controle da homeostase glicêmica. Os frutos avaliados foram o morango (cv. Toianoca, Camarosa, Oso Grande e Camino Real), a amora-preta e a framboesa vermelha, em dois tempos de amostragem, sendo considerado como tempo A1 e tempo A2. As amostras foram caracterizadas quanto ao seu conteúdo de fenólicos totais, conteúdo de antocianinas monoméricas, capacidade antioxidante, avaliada pelos métodos DPPH e ORAC, ácido elágico total, capacidade de inibição da alfa-glicosidase e captação de glicose e lipólise em tecido adiposo de camundongos (ensaio explante). Dentre os frutos, no primeiro tempo de amostragem, a amora-preta e o morango, cv Oso Grande, foram os que apresentaram maior conteúdo de fenólicos totais (62,36 e 34,89 mg AG/g, respectivamente) no entanto não foram mantidos esses valores no segundo tempo de amostragem, com concentração 30% e 60% inferior, respectivamente; e maior concentração de antocianinas monoméricas (45,33 mg/g e 3,09 mg/g, respectivamente). Em relação a inibição da enzima alfa-glicosidase, avaliado em extrato metanólico, o fruto framboesa vermelha e o morango cv. Camino Real foram as que apresentaram alto potencial inibitório nos dois tempos de amostragem (IC50 0,47 mg FT e IC50 0,57 mg FT para framboesa vermelha e IC50 0,50 mg FT e IC50 0,46 mg FT para Camino Real). Quando avaliado os extratos enriquecidos em fenólicos, o valor de IC50 com maior potencial dentre os frutos avaliados foi da amora-preta, nos dois tempos A1 e A2 (0,0023 mg FT e 0,0021 mg FT, respectivamente). Para captação de glicose em tecido adiposo explate, ao utilizar a insulina para estimular a captação de glicose juntamente com o tratamento (extrato), esse estimulo foi efetivo no aumento da captação de glicose somente com as amostras cv. Camino Real e cv. Oso Grande. Isso pode ser explicado pela alta correlação encontrada de antocianinas identificadas no fruto, como pelargonidina-3-O-glicosídeo. Por outro lado, somente a amora-preta A1 aumentou a lipólise em condição basal, mas nenhuma fruta foi eficiente para reduzir a lipólise em condição estimulada pelo isoproterenol. Sendo assim, frutas vermelhas podem ser boas fontes de compostos bioativos, principalmente antocianinas, as quais podem ter corroborado positivamente com os resultados. / Several studies seek to identify new molecules with regulatory actions on the insulin signaling pathway and consequently on glucose homeostasis. Thus, this work aims to evaluate the potential of fruit extracts in the control of glycemic homeostasis. The fruits evaluated were strawberry (cv. Toianoca, Camarosa, Oso Grande and Camino Real), blackberry and red raspberry, in two sampling times, being considered as time A1 and time A2. Fruits were evaluated for total phenolic, monomeric anthocyanins and contents, antioxidant capacity, evaluated by DPPH and ORAC methods, alpha-glycosidase inhibition capacity and glucose uptake and lipolysis in adipose tissue of mice (explant assay). Among the fruits, in the first sampling period, blackberry and strawberry, cv. Oso Grande, showed the highest total phenolic content (62.36 and 34.89 mg AG / g, respectively), with a decrease of the 30% and 60%, respectively, in the second sampling time; and higher monomeric anthocyanins concentration (45.33 mg/g and 3.09 mg/g, respectively). The methanolic extracts of raspberry and the strawberry cv Camino Real (A1 and A2) presented the highest alpha-glucosidase inhibitory potential. Otherwise, the enriched-polyphenol extract of blackberry (A1 and A2) presented the highest potential among the evaluated fruits. Adipose tissue treated with strawberry cv. Camino Real and cv. Oso Grande was effective in increasing glucose uptake stimulated by insulin. This can be explained by the high correlation with the anthocyanins pelargonidin-3-O-glycoside identified in this fruit. In addition, blackberry A1 was the only sample to increase the lipolysis in basal condition, but all other fruits were not effective to decrease lipolysis in stimulated condition. Thus, berries could be a good sources of bioactive compounds to maintain the glucose homeostasis.

Nesse projeto trabalhamos com uma β-glicosidase digestiva da larva da lagarta Spodoptera frugiperda (Sfβgli50, 50 kD - AF052729), expressa na forma de proteína recombinante em E.colli. O nosso objetivo foi estudar o papel de dois resíduos de aminoácidos envolvidos na atividade catalítica da Sfβgli50. O primeiro resíduo estudado foi o Y456, envolvido na afinidade pela porção redutora do substrato (aglicone), o segundo resíduo foi o N329 envolvido na modulação do pH ótimo. Estudo do papel do resíduo Y456 na afinidade pelo aglicone do substrato. O sítio-ativo da Sfβgli50 é formado por quatros subsítios (-1, +1, +2, e +3). O subsítio que acomoda a porção não-redutora do substrato (glicone) recebe numeração negativa (-1), já os subsítios que acomodam a porção redutora do substrato (aglicone) recebem números positivos (+1, +2 e +3). Trabalhando com duas β-glicosidases de plantas (milho e sorgo), Cicek et al. (2000) demonstraram que uma pequena porção da extremidade C-terminal destas β-glicosidases (462SSGYTERF469 - numeração da enzima do sorgo) está envolvida na especificidade pelo aglicone do substrato, sendo que muitos desses aminoácidos são conservados em outras β-glicosidases da família 1. O alinhamento das sequências destas duas enzimas com a Sfβgli50 sugere que Y456 pode fazer parte do sítio de ligação do aglicone nesta β-glicosidase de inseto. Utilizando experimentos de mutação sítio-dirigida, o Y456 foi substituído por uma alanina (mutante Y456A) sendo que este foi expresso na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando o vetor pT7-7. O mutante Y456A foi parcialmente purificado através de uma cromatografia hidrofóbica em sistema de FPLC, e caracterizado utilizando diversos inibidores competitivos (glucono δ-lactona, celobiose, celotriose, pentilbglicosídeo e octilbtioglicosídeo). Comparando os Kis obtidos para a Sfβgli50 selvagem e mutante Y456A com os inibidores glucono δ-lactona, celobiose e celotriose, foi proposto que Y456 encontra-se no subsítio +1 do sítio ativo da Sfβgli50. Já através da comparação entre os inibidores octilβtioglicosídeo e pentilβglicosídeos constatou-se que Y456 interage com uma porção polar do aglicone do substrato, talvez através de uma ligação de hidrogênio. Baseando-se nestes Kis foi calculada a energia de associação de resíduos de glicose e grupos alquila nos subsítios +1 e +2, indicando que o subsítio +1 do mutante Y456A tem uma especificidade mais ampla frente à ligantes polares (glicose) e apolares (grupos butil) do que a enzima selvagem. Sabendo que este resultado foi obtido removendo-se um resíduo com um grupo polar na cadeia lateral (Y456), estes dados estão de acordo com a hipótese de que a especificidade dos subsítios da região de ligação do aglicone é determinada por um balanço entre resíduos polares e apolares (Marana et al., 2001). Estudo do papel do resíduo N329 na modulação do pH ótimo. O mecanismo de catálise da Sfβgli50 é dependente de dois resíduos de ácido glutâmico: um doador de prótons (E187 - pKa= 7,5) e um nucleófilo (E399 - pKa = 5,0). Sendo o pH ótimo da Sfβgli50 (6,2) uma média aritmética dos pKas destes dois resíduos catalíticos. Uma análise estrutural do sítio ativo da Sfβgli50 mostra que o resíduo N329 forma ligações de hidrogênio com o resíduo E187 (doador de prótons), talvez atuando na modulação do seu pKa. Para estudar o papel do resíduo N329 na atividade da Sfβgli50 foram construídos 3 mutantes, nos quais tal resíduo foi substituído por alanina (N329A), ácido aspártico (N329D) e uma glutamina (N329Q). Os mutantes foram expressos na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando os vetores pT7-7 e pCal-n-Flag. Entretanto, tentativas de purificação das SfΒgli50 mutantes através de cromatografia hidrofóbica foram infrutíferas, sugerindo uma possível inativação destas enzimas. Esta hipótese foi reforçada pela purificação das Sfβgli50 mutantes e selvagem contendo o peptídeo de fusão CBP (calmodulin binding peptide) através de cromatografia de afinidade. Este experimento demonstrou que as enzimas mutantes eram de fato inativas. Frente à estes resultados não foi possível concluir a caracterização do efeito do pH na atividade catalítica das Sfβgli50 mutantes N329A, N329D e N329Q. Por fim, foi proposto que a inativação da Sfβgli50 devido à mutações na posição N329 pode resultar de uma desnaturação das enzimas mutantes ou do reposicionamento do ácido catalítico devido à perda ou alteração da interação com o resíduo 329. / In this project it was studied the role of two residues (N329 and Y456) in the catalytic activity of a digestive β-glycosidase from Spodoptera frugiperda (SfΒgli50 - AF052729). N329 is believed to modulate the enzyme pH optimum, whereas Y456 may participate in the binding of the substrate aglycone. Role of Y456 The peptide 462SSGYTERF469 of the sorghum β-glycosidase is proposed to be part of the aglycone binding site in that enzyme. Some of those residues are conserved in Sfβgli50, among them Y456. Using site-directed mutagenesis Y456 was replaced by A and this mutant (Y456A) expressed in bacteria. Following that, this mutant enzyme was partially purified using hydrophobic chromatography. Inhibition experiments showed that binding of δ-gluconolactone, which occupies subsite -1, is not affected by that mutation. In contrast, Ki values for cellobiose (that binds to subsites -1 and +1) and cellotriose (that binds to subsites -1, +1 and +2) are two-fold higher than those of wild-type enzyme, indicating that mutation Y456A decrease the interaction with these oligocellodextrins. Moreover, binding of pentyl and octylβglucosides is not affected by mutation Y456A, suggesting that Y456 interacts with aglycone polar groups. Finally, evaluation of glucose and butyl binding energies in subsite +1 revealed that mutant Y456A specificity is broader than that of wild-type enzyme. Role of N329 A structural model of Sfβgli50 active site revealed that catalytic proton donor (E187) may interact with N329. In order to study the role of this interaction in the activity of Sfβgli50, N329 was replaced by A, D and Q (mutants N329A, N329D and N329Q, respectively). These mutants were expressed as recombinant proteins in bacteria and purified through affinity chromatography, revealing that Sfβgli50 was inactivated by those mutations. It was proposed that this inactivation may be due to protein desnaturation or a wrong positioning of the catalytic proton donor.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-04Bitstream added on 2014-06-13T20:04:38Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_afa_dr_rcla.pdf: 997227 bytes, checksum: 92775cbd61cca9ee00b5f1a54feef2bf (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As α-glicosidases (EC 3.2.1.20) são exoamilases que atuam nas ligações glicosídicas α-1,4 da extremidade nãoredutora, preferencialmente em pequenos oligossacarídeos para liberar α-glicose. Os objetivos desse trabalho foram purificar a α-glicosidase produzida, em fermentação submersa, pelo fungo Thermoascus aurantiacus CBMAI 756; caracterizar a enzima purificada; avaliar a ação sobre os derivados de amido e substratos sintéticos e construir um biblioteca de cDNA de Thermoascus aurantiacus para isolar o gene codificando para esta característica. As estratégias adotadas para isolar a α-glicosidase foram: a) concentração do extrato enzimático bruto usando uma membrana de ultrafiltração, b) por precipitação com sulfatodeamônio, c) cromatografias detroca aniônica (Q-Sepharose)e a filtração em gel(Sephacryl S-200 e Superose 12). Após o último passo, filtração em gel na coluna Superose 12, obteve-se uma atividade específica final de 404 (U/mg proteína) e um fator de purificação de 173 vezes. A eletroforese em SDS-PAGE usando amostra semi-desnaturada possibilitou aobservação de uma única banda protéica, a qual correspondeu à banda observada em gel de atividade e no gel específico para glicoproteína. A aparente massa molecular da enzima em SDS-PAGE foi83 kDa. Essa enzima apresentou 42% de carboidrato ligado à estrutura protéica. A atividade máxima foi observada em pH 4,5 e a 70°C. A enzima mostrou-se estável nas faixas de pH 3,0-9,0 e perdeu 40% da atividade original nas temperaturas de 40, 50 e 60°C, incubadas por 1hora. Na presença dos íons Na+, Ba2+, Co2+,Ni2+, Mg2+, Mn2+,Al3+, Zn2+ e Ca2+ a enzima manteve 90-105% da atividade máxima e foi inibida por Cr3+, Ag+ eHg2+. Baseados no cálculo do IC50, a hidrólise da maltose foi mais sensível a castanospermina (0,015 mM) do que a acarbose (0,11 mM) e voglibose (0,06 mM). OKm foi 0,07 μM e o Vmax... / α-Glucosidase (EC 3.2.1.20) are exoamylase that act on α-1,4 bonds from nonreducing end, preferentially short oligosaccharides to release α-glucose. The objective of this work was to purify the -glucosidase produced in submerged fermentation, with the fungus Thermoascus aurantiacus CBMAI 756, characterize the purified enzyme and to evaluate its action on starch derivatives and synthetic substrates, and construction of cDNA library of Thermoascus aurantiacus. The strategies adopted to isolate the -glucosidase were: a) concentration of crude enzyme using a membrane ultra filtration b) by ammonium sulphate precipitation, c) anion exchange chromatography (Q-Sepharose) and gel filtration (Sephacryl S-200 and Superose). After the last step, gel filtration on Superose 12 column, it was obtained a final specific activity of 404 (U/mg protein) and 173-fold enzyme purification. The electrophoresis in SDS-PAGE using semi-denatured sample allowed the observation of a single protein band, which corresponded to the bands obtained in gel of -glucosidase activity and in a specific gel for glycoprotein. The apparent molecular mass of the enzyme in SDSPAGE was 83 kDa. This enzyme exhibited a carbohydrate content of 42%. Maximum activity was observed at pH 4.5 and at 70°C. It was stable in the pH range 3.0-9.0 and the enzyme lost 40% of its initial activity at 40, 50 and 60 °C, incubated for 1 h. In the presence of ions Na+, Ba2+, Co2+, Ni2+, Mg2+, Mn2+, Al3+, Zn2+, Ca2+ the enzyme maintained 90-105% of its maximum activity and was inhibited by Cr3+, Ag+ and Hg2+. Based on IC50 values, hydrolysis of maltose was more sensitive to castanospermine (0.015 mM) than acarbose (0.11 mM) and voglibose (0.06 mM). The Km was 0.07 μM, and the Vmax was 318.0 μmol/min/mg. The - glucosidase showed a transglycosylation property, by the release of oligosaccharides after 3h of incubation with maltose... (Complete abstract click electronic access below)

As β-glicosidades são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas. São amplamente encontradas na natureza em plantas, frutas e animais. Possuem diversas aplicações biotecnologicas podendo ser amplamente empregadas na indústria de alimentos e bebidas afim de melhorar a qualidade de aroma, sabor, coloração e viscosidade do produto. Este estudo apresenta o processo de imobilização de uma β-glicosidase comercial em suporte de quitosana e a obtenção de um derivado ativo e estável, para ser aplicado no processamento de vinhos aumentando a complexidade aromática de vinhos joven. A imobilizaçãpo foi realizada em suporte de quitosana, reticulado com glutaraldeído, atingindo 100% de eficiência na imobilização com 50mg de proteína por grama de suporte e 65% de atividade recuperada no derivado imobilizado. A imobilização além de contribuir para um maior controle do processo, alterou algumas características da β-glicosidase, a qual demonstrou manter uma atividade mais alta em faixas mais amplas de pH, quando comparada a enzima livre. A β-glicosidase imobilizada apresentou grande estabilidade podendo ser reutilizada por mais de 30 ciclos, mantendo sua atividade inicial. A aplicação da β-glicosidase no vinho foi realizada em batelada, por um tempo de 90 min, sob agitação. A análise por SPME/GC-MS revelou um aumento na concentração terpenos, quando comparada a amostras não tratadas. Houve um aumento na concentração de geraniol, citronelol, linalol e nerol. A aplicação da β-glicosidase foi bem sucedida, liberando os compostos aromáticos em um curto períuodo de tempo de contato. O processo de reutilização mostra que o biocatalisador imobilizado é uam ferramenta vantajosa para a indústria de bebidas. / β-glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds. They are widely found in nature at plants, fruits and animals. They have various biotechnological applications being largely used in food and beverage industry for the enhance the product viscosity, coloration, flavour and aroma qualities. This study presents a commercial β-glucosidase immobilization in chitosan support in order to obtain an active and stable derivative, enabling its application in winemaking, enhancing the aromatic complexity in young wines. The immobilization process was conducted in chitosana support, cross-linked with glutaraldehyde, reaching 100% efficiency in immobilization with 50 mg of protein per gram of support and 65% recovered activity in imobilized derived. The immobilization of the enzyme contributes to greater control of the process, changed some features of β-glucosidase, which proved to be more stable at pH changes when compared to free enzyme. Also the immobilized β-glucosidase showed great operational stability been reused for more than 30 cycles maintaining its initial activity. The application of β-glucosidase in the wine was held in batch for 90 minutes under stirring. The analyzis by SPME / GC-MS revelead a increasement in terpens concentration when compared to the sample without treatment. Was noticed a increase in geraniol, citronellol, linalool and nerol concentration. Apliccation of β-glucosidase was sucesfull, releasing aromatic compounds in contact for a short period of time. The reuses process showed that the immobilized biocatalyst is a advantageous tool for the beverage industry.

As β-glicosidades são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas. São amplamente encontradas na natureza em plantas, frutas e animais. Possuem diversas aplicações biotecnologicas podendo ser amplamente empregadas na indústria de alimentos e bebidas afim de melhorar a qualidade de aroma, sabor, coloração e viscosidade do produto. Este estudo apresenta o processo de imobilização de uma β-glicosidase comercial em suporte de quitosana e a obtenção de um derivado ativo e estável, para ser aplicado no processamento de vinhos aumentando a complexidade aromática de vinhos joven. A imobilizaçãpo foi realizada em suporte de quitosana, reticulado com glutaraldeído, atingindo 100% de eficiência na imobilização com 50mg de proteína por grama de suporte e 65% de atividade recuperada no derivado imobilizado. A imobilização além de contribuir para um maior controle do processo, alterou algumas características da β-glicosidase, a qual demonstrou manter uma atividade mais alta em faixas mais amplas de pH, quando comparada a enzima livre. A β-glicosidase imobilizada apresentou grande estabilidade podendo ser reutilizada por mais de 30 ciclos, mantendo sua atividade inicial. A aplicação da β-glicosidase no vinho foi realizada em batelada, por um tempo de 90 min, sob agitação. A análise por SPME/GC-MS revelou um aumento na concentração terpenos, quando comparada a amostras não tratadas. Houve um aumento na concentração de geraniol, citronelol, linalol e nerol. A aplicação da β-glicosidase foi bem sucedida, liberando os compostos aromáticos em um curto períuodo de tempo de contato. O processo de reutilização mostra que o biocatalisador imobilizado é uam ferramenta vantajosa para a indústria de bebidas. / β-glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds. They are widely found in nature at plants, fruits and animals. They have various biotechnological applications being largely used in food and beverage industry for the enhance the product viscosity, coloration, flavour and aroma qualities. This study presents a commercial β-glucosidase immobilization in chitosan support in order to obtain an active and stable derivative, enabling its application in winemaking, enhancing the aromatic complexity in young wines. The immobilization process was conducted in chitosana support, cross-linked with glutaraldehyde, reaching 100% efficiency in immobilization with 50 mg of protein per gram of support and 65% recovered activity in imobilized derived. The immobilization of the enzyme contributes to greater control of the process, changed some features of β-glucosidase, which proved to be more stable at pH changes when compared to free enzyme. Also the immobilized β-glucosidase showed great operational stability been reused for more than 30 cycles maintaining its initial activity. The application of β-glucosidase in the wine was held in batch for 90 minutes under stirring. The analyzis by SPME / GC-MS revelead a increasement in terpens concentration when compared to the sample without treatment. Was noticed a increase in geraniol, citronellol, linalool and nerol concentration. Apliccation of β-glucosidase was sucesfull, releasing aromatic compounds in contact for a short period of time. The reuses process showed that the immobilized biocatalyst is a advantageous tool for the beverage industry.

Orientador: Prof. Dr. Wanius José Garcia da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A hidrolise enzimatica da celulose e realizada pela acao sinergica de pelo menos tres tipos de celulases distintas: endoglucanases, exoglucanases e ¿À.glicosidases. As endoglucanases e celobiohidrolases sao frequentemente inibidas pelo aumento da concentracao de celobiose (dimero de glicose) no meio reacional. As ¿À-glicosidases sao enzimas que clivam celobiose em monomeros de glicose. Portanto, as ¿À-glicosidases sao essenciais ao processo de hidrolise da celulose por impedirem o acumulo de celobiose e, assim, evitar a diminuicao da taxa de hidrolise. Processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica sao empregados, antes da reacao de hidrolise enzimatica da celulose, a fim de retirar a fracao de lignina e aumentar a taxa de conversao da celulose em glicose. Porem, estes processos de pre-tratamento da biomassa lignocelulosica nao sao 100% eficientes na remocao da lignina. Estudos previos mostraram que a adicao de lignina a celulose pura pode causar a reducao da liberacao de acucar em valores superiores a 60%. Assim, neste estudo, nos caracterizamos a adsorcao nao produtiva da enzima ¿À-glicosidase da familia GH1 da bacteria Thermotoga petrophila (TpBGL1) em ligninas extraidas de diferentes biomassas (cana-de-acucar e eucalipto). Em pH 7 e 6, nossos resultados indicaram que a repulsao eletrostatica enfraquece a adsorcao nao produtiva de TpBGL1 em ligninas. Contudo, em pH 4 a atracao eletrostatica fortalece a adsorcao nao produtiva. Alem disso, o aumento da temperatura de 25 oC para 70 oC nao resultou em um aumento significativo da adsorcao de TpBGL1 em ligninas, provavelmente porque nao ocorre um aumento significativo de regioes hidrofobicas na estrutura da enzima expostas ao solvente. Todas as informacoes obtidas neste estudo poderao ser uteis para aplicacoes biotecnologicas no campo de conversao de polissacarideos estruturais em bioenergia. / The enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose requires at least three types of enzymes working synergistically: endoglucanases that randomly cleave the â-1,4-glycosidic linkages of cellulose, cellobiohydrolases which cleave off cellobiose units from the reducing or nonreducing end of cellulose chain, and â-glucosidases responsible for hydrolysis of the released cellobiose to glucose. Endoglucanases and cellobiohydrolases are normally inhibited by cellobiose, therefore, â-glucosidases are essential to avoid the decrease the hydrolysis rates of cellulose over time due to cellobiose accumulation. The presence of residual lignin after pretreatments may affect negatively the enzymatic hydrolysis of cellulose to glucose. Cellulases bind to lignin, deactivating the enzymes and reducing the overall enzymatic activities. In this study, we examined the non-productive adsorption of one â-glucosidase from Thermotoga petrophila, belonging to the family GH1, on the lignin preparations from both sugarcane (grasses) and eucalyptus (hardwood). GH1 â-glucosidase adsorption onto lignins was found to be strongly pH-dependent, suggesting that the adsorption is electrostatically modulated. At pH 7 and 6, electrostatic repulsion weakens the non-productive adsorption of GH1 â-glucosidase to lignins. However, at pH 4, attractive electrostatic interactions strengthen the non-productive adsorption of GH1 â-glucosidase to lignins. Finally, the increase of temperature did not result in the increase of GH1 â-glucosidase adsorption, probably because there is no significant increase in hydrophobic regions in the GH1 â-glucosidase structure. These studies can be useful in the field of plant structural polysaccharides conversion into bioenergy.

Submitted by Emily Colferai Bonfá null (miemilymi@hotmail.com) on 2016-03-22T01:17:39Z No. of bitstreams: 1 Mestrado-Emily Finall.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-22T17:56:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bonfa_ec_me_sjrp.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T17:56:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bonfa_ec_me_sjrp.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As celulases podem ser utilizadas na bioconversão da fração de celulose de resíduos agro-industriais em açúcares fermentáveis, visando a obtenção de combustíveis renováveis e produtos químicos. As β-glicosidases são cruciais para a total sacarificação da celulose, mas na maioria dos casos elas são fortemente inibidas pelo seu produto, a glicose. Portanto, o conhecimento das cinéticas de hidrólise e as respostas dessa enzima frente a diferentes substratos e produtos pode definir a eficiência de hidrólise e do processo biotecnológico no qual poderia ser incorporada. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a β -glicosidase de 50 kDa (BG50) produzida pelo fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7 cultivado em estado sólido, em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). O zimograma do extrato bruto evidenciou duas isoformas, de aproximadamente 200 e 50 kDa, as quais foram separadas por cromatografia de filtração em gel. A caracterização da BG50 mostrou atividade ótima a 60 ˚C e pH 5,0 quando usado o 4-nitrofenol-β-D-glicopiranosídeo (pNPG), enquanto com celobiose o valor da temperatura e pH ótimo foram de 50 ˚C e pH 4,5, respectivamente. Testes realizados com adição de íons e reagentes mostraram diferenças nos efeitos sobre a atividade da enzima dependendo do substrato, principalmente com a adição de Ditiotreitol (DTT) utilizando celobiose, e inibição completa com Cu2+ e Fe3+ para pNPG e celobiose. Além disso, a enzima não mostrou efeito inibitório quando testada na presença de nove compostos fenólicos, uma característica significativa. Os estudos cinéticos revelaram um perfil de inibição competitiva pela glicose quando utilizado pNPG com valor de KI=1,5 mM e um Km significativamente menor (0,52 mM) pelo pNPG do que pela celobiose (Km=8,50 mM). Os parâmetros termodinâmicos mostraram que a BG50 é bastante estável, destacando seu tempo de meia vida de 855,6 minutos a 60 °C, porém desnatura facilmente acima dessa temperatura. Os resultados enfatizam a importância de investigar potencialidades de β-glicosidases baseadas na celobiose, uma vez que no processo industrial a enzima atuará sobre o substrato natural, além da compreensão da termoestabilidade da enzima. / Cellulases can be used in bioconversion of cellulose from agro-industrial waste into fermentable sugars in order to obtain renewable fuels and chemicals. The β-glucosidases are crucial to the overall saccharification of cellulose, but in most cases, they are strongly inhibited by its product, glucose. Therefore, knowledge of the hydrolysis kinetics of the enzyme and its responses against different substrates and products can set the hydrolysis efficiency and possible incorporation in biotechnological process. This study aimed to characterize the 50 kDa β-glucosidase (BG50) produced by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 grown in solid state, in a mixture of sugarcane bagasse and wheat bran (1:1). The zymogram of the crude extract showed two isoforms of 200 and 50 kDa, which were separated by gel filtration chromatography. The characterization of BG50 showed optimal activity at 60 °C and pH 5.0 when used pNPG, whereas using cellobiose the values of the optimal temperature and pH were 50 °C and pH 4.5, respectively. Tests with addition of reactants and ions showed differences in the effects on enzyme activity depending on the substrate, especially with the addition of dithiothreitol (DTT) utilizing cellobiose, and complete inhibition with Cu2+ and Fe3+ for 4-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside (pNPG) and cellobiose. Furthermore, the enzyme showed no inhibitory effect when tested in the presence of nine phenolic compounds, a remarkable characteristic. Kinetic studies showed a profile of competitive inhibition by glucose when using pNPG with Ki = 1.5 mM and Km significantly lower (0.52 mM) with pNPG than using cellobiose (Km = 8.50 mM). The thermodynamic parameters show that BG50 is quite stable, highlighting its half life of 855.6 minutes at 60 ° C, but above this temperature easily denatured. The results emphasize the importance of investigating β-glucosidases’ potential based on cellobiose, since for the industrial processes the enzyme will function with its natural substrate, in addition to understanding the thermal stability of the enzyme.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-21Bitstream added on 2015-04-09T12:47:18Z : No. of bitstreams: 1 000811719.pdf: 610346 bytes, checksum: 43ef4062346b4ecd81a0a778e882bcf9 (MD5) / O capitulo 1 deste trabalho descreve o Pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar e avalia a sua sacarificação enzimática a partir de diferentes extratos enzimáticos dos fungos Penicillium viridicatum RFC3, Trichodermareesei QM9414, Thermoascus aurantiacus CBMAI756 e Thermomyces lanuginosus, obtidos a partir da fermentação estado sólido. Dentre essas fermentações, o melhor resultado individual de eficiência de hidrólise foi obtido com o extrato enzimático do fungo T.aurantiacus, o qual foi então utilizado na sacarificação dos bagaços pré-tratados com espécies reativas de oxigênio. A melhor taxa de sacarificação foi obtida no bagaço pré-tratado com NaClO, que resultou em 19,8% de rendimento, contra 12,2% no bagaço in natura. O capitulo 2 do trabalho descreve a importância do sinergismo e da inibição enzimática, na forma da β-glicosidase, na sacarificação do bagaço. Foi verificado sinergismo entre os extratos enzimáticos dos fungos P.viridicatum e T.reesei e a melhor combinação dos dois extratos foi na proporção 1:1, resultando na liberação de 0,73 mg/mL de glicose. As atividades de β-glicosidases presentes nos extratos enzimáticos foram avaliadas quanto aos efeitos de inibição por glicose. Os parâmetros cinéticos Km e Vmax foram obtidos com a enzima do T. aurantiacus sem inibidor apresentou Vmáx 4,60 μmol/min e Km 0,31 mM e com glicose Vmáx 2,3 μmol/min e Km 0,37 mM. Sem glicose a enzima do P. viridicatum apresentou Vmáx 166,7 μmol/min e Km 0,2mM e com glicose Vmáx 13,8 μmol/min e Km 1,2 mM. A β- glicosidase do T.aurantiacus sofreu inibição não-competitiva, enquanto a enzima do P.viridicatum sofreu inibição mista. Também foram avaliados os efeitos da frutose e da glicose isomerase como supressora do efeito inibidor da glicose. A presença da frutose proporcionou um efeito positivo nas atividades de β-glicosidases desses fungos. A sacarificação do bagaço de cana com a combinação ... / The first chapter of this work describes the pretreatment of sugarcane bagasse cane and evaluates its enzymatic saccharification from different enzymatic extracts of Penicillium viridicatum RFC3, Trichoderma reesei QM9414 , Thermoascus aurantiacus and Thermomyces lanuginosus CBMAI756 obtained from the solid state fermentation. Among these fermentations, the best individual result of hydrolysis efficiency was obtained with the enzymatic extract of the fungus T.aurantiacus, which was then used in the saccharification of bagasse pretreated with reactive oxygen species . The best rate of saccharification was achieved on bagasse pretreated with NaClO resultins in 19.8 % of yield, versus 12.2% in the bagasse in natura. The chapter 2 of this work describes the importance of synergism and inhibition of the enzyme in the form of β - glucosidase in the saccharification of bagasse. Synergism between the enzymatic extracts of fungi P.viridicatum and T.reesei the best combination of the two extracts was observed for the ratio 1:1, resulting in the release of 0.73 mg / mL glucose . The activities of β - glucosidase enzyme present in the extracts were analyzed for the effects of inhibition by glucose. The kinetic parameters Km and Vmax of the β-glucosidase enzyme presented, in case of T. aurantiacus Vmax of 4.60 μmol/min and Km 0.31 mM and with glucose Vmax 2.3 μmol/min and Km 0.37 mM. For the enzyme from P.viridicatum values were Vmax 166.7 μmol/min and Km 0.2 mM and with glucose Vmax 13.8 μmol/min and Km 1.2 mM. The β-glucosidase T.aurantiacus suffered from non-competitive inhibition, while P.viridicatum suffered mixed enzyme inhibition. We also evaluated the effects of fructose and glucose isomerase as suppressing the inhibitory effect of glucose. The presence of fructose resulted in a positive effect on the β - glucosidase activity of these fungi. The saccharification of sugarcane bagasse with the combination of glucose isomerase enzyme ...

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NataliaFO_DISSERT_Partes autorizadas.pdf: 162419 bytes, checksum: df1688a55f3602778175a9d04e3bc026 (MD5) Previous issue date: 2011-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Algaroba (Prosopis juliflora) is a typical legume from arid and semi arid regions, which is composed by sugar-rich pods and high protein seeds. Phenolic compounds are secondary metabolites recognized as potent bioactive compounds, found in several vegetables.Therefore, the objective of this work is to characterize the algaroba flour in terms of its physicalchemical composition, total phenolic content, antioxidant activity by DPPH and ABTS methods, a-amylase and a-glycosidase inhibition, as well as to analyze its organic compounds by high performance liquid chromatography (HPLC). Three experimental groups were investigated (seeds, seeds and pod together and only pod), which were prepared by oven drying and posterior grinding. Water and ethanol extracts (70, 80, 100% v/v) were prepared and used for functional studies. Organic compounds were detected by using HPLC equipment coupled to mass spectrometer. Results show important physical-chemical differences among the experimental groups, seeds, seeds and pod together and only pod. The algarroba seed flour is high in protein (49.49%) and fat (3.10%), while the pod flour is especially rich in sugar (60.3% to 67.9%). Algaroba phenolics are concentrated in pod flour, mainly in water extracts (1.30 mg GAEQ/100g sample). All seed extracts showed high DPPH activity and maximum antioxidant activity was registered for ethanol 80% extracts (19.81 ?M Trolox/g sample). The ABTS activity ranged from 9.73 to 12.74 ?M Trolox/g sample. Nearly all the extracts were able to inhibit ?-amylase activity mildly (30.50% to 48.80%), while the maximum ?-glycosidase inhibition was observed for pod water extracts (81.03%). Algaroba water extracts proven to be especially rich in organic compounds, observed by the high number of chromatographic peaks. Results demonstrate that algaroba is a potential candidate for further investigations concerning its possible functional applications / A algaroba (Prosopis juliflora) ? uma leguminosa t?pica de regi?es ?ridas e semi-?ridas constitu?da por vagem rica em a??cares e sementes de elevado teor prot?ico. Os compostos fen?licos s?o metab?litos secund?rios reconhecidos como importantes compostos bioativos, presentes em grande n?mero de vegetais. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a farinha de algaroba quanto ? composi??o f?sico-qu?mica, concentra??o fen?lica total, atividade antioxidante pelos m?todos DPPH e ABTS, capacidade de inibi??o das enzimas ?-amilase e ?-glicosidase, bem como analisar a presen?a de compostos org?nicos por cromatografia l?quida. Foram analisados tr?s grupos experimentais (semente, vagem inteira e vagem sem semente), os quais foram secos em estufa e mo?dos, obtendo-se a farinha de cada um dos grupos. A partir disso, foram elaborados extratos aquosos e etan?licos (70, 80, 100% v/v) para a an?lise da funcionalidade. Para a determina??o de compostos org?nicos foi utilizado cromatografia l?quida de alta efici?ncia acoplada a espectr?metro de massas. Os resultados da presente pesquisa permitem inferir que existem diferen?as importantes entre a composi??o f?sico-quimica das farinhas da semente, vagem inteira e vagem sem semente de algaroba. A farinha da semente se destacou por sua elevada concentra??o de prote?nas (49,49%) e gordura (3,10%), ao passo que a farinha das vagens mostrou-se especialmente rica em a??cares (60,3 a 67,9%). Os compostos fen?licos da algaroba est?o em maior concentra??o na vagem sem semente, sobretudo para os extratos aquosos (1,30 mg GAEQ/100g amostra). Todos os extratos da semente de algaroba apresentaram elevada capacidade antoxidante pelo m?todo DPPH, com m?ximo registrado para extratos etan?licos 80% (19,81?M Trolox/g amostra). A atividade antioxidante medida pelo m?todo ABTS dos extratos estudados estiveram entre 9,73 e 12,74 ?M Trolox/g amostra. Praticamente todos os extratos obtidos foram capazes de inibir moderadamente a atividade da enzima ?-amilase (30,50% a 48,80%), sendo que a m?xima inibi??o da ?-glicosidase foi observada para os extratos aquosos da vagem sem semente (81,03%). A algaroba apresentou variedade de compostos org?nicos detectados por cromatografia l?quida, sobretudo os extratos aquosos que demonstraram grande n?mero de picos. Sugere-se a algaroba como poss?vel candidata para futuras investiga??es visando sua utiliza??o como alimento funcional

As β-glicosidades são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas. São amplamente encontradas na natureza em plantas, frutas e animais. Possuem diversas aplicações biotecnologicas podendo ser amplamente empregadas na indústria de alimentos e bebidas afim de melhorar a qualidade de aroma, sabor, coloração e viscosidade do produto. Este estudo apresenta o processo de imobilização de uma β-glicosidase comercial em suporte de quitosana e a obtenção de um derivado ativo e estável, para ser aplicado no processamento de vinhos aumentando a complexidade aromática de vinhos joven. A imobilizaçãpo foi realizada em suporte de quitosana, reticulado com glutaraldeído, atingindo 100% de eficiência na imobilização com 50mg de proteína por grama de suporte e 65% de atividade recuperada no derivado imobilizado. A imobilização além de contribuir para um maior controle do processo, alterou algumas características da β-glicosidase, a qual demonstrou manter uma atividade mais alta em faixas mais amplas de pH, quando comparada a enzima livre. A β-glicosidase imobilizada apresentou grande estabilidade podendo ser reutilizada por mais de 30 ciclos, mantendo sua atividade inicial. A aplicação da β-glicosidase no vinho foi realizada em batelada, por um tempo de 90 min, sob agitação. A análise por SPME/GC-MS revelou um aumento na concentração terpenos, quando comparada a amostras não tratadas. Houve um aumento na concentração de geraniol, citronelol, linalol e nerol. A aplicação da β-glicosidase foi bem sucedida, liberando os compostos aromáticos em um curto períuodo de tempo de contato. O processo de reutilização mostra que o biocatalisador imobilizado é uam ferramenta vantajosa para a indústria de bebidas. / β-glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds. They are widely found in nature at plants, fruits and animals. They have various biotechnological applications being largely used in food and beverage industry for the enhance the product viscosity, coloration, flavour and aroma qualities. This study presents a commercial β-glucosidase immobilization in chitosan support in order to obtain an active and stable derivative, enabling its application in winemaking, enhancing the aromatic complexity in young wines. The immobilization process was conducted in chitosana support, cross-linked with glutaraldehyde, reaching 100% efficiency in immobilization with 50 mg of protein per gram of support and 65% recovered activity in imobilized derived. The immobilization of the enzyme contributes to greater control of the process, changed some features of β-glucosidase, which proved to be more stable at pH changes when compared to free enzyme. Also the immobilized β-glucosidase showed great operational stability been reused for more than 30 cycles maintaining its initial activity. The application of β-glucosidase in the wine was held in batch for 90 minutes under stirring. The analyzis by SPME / GC-MS revelead a increasement in terpens concentration when compared to the sample without treatment. Was noticed a increase in geraniol, citronellol, linalool and nerol concentration. Apliccation of β-glucosidase was sucesfull, releasing aromatic compounds in contact for a short period of time. The reuses process showed that the immobilized biocatalyst is a advantageous tool for the beverage industry.