O uso da elevação da temperatura local como recurso adjuvante no combate ao câncer tem sido explorado intensamente nas últimas décadas. A hipertermia, como é chamada essa elevação de temperatura local, apresenta seu maior potencial clínico quando combinada com a quimioterapia e/ou radioterapia, sendo capaz de promover benefícios terap êuticos significativos. Apesar dos resultados positivos, a hipertermia, até o momento, não se estabeleceu como terapia padrão, devido a limitações no controle da deposição de energia e no monitoramento da distribuição de temperatura em tempo real. Neste trabalho, discutem-se características fundamentais da eficiência da hipertermia no tratamento de tumores cerebrais e de bexiga. O projeto foi todo ele desenvolvido em colaboração com o grupo de hipertermia do Department of Radiation Oncology da Duke University. Com relação à hipertermia aplicada ao cérebro, primeiramente apresenta-se o procedimento de desenvolvimento e teste de eficiência de um mini-aplicador de micro-onda dedicado ao aquecimento do cérebro de camundongos. Após estes, avaliou-se a capacidade de disponibilização termo-estimulada da doxorrubicina a modelos tumorais de glioblastoma. O método utilizado para monitoramento da liberação e distribuição da doxorrubicina foi a microscopia confocal de fluorescência intravital. O estudo do impacto da hipertermia sob a distribuição da formulação de doxorrubicina encapsulada em lipossomos termosensíveis demonstrou que a elevação moderada de temperatura promove alterações significativas na permeabilidade da barreira hematoencefálica, além de promover aumento do acúmulo total de droga e aumento no grau de penetração. Para a hipertermia aplicada à bexiga, apresenta-se um estudo de viabilidade de aquecimento para uma metodologia alternativa ao dispositivo de uso clínico padrão (_Synergo_), denominada magneto-hipertermia. Os ensaios com a magneto-hipertermia apontam que o uso de nanopartículas magnéticas sob influência de um campo magnético alternado (40 kHz) é capaz de elevar a temperatura do lúmen da bexiga a 42_C de forma localizada, não promovendo efeitos significativos de aquecimento a tecidos do entorno. / The use of local heating to achieve adjuvant response in cancer treatment has been widely explored in the last decades. The thermal therapy has a well-known clinical bene_t when combined to chemotherapy and/or radiotherapy. Despite all positive results, the use of thermal therapy has not yet been established as standard treatment, mainly due to the limitation on the control of energy deposition and real-time temperature mapping. This thesis discuss some of the fundamentals of the application of hyperthermia to treat bladder and brain tumors. All experiments were performed in collaboration with the Department of Radiation Oncology of Duke University. As regards brain experiments, we developed and built a microwave antenna dedicated to locally heating the mouse brain. After that, we assessed the ability of thermo release and thermo delivery of doxorubicin to glioblastoma tumor models. Intravital confocal fluorescence microscopy was used to monitor the drug release and distribution into brain tissue as a whole. Our findings indicated that a mild elevation in brain temperature (42_C) modulates the permeability of the blood-brain barrier and promotes an increase on both total drug accumulation and drug penetration. Concerning bladder hyperthermia, we investigated the feasibility of magnetic-hyperthermia as an alternative heating source to the standard clinical device (_Synergo_). The magnetic-hyperthermia results indicate that the amount of heat dissipation by the magnetic nanoparticles, under the influence of alternating magnetic field (40KHz), was able to raise the temperature in the bladder lumen to 42_C and did not promote any significant heating effects on surrounding tissues.

A terapia fotodinâmica (TFD) tem se apresentado nos últimos anos como uma alternativa para o tratamento de tumores cutâneos, viscerais e sistêmicos, demonstrando resultados promissores, tanto em estudos in vitro como in vivo. Trata-se de uma técnica simples e não invasiva. A terapia consiste na excitação de um fármaco fotossensibilizante por uma fonte de luz visível que depois de absorvida pela molécula, leva a produção espécies reativas de oxigênio (EROs) em presença do oxigênio molecular por uma sequencia de reações fotoquímicas. Nesse trabalho propõe-se a preparação, caracterização e detreminação da atividade fotodinâmica de uma nanoemulsão rica em colesterol e de lipossomas ultradeformáveis como novos sistemas de liberação para o fármaco fotossensibilizante cloro alumínio ftalocianina (PcAlCl), comparando com um sistema clássico de lipossoma convencional. Como modelo celular foram utilizadas células de glioblastoma (U87MG) e de melanoma (B16F10). As formulações apresentaram características desejáveis como reprodutibilidade, tamanho de partícula, estabilidade curto e em longo prazo e deformidade adequados para a utilização como meio de veiculação da PcAlCl. Pela análise dos estudos fotofísicos de rendimento quântico de fluorescência (?F), tempo de vida de fluorescência (?) e rendimento quântico de oxigênio singleto (??) da PcAlCl em etanol e incorporada nas formulações, pode-se observar que a incorporação a um veículo de liberação melhorou as características da PcAlCl. Nos estudos em células nenhum dos sistemas apresentou citotoxicidade na ausência de luz, mas apresentaram um aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl de até 80% quando comparadas à PcAlCl livre quando irradiadas. Todas as formulações apresentaram características que corrobora com o emprego como sistemas de liberação para o aumento da atividade fotodinâmica da PcAlCl podendo serem empregados no tratamento de glioblastoma e de melanoma / The Photodynamic therapy (PDT) has been an alternative for the treatment of skin, and brain tumors, and has shown promising results, both in vitro and in vivo, is a simple and non-evasive technique. The therapy consists into a light-sensitive drug excitation by a light visible source that once absorbed by the molecule lead to produce reactive oxygen species (ROS) in the molecular oxygen presence by a sequence of photochemical reactions. This work proposes the preparation and characterization of a cholesterol-rich nanoemulsion and ultradeformable liposomes as new delivery systems for the drug photosensitizer chloro aluminum phthalocyanine (PcAlCl) compared to a classical system as the conventional liposome and their photodynamic activity in glioblastoma cells line (U87MG) and melanoma cells line (B16F10). The formulations showed suitable characteristics such as reproducibility, particle size, short and long-term stability and deformity for their use as drug delivery for PcAlCl. For the photophysical studies: absorption, fluorescence, fluorescence quantum yield (?F), fluorescence lifetime (?) and quantum yield of singlet oxygen (??) of PcAlCl in ethanol and incorporated in the formulations demonstrated that the incorporation was able to improve its photophysical characteristics. In in vitro studies, the drug delivery systems showed no cytotoxicity in the absence of light, but demonstrated increased in PcAlCl photodynamic activity up to 80% over the PcAlCl free when irradiated. All formulations showed characteristics, which cooperates with the use of these drug delivery systems for, increased the PcAlCl photodynamic activity for glioblastoma and melanoma treatment

Moléculas orgânicas fluorescentes são uma importante ferramenta para biologia celular. Compostos ideais para esta aplicação devem ter alto brilho (produto do coeficiente de atenuação molar e do rendimento quântico de fluorescência), ser fotoestáveis e internalizáveis, não comprometer a viabilidade celular e interagir com biomoléculas com algum grau de especificidade. Nesta Tese de Doutorado é apresentado o estudo do uso de cBeet120, uma betalaína cumarínica artificial, e células de glioma humano da linhagem U87-MG. Betalaínas são pigmentos de plantas que apresentam alta biocompatibilidade que servem como material de partida para o desenvolvimento de derivados funcionais. A sonda se acumula principalmente no núcleo das células U87- MG e marca principalmente nucléolos via interação com proteínas. A presença de DNAse ou RNAase elimina a marcação nuclear, sem afetar a fraca marcação citoplasmática de fundo. Estudos de inibição de transporte sugerem que cBeet120 é internalizada por transportadores de L-glutamato da família de transportadores de amino ácidos excitatórios (EAAT). O uso de artemisinina para inibição Ca2+-ATPases aumenta a velocidade de internalização de cBeet120 em células U87-MG. Quando irradiada com luz de cor ciano, cBeet120 no interior do núcleo de células vivas é fotoativada, resultando em um aumento da intensidade de fluorescência com o tempo (monitorado por 90 min) e o deslocamento hipsocrômico do máximo de emissão. Em células fixadas com paraformaldeído, o padrão de marcação da célula se torna mais difuso e a sonda emite fluorescência sem fotoativação. Medidas de tempo de vida de fluorescência em solução e imageamento por microscopia de tempo de vida de fluorescência permitem inferir a ocorrência da formação de um complexo proteína-cBeet120 ou um produto de transiminação que pode estar sujeito a isomerização cis/trans. / Fluorescent organic molecules are an important tool for cell biology. Ideal compounds for this application must have high brightness (product of the molar attenuation coefficient and fluorescence quantum yield), be photostable and internalizable by cells, do not compromise cellular viability and interact with biomolecules with some degree of specificity. In this Doctorate Thesis, we describe the interaction of cBeet120, an artificial coumarinic betalain, and human glioma cells of line U87-MG. Betalains are plant pigments that exhibit high biocompatibility that serve as starting material for the development of functional derivatives. The probe accumulates mainly in the nucleus of the U87-MG cells and mainly marks nucleoli via interaction with proteins. The presence of DNAse or RNAase eliminates nuclear labeling, without affecting the poor background cytoplasmic labeling. Transport inhibition studies suggest that cBeet120 is internalized by L-glutamate transporters from the excitatory amino acid transporter (EAAT) family. The use of artemisinin for inhibition Ca2+-ATPases increases the rate of cBeet120 internalization in U87-MG cells. When irradiated with cyan colored light, cBeet120 within the nucleus of living cells is photoactivated, resulting in an increase in fluorescence intensity over time (monitored for 90 min) and the hypochromic shift of the emission maximum. In cells fixed with paraformaldehyde, the labeling pattern of the cell becomes more diffuse and the probe emits fluorescence without photoactivation. Fluorescence life-time measurements in solution and fluorescence life-time imaging microscopy allows to infer the occurrence of the formation of a protein-cBeet120 complex or the formation of a transimination product that may be subject to cis/trans isomerization.

Os gliomas compreendem mais de 70% de todos os tumores cerebrais primários. Mesmo com tratamento agressivo, a média de sobrevivência relatada para estes tumores é geralmente menor do que 1 ano após o diagnóstico. A quimioterapia baseada em agentes alquilantes, como a temozolomida (TMZ), tem mostrado, em média, uma modesta resposta e pequeno aumento da sobrevida. As principais lesões causadas pela TMZ são os aductos N7-metil-G e N3-metil-A, que são processados pelo reparo por excisão de base (BER), compreendendo mais de 80% das lesões induzidas no DNA pela TMZ. Há evidência de que a resistência a este quimioterápico pode ser causada em parte por um eficiente processo de reparo via BER, mas poucos estudos têm focalizado essa abordagem. Metoxiamina (MX) é um inibidor do reparo via BER que tem sido atualmente investigado como um possível aliado no combate a vários tipos de tumores, aumentando os efeitos citotóxicos de drogas, tais como a TMZ. No presente trabalho, foram avaliadas as respostas celulares de células de glioblastoma (GBM) ao tratamento com a TMZ, associada ou não à MX. Foram analisados parâmetros como citotoxicidade (24 h, Kit XTT), sobrevivência celular (120 h, Kit XTT) e clonogênica (10 dias após o tratamento), danos no DNA pelo Ensaio Cometa (2, 6, 12 e 24 h), a indução de apoptose (24, 48 e 72 h) e alterações na expressão gênica e transcricional (24, 48 e 72h) de genes envolvidos na via de reparo por BER. Sob tratamento das linhagens de GBM (U87, U343, U251, U138 e T98G) a diferentes concentrações de TMZ (100 a 1000 M), o efeito citotóxico foi observado em células analisadas após 120 h, sendo que a linhagem T98G foi a mais resistente ao tratamento com TMZ e foi a única a apresentar diferenças significativas entre o tratamento sozinho e combinado (p 0,05). Assim, foi selecionada a linhagem T98G para os demais experimentos e estudar as possíveis vias implicadas na resistência a essa droga. A sobrevivência clonogênica das células T98G foi reduzida, sob tratamento com a TMZ (100 a 800 M), com diferença significativas para as concentrações superiores a 400 M. Observou-se que o efeito da TMZ foi acentuado quando associada ao inibidor, com diferenças significativas para todas as concentrações testadas. A droga induziu uma maior porcentagem de danos no DNA (Ensaio Cometa) para ambos os tratamentos (400 e 600 M) e nos tempos de 2 e 6 h, com diferenças significativas entre os tratamentos (TMZ e TMZ+MX), somente na concentração de 600 M/2 h. Entretanto esses danos se equipararam nos tempos seguintes. A indução de apoptose analisada nas células T98G mostrou a freqüência máxima de 24,2% no tempo de 72h, na concentração de 600 M de TMZ, enquanto que uma maior indução de apoptose (47,7%) foi observada para a mesma concentração no tratamento combinado (TMZ + MX), resultando em diferenças significativas. A análise de expressão gênica realizada para os genes APE1, FEN1 e XRCC1, mostraram que houve uma menor indução dos genes APE1 e FEN1 no tratamento combinado. A expressão da proteína APE1 (analisada por Western blot) foi menos intensa em todos os tempos de tratamento combinado (TMZ + MX), possivelmente pelo bloqueio dos sítios AP causado pelo inibidor MX. A proteína FEN1 mostrou-se menos expressa na comparação dos tratamentos, nos tempos de 48 e 72 h, indicando uma inibição de proteínas da via BER downstream à remoção de sítios AP por APE1, possivelmente pela ligação de MX. PCNA teve sua expressão protéica aumentada no tratamento combinado, nos tempos de 24 h, e principalmente em 48 h, sugerindo uma indução devida a um aumento de danos no DNA. Portanto, os resultados dos ensaios realizados com a associação da TMZ à MX demonstraram a influência do tratamento combinado sobre a expressão de proteínas envolvidas no reparo via BER, o que contribuiu para uma redução da capacidade proliferativa das células T98G em decorrência da maior indução de danos por aductos DNA-MX não reparados, resultando também em aumento de morte celular apoptótica. Esses dados mostram que a modulação do reparo via BER pode constituir uma estratégia promissora para aumentar a eficácia do tratamento com a TMZ, o que poderá futuramente embasar a escolha de procedimentos terapêuticos que resultem numa maior eficácia do tratamento de gliomas com agentes alquilantes. / Gliomas represent more than 70% of primary brain tumors. Even following an aggressive therapies, the mean survival rate of patients with these tumors is less than one year after diagnosis. Chemotherapy based on alkyklating agents, such as temozolomide (TMZ) has been reported to increase the survival rate. N7-metyl-G and N3-metyl-A adducts comprise more than 80% of the DNA lesions induced by TMZ and are processed by the base excision repair process (BER). There is evidence in the literature suggesting that the resistance to TMZ could be caused, in part, by an efficient repair by BER pathway, although few studies have focused on this subject. Metoxiamine (MX) is an effective BER inhibitor, which has been investigated as a conceivable treatment for different kinds of tumor, due to its synergistic effect with antitumoral drugs, such as TMZ. In the present study, the cellular responses to TMZ treatment associated or not with MX were evaluated in giloblastoma (GBM) cell lines. Several parameters were analyzed, such as cytotoxicity (24 h), cellular survival (120 h) and clonogenic efficiency (10 days after treatment), DNA damage and repair kinetics (after 2, 6, 12 and 24 h of recovery time), apoptosis induction (24, 48 and 72 h) and alterations in gene expression (24, 48 e 72h) for genes playing role in BER pathway. The treatment with TMZ 100 -1000 M (during 24 h) was cytotoxic for all GBM cell lines tested (U87, U343, U251, U138 and T98G), as analyzed after 120 h, with the T98G cell line being be the most resistant to TMZ; besides, T98G was the only one to present significant differences (p 0,05) in survival rates measured between TMZ treatment and TMZ combined with MX. Thus, T98G cells were selected for the subsequent experiments and for the study of the pathways implicated in TMZ resistance. The clonogenic efficiency of T98G cells was reduced under TMZ treatment (100 - 800 M) with significant differences for treatments above 400 M. In addition, the combined treatment TMZ plus MX significantly increased the cytotoxic effects, even for the lowest concentration. The comet assay showed higher percentage of DNA damage for both treatment modalities (TMZ and TMZ+MX) at 2 and 6 h of recovery, with significant differences between treatments for 2 h. Following 12 and 24 h of recovery, the amount of DNA damage reached the control levels, indicating the repair of DNA breaks. Apoptosis induction in T98G cells showed the highest frequency (24.2%) at 72h for 600 M TMZ, while the highest apoptosis induction (47.7%) was observed for the same concentration combined to MX. Quantitative gene expression analysis performed for three genes, APE1, FEN1 and XRCC1, showed a reduced expression of APE1 and FEN1 for the combined treatment. Western blot analysis demonstrated that APE1 was less expressed for all kind of treatments, probably due to AP-sites blockade caused by the inhibitor MX. In addition, FEN1 showed low levels of expression at 48h and 72h, indicating the inhibition of BER pathway downstream to the AP removal by APE1. On the other hand, PCNA expression was higher for the combined treatment (24h and mainly 48h), suggesting its induction probably due to increased DNA damage. Therefore, the present results demonstrated that the association of TMZ with MX interfered with the expression of proteins involved in BER, thus, reducing the clonogenic efficiency of T98G cells, probably as a consequence of the high production of unrepaired DNA-MX adducts, leading to cell death, including apoptosis. These data show that the modulation of BER is a promising strategy for magnifying the therapeutic impact of TMZ, and in the next future, this strategy may embrace the option to establish novel and efficient therapy protocols for the treatment of gliomas with alkylating agents.

Os tumores astrocíticos são originados a partir dos astrócitos e classificados de acordo com a Organização Mundial de Saúde em astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma subependimal de células gigantes (grau I), xantoastrocitoma pleomórfico (grau II), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (GBM) (grau IV). Este último é o tumor cerebral mais frequente em adultos, possuindo uns dos piores prognósticos, devido principalmente à radioresistência do tumor, com uma sobrevida média de 14 meses. Vários estudos têm procurado encontrar novos alvos terapêuticos e os genes da família BUB são candidatos promissores, devido ao seu papel no controle do ciclo celular. Estes genes participam do mecanismo do ponto de checagem do fuso mitótico, prevenindo a separação prematura das cromátides irmãs. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de BUB1, BUB3 e BUBR1 em amostras de pacientes portadores de gliomas de baixo grau (I e II) e glioblastoma, relacionar as expressões destes genes à sobrevida e estudar os efeitos da inibição dos genes BUB1 e BUBR1, por RNAi, na linhagem pediátrica SF188. Nossos resultados mostraram que tanto BUB1 quanto BUBR1 foram hiperexpressos nos glioblastomas e nos gliomas de baixo grau em relação à substância branca (p<0,05). A análise da expressão destes genes em amostras de glioblastomas em relação a amostras de grau I e II demonstrou uma hiperexpressão dos genes BUB1 e BUBR1 e uma hipoexpressão do BUB3 em glioblastoma (p<0,05). Em relação à sobrevida, os baixos níveis de expressão dos genes BUB1 e BUBR1 foram relacionados a uma melhor sobrevida quando analisado o total de todos os pacientes. Paralelamente, a inibição dos genes BUB1 e BUBR1 na linhagem SF188 resultou em uma diminuição da proliferação e também da capacidade clonogênica, além de um aumento na apoptose quando combinado com temozolomida (TMZ). Também foram realizados experimentos com inibições dos genes com ou sem a presença de irradiação. Esta combinação resultou em uma diminuição tanto da proliferação quanto da capacidade clonogênica. Estes resultados sugerem que o BUB1 e o BUBR1 podem ser considerados alvos interessantes para o tratamento de glioblastoma, porém estudos adicionais são necessários para confirmar tal potencial. / Astrocytic tumors are originated from astrocitytes and classified according to the World Health Organization into pilocytic astrocytoma (grade I), subependymal giant cell astrocytoma (grade I), pleomorphic xanthoastrocytoma (grade II), diffuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and Glioblastoma (GBM) (grade IV). Glioblastoma is the most common brain tumor in adults with a very poor prognosis and a median survival of 14 months. Because their role in cell cycle control, several authors have previously ponited the BUB gene family as new therapeutic target candidates. These genes participate in the mitotic checkpoint by preventing the premature separation of sister chromatids. The aims of this study were to study the expression of BUB1, BUB3 e BUBR1 in samples of patients with low-grade gliomas (I and II) and glioblastoma, evaluate any association of gene expression with patient survival and analyze BUB1 e BUBR1 inhibition (by iRNA) effects, on SF188, a pediatric cell line. BUB1 and BUBR1 were found hyperexpressed in glioblastoma samples and in low-grade gliomas when compared with white matter samples (p<0.05). The analysis of the expression of these genes in glioblastoma samples compared with grade I and II samples showed a hyperexpression of BUB1 and BUBR1, while BUB3 was hipoexpressed in glioblastoma (p<0.05). In the survival analysis, the hipoexpression of BUB1 and BUBR1 genes were related with a better survival when all patients were considered. The BUB1 and BUBR1 inhibition resulted in decreased proliferation and colony formation, along with increased apoptosis when combined with temozolomide. Experiments with the inhibition of genes also were performed in association with irradiation. This combination demonstrated decreased proliferation and colony formation. Our results suggest that BUB1 and BUBR1 might be interesting targets for future treatment of glioblastoma, nonetheless further studies are necessary to confirm this potencial.

Os gliomas são tumores que surgem a partir de células da glia e são considerados os mais comuns do sistema nervoso central. São subdivididos em quatro grupos: astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (grau IV ou GBM). Entre esses, o GBM é o tumor mais agressivo e mais freqüente. Apesar de ser encontrado em qualquer faixa etária, esse tumor é raro em crianças. Atualmente a cirurgia seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida (TMZ) tem sido utilizado como protocolo de tratamento padrão para a maioria dos pacientes e mesmo assim a sobrevida se mantem extremamente baixa. Além disso, grande parte dos pacientes não respondem ao tratamento com TMZ indicando a necessidade de agentes quimioterápicos alternativos. A zebularina (ZB) é um agente inibidor de DNA metiltransferases (iDNMTs) estável, pouco tóxico, que promove radiosensibilização e tem mostrado efeitos promissores em diversos tipos de neoplasias, entretanto pouco se sabe a respeito dos efeitos da ZB em glioblastoma. Os objetivos deste trabalho foram analisar a expressão dos genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT em 5 amostras de substâncias brancas (SB), 6 linhagens de GBM e 33 amostras de gliomas (13 grau I, 2 grau II e 18 grau IV), correlacionar a expressão desses genes com os diferentes graus de gliomas e analisar os efeitos da ZB combinada ou não com TMZ em linhagens de GBM irradiadas e não irradiadas. Para análise da expressão gênica foi realizada a técnica de PCR em tempo Real. Os ensaios de proliferação celular, clonogênico, radiação e apoptose foram realizados em 3 linhagens de GBM (U251, SF188 e T98G) e uma de fibroblastos (MRC5). Também foi realizado o ensaio de proliferação celular em 5 culturas primárias de GBM tratadas com zebularina. Os genes DNMT3A e MGMT mostraram expressão maior nas amostras de SB comparando-se com gliomas e linhagens de GBM. O gene DNMT3B foi mais expresso nas linhagens de GBM comparando-se com as SB. O gene DNMT1 não mostrou diferenças significativas entre as amostras analisadas. Os ensaios de proliferação celular mostraram diminuição na proliferação com doses a partir de 50-100µM de ZB e de 250-500µM de TMZ nas linhagens e a partir de 50µM de ZB para as culturas primárias de GBM. As combinações de ZB com TMZ não mostraram sinergia na grande maioria das doses testadas. A ZB aumenta a apoptose nas 3 linhagens com doses a partir de 100µM. A ZB e TMZ mostraram diminuição na formação de colônias com as doses de 100µM e 10µM nas linhagens U251 e SF188 não irradiadas e irradiadas com 2, 4 e 6 Gy. A linhagem T98G expressa o gene MGMT, mostrou resistência a 10µM de TMZ e respondeu ao tratamento com 100µM de ZB. Também foi observado que 10µM de TMZ é mais citotóxico do que 100µM de ZB em fibroblastos não irradiados e irradiados (2Gy). Os resultados obtidos neste estudo mostram que a ZB pode representar um alvo terapêutico interessante para o estudo em glioblastoma. / Gliomas arise from glial cells and are the most common central nervous system tumors. They are divided in four groups: pilocytic astrocytoma (grade I), difuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and glioblastoma (grade IV or GBM). GBM is the most frequent and aggressive glioma. This type of tumor can occur in any age but its rare in children. Actually, surgery, radiotherapy and temozolomide (TMZ) adjuvant/concomitant chemotherapy has been the standard treatment protocol but the survival is extremely poor. In addition most patients do not respond to TMZ indicating the need for alternative chemotherapeutic agents. Zebularine (ZB) is a DNA metiltransferase inhibitor (DNMTi) stable, slight toxic that has been showed promise effects in cancer including radiosensitivity but little is known about ZB in glioblastoma. The objectives of this study were analyze DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, MGMT gene expression profile in 5 samples of normal brain, 6 GBM cell lines and 33 glioma samples (13 grade I, 2 grade II e 18 grade IV), correlate with different gliomas grades and analyze the effects of ZB isolate and in combination with TMZ in irradiated and non irradiated GBM cell lines. Gene expression assays was made using Real Time PCR. Proliferation, clonogenic, radiation and apoptosis assays were realized in three GBM cell lines (U251, SF88, T98G) and one fibroblast cell line (MRC5). We also made proliferation assays in 5 primary cultures of samples of GMB. MGMT and DNMT3A genes showed higher expression in normal brain compared to gliomas and GBM cell lines. DNMT3B gene showed higher expression in GBM cell lines compared with normal brain and DNMT1 showed no significant differences among samples analyzed. We observed decrease of cell proliferation from 50-100µM of ZB and 250-500µM of TMZ on GBM cell lines and from 50µM of ZB for primary GBM samples. It was not observed synergy in the most combinations doses of ZB and TMZ (Calcusyn software). It was observed that 100µM of ZB and 10µM of TMZ decrease colony formation on U251 and SF188 cell lines non irradiated and irradiated with 2, 4, and 6Gy. T98G that express MGMT, did not respond to TMZ but showed response to ZB. It was also observed that 10µM of TMZ is more cytotoxic than 100µM of ZB in fibroblast cell line non irradiated and irradiated with 2Gy. ZB increase apoptosis from 100µM on the three GBM cell lines. Results obtained in this study can indicate that ZB may be an interestig therapeutic target for future studies in glioblastoma.

O emprego da metodologia de microarranjos no estudo do câncer tem permitido a identificação de genes com alterações em seus perfis de expressão, os quais estão direta ou indiretamente envolvidos na etiologia dessa doença. O crescente número de publicações de experimentos de expressão gênica em repositórios de dados de microarranjos demonstra que, em geral, a limitação não está na quantidade ou qualidade desses experimentos, mas no processamento desses dados. Dessa forma, há a necessidade de desenvolver metodologias de bioinformática que sejam capazes de analisar tais perfis de forma integrada, incluindo no contexto da análise, dados provenientes de outros experimentos. O desenvolvimento do câncer tem sido associado principalmente a distúrbios nos mecanismos de controle do ciclo celular, cujas vias são dependentes de uma maquinaria transcricional e de seus elementos regulatórios; entre estes últimos, os fatores de transcrição (FTs) têm sido estudados como potenciais alvos para a terapia molecular. No presente trabalho, um conjunto de dados de microarranjos realizados a partir de amostras de glioblastoma foi obtido em repositórios públicos (GEO e ArrayExpress). O teste estatístico SAM foi aplicado aos dados e os genes diferencialmente expressos (FDR 0,05), induzidos em glioblastoma (1.830 genes), foram submetidos a uma análise de associação a FTs (programa FatiGO+), a qual associou os FTs HNF1A, IRF7 e E2F (p 0,05) aos genes induzidos. Adicionalmente, a lista de genes foi submetida a uma análise de associação a um banco de dados de assinaturas transcricionais do software TBrowser, extraídas de diversos experimentos de microarranjos do GEO. Como resultado, 7.910 assinaturas foram associadas (p 0,01), sendo que as cem primeiras também foram relacionadas a FTs por meio de ferramentas disponibilizadas no próprio TBrowser. Os FTs E2F1 e E2F4 foram associados a mais de 80% das assinaturas analisadas. Dessa forma, ambas as análises apontaram o FT E2F, mais especificamente E2F1 e E2F4, como associados à lista inicial de genes fornecida pelo SAM. A expressão de E2F1 e E2F4 foi avaliada por meio da técnica de RT-PCR quantitativa em tempo real em amostras de RNA de sete linhagens de glioblastoma (T98, U251, U138, U87, U343, MO59J e MO59K). Interessantemente, ambos os genes foram apontados como superexpressos em todas as linhagens, a maioria com significância estatística. A família de FTs E2F apresenta papéis importantes no controle da proliferação celular e apoptose. Alguns membros atuam como oncogenes, e outros, como genes supressores de tumor, dependendo do contexto molecular nos quais se encontram. Muitos trabalhos da literatura têm apontado a importância desses FTs, especialmente E2F1, no processo de itumorigênese. Com base nos resultados obtidos no presente trabalho, o status de expressão (indução) de E2F1 e E2F4 é provavelmente associado ao glioblastoma. Esses FTs podem influenciar a expressão de uma série de genes cruciais, frequentemente alterados nessa doença, o que ainda requer um estudo mais detalhado, visando à validação desses FTs como biomarcadores, ou até mesmo como alvos moleculares que possam ser empregados no estabelecimento de novas modalidades de terapias. / The application of DNA microarrays in cancer research has provided the identification of abnormal expression profiles of a series of genes, which may be directly involved in the etiology of such disease. The increasing number of publications related to gene expression profile in microarray repositories has demonstrated that the limitation of such experiments is not associated with the quantity neither the quality of such experiments, but with data processing. Therefore, there is a great interest in the development of methodologies in bioinformatics that allow the integrated analysis of such profiles, including data set from other experiments. Cancer development has been associated mostly with changes in cell cycle control, whose intracellular pathways are dependent on the transcriptional machinery. Regulatory elements involved in transcription, which include transcriptional factors (TFs), can be potential targets for molecular therapy. In the present study, a set of microarray data achieved from glioblastoma samples were obtained from public repositories (GEO and ArrayExpress). Data were submitted to statistical analysis using SAM, and 1,830 up-regulated genes (FDR 0.05) were submitted to TFs association analysis (FatiGO+ program). Those genes were associated to the TFs HNF1A, IRF7 and E2F (p 0.05). Moreover, the set of genes was submitted to a transcription signature bank data association analysis using the software TBrowser, extracted from GEO, which provided a wide range of data sets from microarray experiments. The analysis led to 7,910 associated signatures (p 0.01); out of them, the first 100 were related to TFs according to the tools available in TBrowser. The TFs E2F1 and E2F4 were associated to more than 80% from the analyzed signatures. Therefore, both analysis suggested that the TF E2F, specifically E2F1 and E2F4, were associated to the initial gene set obtained by the SAM analysis. The expression of E2F1 and E2F4 was evaluated by quantitative real-time PCR using RNA samples from seven glioblastoma cell lines (T98, U251, U138, U87, U343, MO59J and MO59K). Interestingly, both genes were found up-regulated in all cell lines. The E2F TFs family members present important roles in cell proliferation control and apoptosis. Depending on the molecular context involved, some members act as oncogenes and others as tumor suppressor genes. A great number of studies has suggested the importance of such TFs , specially E2F1, in the tumorigenesis process. According to the present results, the expression status (induced) of E2F1 and E2F4 may be associated with glioblastoma. These TFs may influence the abnormal expression of important genes in cancer, even though detailed studies should be necessary in order to validate these TFs as biomarkers or molecular targets for therapeutical intervention.

O Glioblastoma é um dos tumores mais agressivos do sistema nervoso central e entre as diversas neoplasias possui um dos piores prognósticos. Mesmo com as novas estratégias de tratamento, a sobrevida de pacientes portadores de glioblastoma continua sendo muito baixa, sendo a temozolomida (TMZ) o agente mais comum usado no seu tratamento. O ácido tetra-o-metil nordihidroguaiarético (M4N), é um novo agente terapêutico que funciona como um repressor transcricional global de genes dependentes do fator de transcrição Sp1, tais como Survivina e Cdk1. No presente estudo, foram investigados os níveis de expressão do gene Survivina, suas variantes gênicas por splicing alternativo e Cdk1 em amostras tumorais e linhagens celulares de GBM. Adicionalmente, foram investigados os efeitos do M4N em combinação ou não com TMZ e/ou radiação em culturas primárias e linhagens celulares de GBM. Ensaios de qRT-PCR foram realizados para determiner a expressão de mRNA das variantes gênicas de Survivina e Cdk1. A proliferação celular foi analisada pelo ensaio XTT e os niveis de apoptose e variações do ciclo celular foram determinados por citometría de fluxo. Analises de combinação de drogas utilizando diferentes estratégias de administração (simultânea e seqüencial) foram realizados baseados no método de Chou-Talalay em linhagens celulares e culturas primárias de GBM. Para os ensaios de sobrevivência clonogênica, foram utilizadas as doses de 2, 4 e 6 Gy de radiação gamma. Todas as variantes por splicing alternativo de Survivina e o gene Cdk1 foram expressos em amostras (n=16) e linhagens celulares (n=6) de GBM, exceto a variante Survivina-2B que apenas foi expressa nas linhagens celulares de GBM. O tratamento com M4N diminuiu a expressão de Cdk1, Survivina e a variante Survivina-Ex3, enquanto que houve um aumento da expressão da variante Survivina-2B. O M4N diminuiu a proliferação celular de forma isolada e sinérgicamente quando combinada com TMZ. Além disso, o M4N aumentou os efeitos da radiação, principalmente quando associado com TMZ. O M4N causou morte celular apoptótica, diminuição do índice mitótico e parada do ciclo celular principalmente na fase x G2/M. Os resultados do presente estudo sugerem a potencial aplicação clínica de M4N em combinação com TMZ e radiação no tratamento do GBM. / Glioblastoma (GBM), one of the most human malignant neoplasia, responds poorly to current treatment modalities, being temozolomide (TMZ) the most used drug in its treatment. TetraO-methyl Nordihydroguaiaretic Acid (M4N) is a global transcriptional repressor of genes dependents of Sp1 transcription factor, such as Survivin and Cdk1. In this study was evaluated the gene expression of Survivin, their spliced-variants and Cdk1 in GBM samples and cell lines. Moreover, it was investigated the effects of M4N combined or not with TMZ and/or radiation on primary cultures and cell lines of GBM. qRT-PCR assays were performed to determine the Survivin-spliced variants and Cdk1 gene mRNA expression in GBM tumor samples and cell lines. Cell proliferation was measured by XTT assay and cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry. Drug combination analyzes using different schedules of administration (simultaneous and sequential) were performed based in ChouTalalay method on GBM cell lines and primary cultures. For clonogenic survival, it was used the doses of 2, 4, and 6 Gy of gamma radiation. All Survivin-spliced variants and Cdk1 gene were expressed in GBM samples (n=16) and cell lines (n=6), except the Survivin-2B variant that was only expressed in GBM cell lines. M4N treatment down regulated the expression of Cdk1, Survivin and Survivin-Ex3 variant, while the Survivin-2B variant was up-regulated. M4N decreased the cell proliferation separately and synergistically with TMZ, moreover it enhanced the radiation effects, mainly when associated with TMZ. M4N also induced apoptotic cell death, decreased mitotic index and arrested the cell cycle mainly in G2/M phase. Our results suggest a potential clinical application of M4N in combination with TMZ and radiation in GB treatment.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:54:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IzidoroJunior_MarioServulo_M.pdf: 2227378 bytes, checksum: fe650bf0745300591928bae4fac67e46 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Embora comensal da nasofaringe humana, algumas linhagens de Neisseria meningitidis ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica causando doenças como meningite e septicemia. Sabe-se também que bactérias em geral possuem taxia por células cancerígenas, isto é, possuem uma predileção por infectar células tumorais. Desta forma, neste trabalho produzimos OMV de diversas linhagens de Neisseria meningitidis e analisamos as principais características físico-químicas destas vesículas e, além disso, também verificamos as principais interações desta micropartícula com a linhagem celular NG97, uma linhagem de glioblastoma, tecido pelo qual tal bactéria é conhecida por infectar em casos patológicos, por testes morfológicos in vitro e também analisamos as citocinas inflamatórias através de quantificação relativa por Real time PCR. O grande achado deste trabalho é que a utilização de ultrafiltração substituindo a ultracentrifugação na produção de OMVs é viável, menos trabalhosa e mais rápida que os métodos descritos na literatura. Além disso, as vesículas extraídas por tal processo apresentam tamanhas e cargas superficiais como os encontrados na literatura sendo que cada cepa produz diferentes quantidades de OMVs para um mesmo tempo. Ainda, observou-se que as OMVs obtidas de linhagens atenuadas para os fatores de virulência causaram menores alterações morfológicas na linhagem NG97 do que as OMVs obtidas a partir de linhagens selvagens. A influência de tais fatores de virulência, que auxiliam na interação das células do parasita com as células do hospedeiro, também foi observada na análise das citocinas inflamatórias produzidas, onde foram constatados que na ausência da pilina (proteína responsável pela aderência da bactéria com células epiteliais e endoteliais) a produção de citocinas foi praticamente nula quando comparada com suas diferentes linhagens onde este fator de virulência é presente. Para um possível uso destas vesículas como sistemas lipossomais de entrega de drogas, acredita-se que quanto mais inócua a vesícula for maior seria a biodisponibilidade da molécula antitumoral a ser entregue, como é o caso da OMV produzida pela cepa C2135 ?pilE que, além disso, possui um tamanho menor de 200nm sendo capaz de penetrar nas junções celulares da massa tumoral / Abstract: Neisseria meningitidis is a human nasopharyngeal commensal, however, some strains occasionally exceed the respiratory mucosa and the blood brain barrier causing diseases such as meningitis and septicemia. It is well established that bacteria has a natural predilection to infect cancer cells. Thus, this study produced OMVs from different strains of Neisseria meningitidis and analyzed physicochemical characteristics of these vesicles such as size and surface charge, and also, the main interactions between this nanoparticle and NG97 cell line by in vitro morphological tests and the analyze of the production of inflammatory cytokines by relative quantification Real time PCR. The major finding of this study is that the use of ultrafiltration substituting ultracentrifugation on OMVs production makes the extraction viable, less laborous and faster than previous methods. Furthermore, the vesicles extracted by this process exhibited similar sizes and surface charges when compared to the literature and each strain produces different amounts of OMVs when comparing the same production time. In this work, we also observed that the OMVs generated by attenuated strains for virulence factors induced less morphological changes in the NG97 cells than OMVs generated from wild type strains. This trend where virulence factors which assist the parasite-host cells interaction was also observed in the analysis of cytokines produced. It was observed in the absence of pilin (protein responsible for adherence of the bacteria to epithelial and endothelial cells) the production of cytokines was much lower when compared with the different strains where this virulence factor is present. For a possible use of these lipossomal vesicles as delivery systems for drugs, it is believed that the more innocuous the greater the bioavailability of the antitumor molecule to be delivered, as in the case of OMV produced by the strain C2135 ?pilE, moreover, having a size around 200 nm fits perfectly between the cell junctions allowing the nanoparticle to reach the tumor mass, but further studies are required to confirm this hypothesis / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Roger Frigério Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T14:26:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ruas_JulianaSilveira_M.pdf: 1871713 bytes, checksum: a20e3cd08d0b770aed3b059541e382e3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A maioria das células tumorais depende da glicólise para a ressíntese de ATP durante um processo de rápida proliferação, mesmo que haja disponibilidade de oxigênio para a transdução de energia mitocondrial (Efeito Warburg). O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel do metabolismo oxidativo mitocondrial na proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G. Quando as células foram cultivadas na presença de oligomicina (um inibidor da ATP sintase) ou antimicina A (um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons), observou-se apenas uma inibição parcial da proliferação das células. Notadamente, a incubação dessas células com ambos os inibidores causou uma inibição quase completa na proliferação celular. Resultados semelhantes foram observados em cultura primária de astrócitos, havendo uma queda na proliferação celular somente quando ambos os inibidores mitocondriais estavam presentes. Medidas de consumo de oxigênio indicaram que células de glioblastoma utilizam parcialmente a fosforilação oxidativa para a ressíntese de ATP e apresentam uma respiração bem acoplada. Quando se inibiu, nestas células, a fosforilação oxidativa do ADP com oligomicina ou antimicina A, houve um pequeno aumento no consumo de glicose e na produção de lactato. No entanto, o tratamento com ambos os inibidores mitocondriais promoveu um menor consumo de glicose e produção de lactato, em comparação com os efeitos que a antimicina A promoveu. Isso indica que a cadeia transportadora de elétrons quando inibida pela presença de antimicina A, promove um funcionamento inverso da ATP sintase, promovendo a hidrólise de ATP para que haja um bombeamento de prótons para o espaço intermembranar mitocodrial. De acordo com os resultados acima descritos, uma queda quase completa do potencial de membrana mitocondrial foi observada apenas quando as células de glioblastoma foram incubadas na presença de ambos os inibidores mitocondriais, oligomicina e antimicina A. Quando a análise do ciclo celular foi realizada, observou-se uma diminuição da percentagem das células em G0-G1 e um aumento nas fases S e G2-M quando tratadas com oligomicina. Quando as células foram tratadas com antimicina A e oligomicina mais antimicina A foi constatado uma diminuição significativa nas fases G0-G1 e G2-M, e um aumento na fase S. Em conclusão, estes resultados indicam que a rápida proliferação de células de glioblastoma depende da existência do potencial de membrana mitocondrial, mas não da fosforilação oxidativa ou do transporte de elétrons na cadeia respiratória / Abstract: Most tumor cells rely on glycolysis for ATP resynthesis during rapid proliferation, despite the availability saturating levels of oxygen for mitochondrial energy transduction (Warburg effect). The aim of the present study was to evaluate the role of mitochondrial oxidative metabolism on proliferation of human glioblastoma cells U-87MG and T98G. When cells were cultured in the presence of oligomycin (ATP synthase inhibitor) or antimycin A (inhibitor of complex III of the electron transport chain), we observed only a partial inhibition of cell proliferation. Remarkably, incubation of cells with both inhibitors caused an almost complete inhibition of cell proliferation. Similar results were observed in primary culture of astrocytes, with a decrease in cell proliferation only when both mitochondrial inhibitors were present. Oxygen consumption measurements indicated that glioma cells partially rely on oxidative phosphorylation for ATP turnover and exhibit a well-coupled respiration. In fact, shutting down mitochondrial ADP phosphorylation in these glioma cells with either oligomycin or antimycin inhibitors slightly increased glucose consumption and lactate release. However, the treatment with both mitochondrial inhibitors promoted lower glucose consumption and lactate release as compared with the effects of antimycin alone, which indicates that ATP synthase is operating reversely and thus hydrolyzing ATP and pumping H+ out when the respiratory chain is inhibited by antimycin. In agreement, an almost complete collapse of mitochondrial membrane potential was only observed when the glioma cells were incubated in the presence of both antimycin and oligomycin, but not of only antimycin. When cell cycle analyses were performed in oligomycin-treated cells, a decrease in the percentage of cells in G0-G1 phase and an increase in S and G2-M phases were observed. When cells were treated with antimycin A or oligomycin plus antimycin A, it was observed a significant decrease in G0-G1 and G2-M cell phases and an increase in S phase. Overall, our results suggest that the rapid proliferation of glioblastoma cells is dependent on the mitochondrial membrane potential, but not on oxidative phosphorylation or electron transport in the respiratory chain / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestra em Ciências