Le récepteur des glucocorticoïdes (GR) est un facteur de transcription, activé par la libération de glucocorticoïdes (GCs) en réponse à un stress. Il est impliqué dans la modulation des comportements influencés par le stress tels que les émotions, les comportements sociaux et l’addiction. L’invalidation du GR dans les neurones dopaminoceptifs (GRD1Cre) entraine une diminution des réponses à la cocaïne. Afin d’identifier les gènes cibles du GR, une analyse comparative du transcriptome de souris contrôles et GRD1Cre, en conditions basales, suite à un traitement à la cocaïne ou aux GCs, a été réalisée. Le GR agit principalement comme activateur de la transcription dans les neurones dopaminoceptifs, quelque soit le traitement. De plus, une corrélation entre les gènes régulés par le GR suite à un traitement aux GCs et ceux régulés suite à un traitement à la cocaïne existe. Le GR contrôle l’expression de ses gènes par des mécanismes variés dont certains impliquent le recrutement du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF. Ce complexe est composé d’une ATPase catalytique qui peut être soit Brahma (BRM), soit BRG1 (Brahma-Releated Gene 1), deux protéines qui partagent un haut degré d’homologie. Nos résultats montrent que le GR interagit avec l’une et l’autre dans le striatum, structure clé dans l’addiction. En utilisant des souris invalidées pour BRM (BRM-/-) et/ou spécifiquement pour BRG1 (BRM-/-BRG1D1Cre et BRG1D1Cre), un rôle différentiel de BRM et BRG1 a été mis en évidence. Alors que BRM n’est pas nécessaire aux réponses à la cocaïne, BRG1 dans les neurones dopaminoceptifs est essentiel aux réponses à cette drogue. BRG1 est également impliqué dans les réponses locomotrices à la morphine. De manière différente, BRG1 et BRM se compensent dans les comportements émotionnels. / The glucocorticoid receptor (GR) is a transcription factor involved in the stress response, activated by glucocorticoids (GCs). Inactivation of GR in dopaminoceptive neurons (GRD1Cre) induces a decrease of behavioral and cellular responses to cocaine. In order to identify the GR target genes, we performed thorough transcriptome analyses using controls and GRD1Cre mice under basal conditions, after treatment of cocaine or GCs. We highlighted that GR acts predominantly as a transcriptional activator within dopaminoceptive neurons. We then identified a closed link between genes induced in responses to an acute stress and in response to cocaine. GR controls expression of its target genes by numerous mechanisms. We examined the putative contribution of the SWI/SNF chromatin remodeler complexes. This multi-subunit complex contains either BRM (Brahma) or BRG1 (Brahma-related gene 1) as central ATPase subunit. We detected an interaction between GR and BRG1, and between GR and BRM in the striatum. To understand the role of BRM and BRG1 proteins, we developed animals with a constitutive BRM inactivation (BRM-/-) and/or with a specific deletion of BRG1 in dopaminoceptive neurons (BRM-/-BRG1D1Cre, BRG1D1Cre mice). A differential role of theses two proteins has been highlighted. While BRM is not required for behavioral responses to cocaine, BRG1 within dopaminoceptive neurons is essential. BRG1 is also involved in locomotor responses to morphine. Nevertheless, inactivation of either BRM or BRG1 gene in dopaminoceptive neurons did not change anxiety-like behaviors.

Une grande diversité dans la réponse adaptative au stress est observée entre les individus favorisant une sensibilité variable face aux stresseurs et pouvant conduire à une vulnérabilité à développer divers troubles et pathologies. Cette diversité est sous tendue par les caractéristiques propres de chaque individu, déterminées par le patrimoine génétique en interaction avec les facteurs environnementaux. Des études génétiques menées au laboratoire ont permis de placer le gène de la Cbg comme un candidat important influençant les réponses de stress. L’équipe a alors développé un modèle de souris déficiente pour le gène Cbg (k.o. total). La CBG est une glycoprotéine plasmatique responsable de la biodisponibilité et du transport jusqu’à leur cible des glucocorticoïdes, produits finaux de l’axe corticotrope. A l’aide de ce modèle original, l’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier les conséquences fonctionnelles de la déficience en CBG sur les réponses de stress. Nous avons ainsi analysé l’activité et la réactivité de l’axe corticotrope ainsi que les comportements émotionnels des mâles et des femelles k.o. Cbg dans des conditions de repos, de stress aigu et dans un contexte mimant l’effet d’un style de vie occidentale (modélisé par une alimentation enrichie en gras, associée à un stress chronique). Nous présentons ainsi un modèle murin unique d’hypo-réponse des glucocorticoïdes au stress associé à une réponse comportementale adaptative ralentie au niveau émotionnel et cognitif. L’ensemble de ces travaux contribue à placer la CBG et son gène comme acteur majeur de la variabilité individuelle des réponses de stress. / A great diversity in the adaptive response to stress is observed between individuals favoring a variable sensitivity to face stressors and leading to a vulnerability to develop various disorders and diseases. This diversity is due to the characteristics of each individual, as determined by the genetic background in interaction with environmental factors. Genetic studies conducted in the laboratory demonstrated that the Cbg gene is an important candidate influencing stress responses. The team then developed a mouse model deficient for the gene Cbg (total k.o.). CBG is a plasma glycoprotein responsible for the bioavailability and the transport of glucocorticoids, the final products of the HPA axis, to their target.Using this original model, the objective of my thesis was to study the functional consequences of CBG deficiency on responses to stress exposure. We have analyzed the activity and reactivity of the HPA axis and the emotional behaviors of males and females k.o. Cbg in resting conditions, acute stress and in a context that mimics the effect of a Western life style (modeled by a high fat diet, associated with chronic stress). We present an unique mouse model of glucocorticoid hyposignaling in response to stress associated with behavioral responses slowed down at the emotional and cognitive levels. Overall, this work contributes to place CBG and its gene as major actor of individual variability to stress.

La mucoviscidose (ou cystic fibrosis, CF) est une maladie caractérisée par une inflammation pulmonaire chronique qui contribue à la dégradation progressive de l’épithélium des voies aériennes des patients. Les glucocorticoïdes (GC) représentent un outil essentiel pour le traitement du patient mais leur efficacité et leur rapport bénéfice/risque restent cependant controversés. Les effets secondaires provoqués par l’administration de ces molécules pourraient être diminués par l’utilisation de leur protéine d’adressage, la corticosteroid-binding globulin (CBG). L’objectif de ce travail était d’étudier l’expression de la CBG chez les patients CF, afin d’optimiser leur traitement anti-inflammatoire par GC. Nous avons montré, dans un premier temps, que la synthèse hépatique de CBG était augmentée, tandis que son taux plasmatique était conservé chez les patients CF, comparé aux patients non-CF. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à l’expression de la CBG au niveau pulmonaire. L’inflammation chez les patients CF étant principalement pulmonaire, l’expression locale de CBG à ce niveau pourrait moduler l’efficacité du GC, en le recaptant. Nos données montrent que l’expression de cette CBG pulmonaire est diminuée chez les patients CF. Les études sur des modèles in vitro hépatiques et pulmonaires n’ont pas permis d’expliquer les résultats obtenus et ont souligné la limite des modèles et des outils à disposition. Le maintien de la concentration plasmatique de CBG et la diminution de la CBG pulmonaire chez les patients CF suggèrent ainsi que la CBG pourrait être utilisée comme outil thérapeutique dans le contexte de la mucoviscidose, afin d’optimiser le traitement par GC. / Cystic fibrosis (CF) is characterized by a chronic pulmonary inflammation, responsible of the progressive degradation of the airways epithelium. In CF, glucocorticoids (GC) are widely used but their efficiency and benefit/risk ratio are still discussed. The side effects, caused by the administration of these molecules, might be decreased by the use of their delivery protein, corticosteroid-binding globulin (CBG). The aim of the work was to study the expression of CBG in CF patients, in order to optimise their anti-inflammatory treatment by GC. First, we showed that the hepatic synthesis of CBG was increased while its plasmatic level was preserved in CF patients, compared to non-CF. Second, we were interested by the expression of CBG at the pulmonary level. The inflammation in CF patients being primarely pulmonary, the local expression of CBG in the lung could modulate the efficiency of GC through recapture. Our data showed that this expression of this pulmonary CBG was decreased in CF patients. The studies conducted in vitro on hepatic and pulmonary models did not explained our results and highlighted the limit of the models and tools at our disposal. The maintained plasmatic concentration of CBG and the decrease of pulmonary CBG in CF patients suggest that CBG might be useful as a therapeutic tool in the CF context, in order to optimise the GC treatment.

Les formes oligomériques du peptideβ-amyloïde (oAβ) sont toxiques pour les synapses et engendrent la perte de mémoire lors de la phase précoce de la maladie d’Alzheimer (MA). La MA est aussi associée à une dérégulation de l’axe du stress engendrant une augmentation des glucocorticoïdes (GCs) qui activent les récepteurs associés (GRs). Nous avons montré que, dans un modèle murin de la MA, les Tg2576 (Tg+), l’inhibition des GRs prévient les déficits de mémoire et de plasticité synaptique (Lanté et al. 2015). Nous avons continué à étudier le rôle des GRs dans la physiopathologie de la MA. La dérégulation de l’axe du stress dans les souris Tg+ est caractérisée par des niveaux élevés de GCs et la perte de la boucle de rétroaction négative. Aussi, nous avons croisé les souris Tg+ avec des souris GR floxées pour générer des double mutants GRlox/lox Tg+. Ces souris exhibaient plusieurs phénotypes non-anticipés et nous avons décidé de mettre fin à cette lignée de souris. Nous avons aussi analysé la relation fonctionnelle spécifique entre les GRs et oAβ à la synapse en utilisant un traitement aigu d’oAβ. Dans des cultures de neurones, ce traitement a favorisé une augmentation des niveaux de GRs à la synapse. Aussi, nous avons montré que bloquer l’activité des GRs par pharmacologie ou par ablation génétique neutralise l’effet inhibiteur d’oAβ sur la potentialisation synaptique étudiée sur tranches d’hippoccampe. En conclusion, nos résultats sur souris Tg+ suggèrent la présence d’une dérégulation en début de MA. Aussi, nous mettons en évidence une relation fonctionnelle entre oAß et GRs à la synapse, les GRs jouant en rôle clé dans la synapto-toxicité induite par oAß. / Strong evidence shows that oligomeric forms of the amyloid-ß peptide (oAß) cause synapse dysfunction promoting loss of hippocampus-dependent memories in the early phase of Alzheimer’s disease (AD). AD is also associated with Hypothalamus-Pituitary-Adrenal (HPA) axis dysfunction which results in an increase of glucocorticoids (CORT) activating glucocorticoid receptors (GRs). We showed that subchronic GR antagonist in 4 month Tg2576 (Tg+) mice could rescue the synaptic deficit and memory impairment (Lanté et al., 2015).In this context, we studied the contribution of GRs to AD physiopathology. Dysregulated HPA axis was characterized by increased CORT levels at 4 and 6 months of age and by loss of CORT feedback inhibition in the Tg+ mice. We further crossed the Tg+ with GRlox/lox to produce GRlox/loxTg+ mice. These mice innately exhibited high CORT levels from weaning period and due to other several unforeseen reasons, we discontinued using this new mouse model. Instead, to identify the functional relationship between the GRs and oAß at synapses, we shifted to acute oAß treatment in neurons in vitro and ex-vivo hippocampus slices. In neuron cultures, GR levels increased in the post synaptic density upon acute oAß treatment. Further, treatment of oAß on ex-vivo hippocampus slices after either pharmacological blocking of GR or genetic ablation, prevented the oAβ-dependent LTP impairment. To conclude, our results with the Tg+ mice suggest that a neuroendocrine dysregulation occurs during the onset of AD pathology. Additionally, we have evidence for a functional relationship between oAß and GRs with GRs at the synapse playing an important role in acute Aß-induced synapto-toxicity.

Au cours de ce travail de thèse nous avons proposé une stratégie de ciblage des macrophages alvéolaires afin d’y vectoriser des glucocorticoïdes. Une prodrogue de budésonide, le palmitate de budésonide (BP) a été synthétisée dans le but de prolonger sa demi-vie dans les poumons après inhalation. Des nanoparticules PEGylées de BP ont été développées et étudiées pour obtenir une formulation stable avec des caractéristiques physico-chimiques appropriées et un taux de charge élevé pour pénétrer dans les macrophages alvéolaires, cellules centrales dans l'inflammation pulmonaire. Des tests in vitro sur les macrophages RAW 264.7 ont confirmé l'activité anti-inflammatoire et l'absence de cytotoxicité des nanoparticules. Celles-ci ont ensuite été séchée au sein de microparticules Troyennes obtenues par atomisation-séchage afin de faciliter leur administration pulmonaire sous forme de poudres et libérer les nanoparticules à proximité des alvéoles pulmonaires. Les microparticulessphériques creuses contenant de 0 % à 20 % de nanoparticules de BP présentent des diamètres aérodynamiques et une fraction de particules fines appropriés pour la délivrance pulmonaire. Les études pharmacocinétiques in vivo montrent des concentrations élevées et prolongées de budésonide dans les poumons, avec de faibles concentrations plasmatiques. Dans la deuxième partie de cette thèse, une autre stratégie de ciblage des macrophages a été évaluée par la décoration de la surface des nanoparticules avec du mannose. Après la synthèse d'un lipide mannosylé, des nanoparticules ont été formulées et caractérisées, démontrant un taux de charge élevé et une bonne stabilité jusqu'à 30 jours. Des tests in vitro sur les macrophages RAW 264.7 ont montré que la présence du mannose à la surface augmente l'internalisation des nanoparticules d’un facteur 2 après 48 h d'incubation, par rapport aux nanoparticules PEGylées. / This work focuses on strategies to target glucocorticoids to alveolar macrophages. We have synthesized a budesonide prodrug, budesonide palmitate (BP), increasing its lipophilicity to extend drug half-life in the lungs. BP PEGylated nanoparticles were developed and studied to obtain a stable formulation with suitable physicochemical characteristics and high drug loading to enter alveolar macrophages, key players in lung inflammation. In vitro tests on RAW 264.7 macrophages confirmed the anti-inflammatory activity and absence of cytotoxicity of nanoparticles. These were then encapsulated into Trojan microparticles obtained by spray-drying to facilitate their delivery to the lung as dry powders and release nanoparticles directly to the pulmonary alveoli. Spherical hollow microparticles containing from 0 % to 20 % of BP nanoparticles presented suitable aerodynamic diameters and fine particle fraction for lung delivery. In vivo pharmacokinetic studies demonstrated high and extended budesonide concentrations in the lungs, with low plasma concentrations. In the second part of this thesis, another macrophage targeting strategy was assessed by decoration of nanoparticle surface with mannose. After synthesis of a mannosylated lipid, nanoparticles were formulated and characterized, demonstrating high drug loading and stability up to 30 days. In vitro tests on RAW 264.7 macrophages showed that the presence of mannose on the surface increases nanoparticles internalization 2 fold after 48 h incubation, as compared with PEGylated nanoparticles.

Les gènes de la sous-famille CYP2B sont fortement activés par des traitements au phénobarbital ou des inducteurs de type phénobarbital, et cette réponse nécessite la présence du constitutive androstane receptor (CAR). La dexaméthasone, un glucocorticoïde synthétique, a la capacité d' induire CYP2Bl et CYP2B2 chez le rat et CYP2B lOchez la souris. Les travaux présentés dans ce mémoire démontrent le rôle majeur du récepteur des glucocorticoïdes (GR) dans la réponse à la dexaméthasone, ce qui constitue une nouvelle voie de régulation des gènes CYP2B. De plus, cinq régions critiques impliquées dans la réponse ont été caractérisées et elles formeraient les éléments clé d'une unité de réponse aux glucocorticoïdes de CYP2B2. Pour la première fois, CAR peut jouer le rôle de facteur accessoire, en stimulant la réponse à la dexaméthasone passant par GR. En conclusion, les résultats présentés ici décrivent une nouvelle voie de régulation des gènes CYP2B de rongeurs.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Chaque année, 130 000 personnes subissent une lésion de la moelle épinière, entraînant une paralysie totale ou partielle de leurs membres. Le seul traitement approuvé, un glucocorticoïde, demeure controversé puisque le rôle de la réponse inflammatoire qui se développe à la suite d'une lésion est encore mal compris. Par l'étude d'un nerf périphérique pouvant régénérer de façon autonome, il est possible d'évaluer l'importance de l'inflammation dans le processus de régénérescence axonale. Notre étude porte sur le rôle des récepteurs Toll-like (TLRs) dans l'initiation de la réponse immunitaire, la dégénérescence Wallérienne et le recouvrement locomoteur suite à une lésion nerveuse périphérique. Les expériences furent effectuées en utilisant des animaux déficients en TLR2, TLR4 et MyD88, ou en employant des agonistes ou inhibiteurs des TLRs. Nos résultats suggèrent que les TLRs seraient activés par des molécules endogènes présentes ou relâchées lors d'une blessure physique et, par l'initiation d'une réponse immune, favoriseraient l'élimination des débris de myéline et la régénérescence nerveuse. / Each year, 130 000 people suffer a spinal cord injury, inducing a total or partial paralysis of their members. The only approved treatment, a glucocorticoid, is still controversial since the role of the inflammatory response that develops after injury is still poorly understood. With the study of a peripheral nerve that can regenerate in an autonomous manner, it is possible to evaluate the importance of inflammation in the process of axonal regeneration. Our study involves the role of the toll-like receptors (TLRs) in the initiation of the immune response, Wallerian degeneration and behavioural recovery after a peripheral nerve lesions. The experiments were performed using mice deficient for TLR2, TLR4 and MyD88, or by employing agonists or inhibitors of TLR signaling. Our results indicate that TLRs could be activated by endogenous molecules present or expressed following traumatic injury and, through initiation of immune responses, could permit the elimination of myelin debris and nerve regeneration.

Objectif : Déterminer le rôle du sexe en réponse aux glucocorticoïdes anténataux (GCA) pour la prévention du syndrome de détresse respiratoire (SDR). Méthode : Une revue systématique et une méta-analyse des essais randomisés contrôlés ont été réalisées afin de comparer les risques relatifs entre les garçons et les filles pour le risque de SDR, et secondairement, les hémorragies intraventriculaires (HIV) et la mortalité néonatale. Les risques relatifs globaux ont été calculés à l'aide du modèle à effets aléatoire avec des intervalles de confiance à 95 %. Résultats : Huit études ont rencontré les critères d'inclusion et ont été analysées. Nous n'avons pas démontré de différence significative entre mâles et femelles pour la diminution du risque de RDS (mâles RR: 0.50 [0.33, 0.77], femelles RR: 0.57 [0.43, 0.75], p=0.99), de l'HIV ou de la mortalité néonatale. Conclusion : L'évidence provenant de la littérature ne nous a pas permis d'observer de différences sexuelles dans la réponse aux GCA en prévention du SDR.

Le syndrome de détresse respiratoire (SDR) est plus fréquent chez les nouveau-nés de sexe masculin que féminin, alors que les androgènes et les glucocorticoïdes sont reconnus pour ralentir et accélérer, respectivement, la maturation pulmonaire. Premièrement, nous avons étudié les différences sexuelles dans le transcriptome pulmonaire fœtal chez la souris par une approche de micropuces d’ADN durant une fenêtre de gestation qui précède et inclut la montée de production du surfactant, qui est asynchrone entre femelles et mâles en défaveur de ces derniers. Quatre-vingt-huit transcrits présentant une différence sexuelle dans leur niveau d’expression aux jours gestationnels (JG) 15.5, 16.5 ou 17.5 ont été identifiés. Ils sont impliqués notamment dans la régulation et le métabolisme hormonal, l’apoptose, la régulation transcriptionnelle et le métabolisme des lipides et sont des candidats pour un rôle dans la maturation pulmonaire et la physiopathologie du SDR. Deuxièmement, l’expression des 17β-hydroxystéroïdes déshydrogénases (17βHSD) de types 2 et 5, qui sont respectivement impliquées dans l’inactivation et la synthèse des androgènes, et du récepteur des androgènes (AR) a été caractérisée dans des poumons fœtaux humains. Des relations entre les niveaux d’expression et l’âge gestationnel ont été observées. La 17βHSD2 et le AR ont été co-localisés notamment dans l’épithélium, alors que la 17βHSD5 a été localisée dans certaines cellules épithéliales. Le niveau protéique de AR a montré d’importantes différences interindividuelles. Ces résultats supportent l’existence d’un métabolisme local des androgènes et une régulation fine de l’occupation de AR dans les poumons fœtaux mâles et femelles durant la période où une naissance prématurée présente de hauts risques. Troisièmement, l’expression de gènes associés à l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) a été quantifiée et localisée dans des poumons fœtaux murins aux JG 15.5, 16.5 et 17.5. La capacité de la corticolibérine (CRH) et de la corticotropine à stimuler l’expression d’enzymes de synthèse de glucocorticoïdes par le poumon fœtal a aussi été abordée, ainsi que la production de glucocorticoïdes. Différents profils d’expression ont été déterminés, l’incubation d’explants pulmonaires fœtaux en présence de CRH augmenta l’expression de la 21-hydroxylase, alors qu’une production de désoxycorticostérone a été détectée. Les modulations temporelles et spatiales observées suggèrent des rôles dans le développement pulmonaire pour des gènes associés à l’axe HPA. / Respiratory distress syndrome (RDS) is more frequent in male neonates than female neonates. Androgens and glucocorticoids are known to delay and accelerate, respectively, the fetal lung maturation. Firstly, we studied the sex differences in the mouse fetal lung transcriptome during a gestational period that overlaps the surge of surfactant synthesis, which occurs earlier in females than in males. Using DNA microarrays, 88 transcripts showing a sex difference in expression at gestational days (GD) 15.5, 16.5, or 17.5 were identified. Those genes were associated to several functional categories, including hormone metabolism and regulation, apoptosis, transcriptional regulation, and lipid metabolism, and are candidates for roles in lung maturation and in the physiopathology of RDS. Secondly, the expression of 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17βHSD) type 2 and 5, which are respectively involved in androgen inactivation and synthesis, and of the androgen receptor (AR), was characterized in human fetal lungs. Statistically significant relationships between expression levels and gestational age were observed. In particular, 17βHSD2 and AR were co-localized in epithelial cells, while 17βHSD5 was localized in a subset of epithelial cells mostly in conducting zones. AR protein levels showed an important interindividual variability. The obtained results support the presence of a local androgen metabolism and a fine-tuning of AR occupancy in human male and female fetal lungs during a gestational period associated with high-risk premature birth. Thirdly, the expression of hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis-related genes was quantified and localized in murine fetal lungs at GD 15.5, 16.5, and 17.5. Also, the capability of corticotropin-releasing hormone (CRH) and adrenocorticotropic hormone (ACTH) to stimulate the pulmonary expression of enzymes involved in the “adrenal” pathway of glucocorticoid synthesis was addressed, as well as the glucocorticoid production. Several distinct gene expression profiles were established, the incubation of fetal lung explants with CRH led to increased levels of 21-hydroxylase gene expression, whereas deoxycorticosterone accumulation was detected. The observed temporal and spatial modulations suggest roles for HPA axis-related genes in the developing lung.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / La migration nucléaire du récepteur nucléaire CAR est l'événement central du modèle expliquant l'induction des gènes CYP2B par les inducteurs de type phénobarbital. Chez des souris CAR-négatives, l'induction des CYP2B est absente. Récemment, des résultats en contradiction avec ce rôle de CAR dans l'induction du gène Cyp2bl0 furent publiés sans que cette interprétation ne soit mentionnée. Afin de vérifier la validité de ces données cruciales, certaines des expériences présentées dans la publication susmentionnée furent répétées. Les résultats obtenus suggèrent que CAR est requis pour qu'il y ait induction du niveau d'ARNm de CYP2B10. Le rôle de la protéine de Wemer dans la transcription fut aussi étudié. Les résultats obtenus suggèrent qu'elle est impliquée dans la transcription des gènes CYP2B et qu'elle se fixe à différents facteurs transcriptionnels. Finalement, le rôle du GR dans l'induction des CYP2B fut étudié. Les résultats obtenus montrent que la GRU flanquant CYP2B2 possède un site accessoire putatif.