Le syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa) est une microangiopathie thrombotiquecomplément-dépendante dont l'atteinte majoritairement rénale reste, à ce jour, incomprise.L'objectif de ce travail était d'améliorer la compréhension de ce tropisme d’organe au moyen dedeux axes d'étude : i) la susceptibilité de l'endothélium glomérulaire à l'hémolyse, celle-ci étant à la fois la conséquence des microthromboses dans le SHUa et un amplificateur de la voie alterne du complément via l'hème libre, molécule issue des globules rouges lysés ; ii) le rôle potentiel du récepteur aux produits de glycation avancés ou RAGE. Ce récepteur membranaire aux fortes propriétés pro inflammatoires et pro thrombotiques a en effet été impliqué dans de nombreuses pathologies rénales, et sa liaison au C3a - anaphylatoxine libérée dans l'activation du complément - a été rapportée par une équipe.La première partie de ce travail a visé à expliquer la vulnérabilité de l'endothélium glomérulaire sous l'effet d'une hémolyse. Nous avons étudié plusieurs types de cellules endothéliales exposées +/- à l'hème, et mis au point un modèle murin traité par de l'hème. En conditions hémolytiques, plusieursfacteurs pouvant participer à cette susceptibilité endothéliale glomérulaire ont ainsi été mis en avant: i) une moindre liaison du facteur H, principal régulateur du complément, à sa surface ; ii) une faible expression de la thrombomoduline, protéine de la coagulation et régulatrice du complément ; iii) une faible expression de l'enzyme principale de dégradation de l'hème, l'hème-oxygénase 1. Ces deux derniers points étaient rattachés à une faible induction endothéliale glomérulaire de leurs facteurs de transcription, KFL2 et KLF4.La seconde partie de ce travail s'est concentrée sur le RAGE. N'ayant pas réussi à reproduire l'interaction RAGE/C3a, nous avons exploré l'hypothèse d'une liaison du RAGE à l'hème. En effet, le seul récepteur endothélial connu jusqu'à présent est le Toll Like Receptor 4 (TLR4), qui partage plusieurs ligands communs avec le RAGE (LPS - lipopolysaccharide, HMGB1 - high–mobility group box1). Nous avons découvert que le RAGE était un récepteur de l'hème, et identifié que le site de liaisonse trouvait sur le domaine V. A l'aide d'un modèle murin invalidé pour le RAGE et traité +/- par l'hème, nous avons mis en évidence que : i) l'invalidation de RAGE avait un effet protecteur en cas d’exposition à l'hème, marqué par une diminution de l'expression de gènes de l'inflammation (IL1β,TNFα) et du facteur tissulaire au niveau pulmonaire, organe exprimant le plus fortement RAGE ; ii)l'hème activait la phosphorylation des voies ERK1/2 et Akt via le RAGE.Par ces travaux, nous avons précisé les liens entre activation du complément, hémolyse et susceptibilité endothéliale glomérulaire dans le SHUa. Parallèlement, nous avons identifié le RAGE comme un nouveau récepteur à l'hème, dont la liaison à ce récepteur activerait différentes voies designalisation de l'inflammation. Le contrôle de l'hème et du RAGE pourrait ainsi constituer de nouvelles voies thérapeutiques dans le SHUa et les maladies hémolytiques. / The atypical haemolytic uremic syndrome (aHUS) is a thrombotic microangiopathy of which the predominantly renal damage remains, to date, misunderstood. The aim of this work was to improve the understanding of this organ tropism by two axes of study: i) the susceptibility of the glomerular endothelium to hemolysis, which is the consequence of microthrombosis in aHUS, and also an complement pathway enhancer via free heme, hemoglobin-mediated hemolysis molecule, ii) the potential role of the receptor for advanced glycation end products, RAGE. Indeed, RAGE is described as an endothelial receptor with high proinflammatory and prothrombotic potential, involved in many kidney diseases; a team also reported that it was a receptor for the C3a molecule, anaphylatoxin released in complement activation.The first part of this work aimed to explain the vulnerability of the glomerular endothelium under the effect of hemolysis. We studied several types of endothelial cells exposed +/- to heme, and developed a murine model treated with heme. In hemolytic conditions, several factors that could participate in the endothelial glomerular susceptibility have been put forward: i) less binding of factor H, the main complement regulator, on its surface; ii) low expression of thrombomodulin, coagulation protein and complement regulator; iii) low expression of heme-oxygenase 1, the main heme degradation enzyme. These last two points were related to low induction, on glomerular endothelial cells, of transcription factors, KFL2 and KLF4.The second part of this work focused on RAGE. Having failed to reproduce the RAGE / C3a interaction, we explored the hypothesis of a linkage of RAGE to heme. Indeed, the only known endothelial receptor is Toll Like Receptor 4 (TLR4), which shares several common ligands (LPS - lipopolysaccharide, HMGB1 - high-mobility group box 1). We found that RAGE was a heme receptor, and identified that the binding site was on domain V. Using a mouse model knock out for RAGE and treated +/- with heme, we demonstrated that i) the invalidation of RAGE had a protective effect in case of exposure to heme, marked by a decrease in the expression of genes of inflammation (IL1β; TNFα; and tissue factor) at the pulmonary level, organ expressing most strongly RAGE, ii) the heme is an activator or the phosphorylation of ERK1 / 2 and Akt pathways via RAGE.Through this work, we have clarified the links between complement activation, hemolysis and glomerular endothelial susceptibility in aHUS. At the same time, we have identified RAGE as a new heme receptor, whose RAGE/heme bindind would activate different signaling pathways for inflammation. The control of heme and RAGE could constitute new therapeutic pathways in the aHUS, and hemolytic diseases.

Schätzungsweise 1 – 2 % der europäischen Bevölkerung reagieren allergisch auf bestimmte Lebensmittel. Die verantwortlichen Allergene sind meist Proteine und können während der Lebensmittelverarbeitung, vor allem infolge thermischer Prozesse, erheblich modifiziert werden. Daraus kann sowohl eine Senkung als auch eine Erhöhung des allergenen Potentials resultieren. Insbesondere die Entstehung von sog. „Neoepitopen“ in der Folge der Maillard-Reaktion ist bereits diskutiert worden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Glykierung und dem allergenen Potential von Lebensmitteln, im Speziellen von Karotten und Erdnüssen, untersucht. Die Karottenallergie ist in der europäischen Bevölkerung relativ häufig. Etwa 23 – 25 % aller Nahrungsmittelallergiker leiden an dieser meist pollenassoziierten Allergie. Es ist bekannt, dass das allergene Potential von Karotten durch Hitzebehandlung, infolge der irreversiblen Denaturierung des Hauptallergens Dau c 1, stark gesenkt wird. Daher stellte sich die Frage, ob bestimmte Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) als Indikatoren für die Senkung des allergenen Potentials infolge der Hitzebehandlung geeignet sind. Da zum Ausmaß der Maillard-Reaktion in hitzebehandelten Karotten bisher kaum Daten vorlagen, wurden zunächst Untersuchungen zu relevanten Glykierungsprodukten und zur resultierenden Aminosäuremodifizierung durchgeführt. In verschiedenen Handelsproben (Säfte, Breie, Konserven und getrocknete Karotten) waren neben Fru-Lys die Amadori-Produkte (AP) zahlreicher Aminosäuren, wie Fru-Ala und Fru-GABA nachweisbar. Als Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion (advanced glycation endproducts, AGEs) wurden erstmals Pyrralin, Carboxymethyllysin (CML) und Pentosidin detektiert. Die resultierenden Aminosäure-modifizierungen waren in Produkten mit hohem Wasseranteil (Säfte, Breie sowie Konserven) mit bis zu 5 % gering. Dagegen zeigten getrocknete Karotten sehr hohe Derivatisierungsgrade (z. B. Lysin bis 58 %). Dabei war besonders die frühe Phase der Glykierung von Bedeutung, während die fortgeschrittene Phase kaum eine Rolle spielte. Das AP Fru-Lys bzw. dessen Hydrolyseprodukt Furosin gilt zwar als anerkannter Erhitzungsmarker für Lebensmittel, erwies sich aber in Karottenprodukten aufgrund von schnell stagnierenden Gehalten nur als bedingt geeignet. Insbesondere FM-GABA zeigte eine wesentlich bessere Korrelation mit der Intensität der Hitzebehandlung. Zudem korrelierte der Anstieg dieses AP gut mit der Senkung des Gehaltes an IgE-reaktivem Dau c 1. Damit ist FM-GABA ein geeigneter Parameter sowohl für die Hitzebehandlung von Karotten als auch für die damit verbundene Senkung des allergenen Potentials. Die Erdnussallergie gewinnt mit dem ansteigenden Verzehr von Erdnüssen zunehmend an Bedeutung. Diese Allergie zeichnet sich durch eine mitunter sehr schwere Symptomatik aus, so dass Erdnüsse hinsichtlich lebensbedrohender und letal verlaufender Nahrungsmittel-allergien an erster Stelle stehen. Bereits der Verzehr kleinster Mengen an Erdnuss, selbst Hautkontakt oder Inhalation können eine allergische Reaktion auslösen. Die Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, sind bekanntermaßen stabil und behalten ihr allergenes Potential während der Hitzebehandlung bei. Dennoch besteht die Vermutung, dass die Zubereitung von Erdnüssen deren Allergenität maßgeblich beeinflusst. Daher wurde der Einfluss des Röstens bereits untersucht, jedoch sind die erhaltenen Ergebnisse bisher sehr widersprüchlich. Während in einigen Studien keine Unterschiede zwischen rohen und gerösteten Erdnüssen beobachtet wurden, berichteten andere Autoren von einer 90-fachen Erhöhung des IgE-Bindungsvermögens infolge der Röstung, die mit der Bildung von Neoepitopen durch die Maillard-Reaktion in Verbindung gebracht wurde. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Röstung und insbesondere der Glykierung auf das allergene Potential von Erdnüssen untersucht. Da bisher kaum Daten zu MRP-Gehalten in Erdnüssen vorlagen, wurden zunächst verschiedene handelsübliche Proben (ungeröstete und geröstete Erdnüsse, Erdnussbutter und Erdnussflips) auf ihre Gehalte an Glykierungsprodukten und die resultierende Aminosäure-modifizierung untersucht. Dabei wurde erstmals das AP Fru-Lys und die AGEs Pyrralin und CML identifiziert und quantifiziert. Definierte Erhitzungsexperimente zeigten, dass während der Röstung von Erdnüssen insbesondere Pyrralin in hohen Mengen gebildet wird. Während in erhitzten Lebensmitteln üblicherweise Fru-Lys das dominierende MRP darstellt, trug Pyrralin in gerösteten Erdnüssen in vergleichbarem oder höherem Maße zur Lysinmodifizierung bei als das AP. Aufgrund der stetigen Zunahme ist Pyrralin als Erhitzungsparameter in Erdnüssen wesentlich besser geeignet als das Hydrolyseprodukt Furosin, dessen Gehalt schnell ein Plateau erreichte. Durch die Röstung von Erdnüssen wurden hohe Lysinmodifizierungen bis zu 55 % erreicht, die jedoch nur zu einem Zehntel durch die gemessenen MRP erklärbar waren. Da zahlreiche andere Aminosäuren ebenfalls deutliche Abnahmen zeigten, müssen andere Reaktionen neben der Maillard-Reaktion einen wesentlichen Beitrag zur Aminosäurederivatisierung leisten. Aufgrund des hohen Gehaltes an ungesättigten Fettsäuren liegt die Vermutung nahe, dass es sich um Reaktionen mit Lipidperoxidationsprodukten handeln könnte. Der Einfluss der Röstung auf das allergene Potential der Erdnüsse wurde anhand des Antikörperbindungsvermögens bewertet. Dabei zeigten die Proteinextrakte roher und gerösteter Erdnüsse keine Unterschiede in der IgE-Reaktivität. Jedoch sind aufgrund der schlechten Extrahierbarkeit gerösteter Erdnussproteine keine Rückschlüsse auf das allergene Potential der gesamten Erdnüsse möglich. Vor allem das Allergen Ara h 1 bildete zunächst Di- und Trimere, unter drastischeren Bedingungen kam es zur weiteren Aggregation und damit zur Unlöslichkeit. Analog wurde auch die Löslichkeit aller anderen Erdnussproteine deutlich reduziert. Folglich konnten insbesondere stark modifizierte, aggregierte Proteine mit der verwendeten Extraktionsmethode nicht erfasst werden. Mittels Immunoblot wurde gezeigt, dass das IgE-Bindungsvermögen des Ara h 1 bei der Röstung nicht verändert wurde, solange das Allergen noch löslich war. Aussagen zum allergenen Potential des aggregierten Proteins waren noch nicht möglich. Hingegen wurden deutliche Hinweise auf die Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung erhalten. Um den Einfluss der Maillard-Reaktion im Einzelnen auf die beiden Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, untersuchen zu können, wurden diese Allergene aus rohen Erdnüssen isoliert und unter röstungsrelevanten Bedingungen glykiert. Durch diese Modifizierung wurde deren Antikörperbindungsvermögen jedoch nicht beeinflusst. Folglich liegen keine Hinweise auf die Bildung von Neoepitopen im Zuge der Maillard-Reaktion vor. Die beobachtete Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung ist daher auf andere Reaktionen, vermutlich mit Produkten der Lipidperoxidation, zurückzuführen. Die Grundvoraussetzung für eine allergische Reaktion ist, dass die verantwortlichen Epitope die gastrointestinale Verdauung überstehen und intakt aufgenommen werden. Durch thermische Behandlung und die daraus resultierende Umfaltung sowie kovalente Modifizierung kann die Verdauungsresistenz erheblich beeinflusst werden. Daher wurde mit Hilfe einer simulierten gastrointestinalen Verdauung der Einfluss der Röstung von Erdnüssen sowie der Glykierung von Ara h 1 und Ara h 2 auf die Verdaubarkeit der Allergene untersucht. Diese orientierenden Verdauungsstudien gaben Hinweise auf eine erhöhte Verdauungsresistenz der Proteinaggregate in gerösteten Erdnüssen. Durch Glykierung der Allergene Ara h 1 und Ara h 2 wurde hingegen keine Veränderung der Verdaubarkeit erreicht. Für die hohe Proteolyseresistenz der Proteine in gerösteten Erdnüssen sind offenbar wiederum Reaktionen mit peroxidierten Erdnusslipiden verantwortlich.

Chez l'Homme, le vieillissement de la rétine peut aboutir à des pathologies telles que la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) ou la rétinopathie diabétique (RD). Il semble qu'une alimentation riche en acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC), notamment en oméga-3 comme l'EPA et le DHA, soit potentiellement protecteur vis-à-vis du développement de la DMLA et de l'insulinorésistance (IR), principal facteur de risque de la RD. Dans ce contexte, nous avons tenter d'évalué 1- l'impact de facteurs endogènes et environnementaux générateurs de stress oxydatif, de produits terminaux de glycation (PTG) ou d'insulinorésistance sur la fonction et le vieillissement de la rétine, et 2- l'adaptation de la rétine à un régime riche en AGPI-LC oméga-3 dans modèle murin de vieillissement de la rétine humaine, la souris ApoB100,LDLR-/-.Les animaux soumis à un stress oxydatif et à des PTG présentent une altération de la fonction rétinienne associée à une accumulation de cellules microgliales et/ou macrophages dans la rétine externe. L'IR induit une modulation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides, l'inflammation et dans la synthèse de facteurs nucléaires. Une alimentation riche en AGPI-LC oméga-3 induit une amélioration de l'incorporation d'acides gras oméga-3 dans la rétine et la modulation du gène codant le récepteur aux LDL dans la rétine neurosensorielle.En conclusion, nos travaux montrent une adaptation de la rétine d'une part à des conditions propices au vieillissement de la rétine et l'insulinorésistance, et d'autre part à un régime alimentaire riche en acides gras oméga-3 et pauvre en oméga-6, reconnu comme protecteur du vieillissement de la rétine

Human thyroid cancer is the most commonly occurring cancer of the endocrine gland having good survival rate, but some patients show recurrence with an invasive phenotype and treatment failures. The mechanisms behind this invasive phenotype are not well understood in TC. Previously our group has identified a pro-migratory role of relaxin-like peptides in thyroid cancer that is mediated by S100A4. We have observed in human TC cells that extracellular S100A4 induces migration and activates ERK1/2, JNK/SAPK and NFkB signaling pathways. Employing immunohistochemistry and immunofluorescence we have identified the expression of RAGE in human TC primary cells, cell lines, and in tumor tissues but not in normal thyroid tissues. We showed that S100A4 binds to RAGE in TC cells and that RAGE and its cytoplasmic partner Dia-1 mediate the S100A4-induced migration of TC cells. This study identified a crucial role of RAGE in TC cell migration induced by S100A4.

Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of mortality and morbidity in the world. The risk of CVDs increases with age, tobacco, diabetes, dyslipidemia, obesity and kidney dysfunction. The incidence and prevalence of CVDs demands the development of efficient strategies for prevention and treatment, as well as new biomarkers. The receptor for advanced glycation end-products (RAGE) is implicated in several metabolic and inflammatory disorders. RAGE activation by its multiple ligands, i.e. advanced glycation end-products (AGEs), S100 proteins and amphoterin (HMGB1) induces pro-inflammatory events upon RAGE engagement. The soluble circulating form of RAGE (sRAGE) has been proposed as a biomarker of vascular risk, disease severity and outcome, especially in individuals with diabetes or kidney dysfunction. However, data is controversial since positive and negative correlations are observed for a same disease. Nevertheless, the importance of the ligand-RAGE axis in pathological processes and the wide range of RAGE-binding molecules (from pro-inflammatory proteins to autoantibodies), appreciates the present study.In this thesis, we first investigated effects of RAGE ligands and the recently described anti-sRAGE autoantibodies on sRAGE quantification. We hypothesized that interactions between sRAGE and these molecules could impair sRAGE quantification. On the second part, we evaluated the value of sRAGE and anti-sRAGE autoantibodies as biomarkers of metabolic improvement after bariatric surgery for morbid obesity. Patients were selected from the established cohort ABOS (Lille). RAGE ligands (Nε-carboxymethyllysine, S100A6, S100A12, S100B, HMGB1 and amyloid beta peptide) bind sRAGE at different sites and could potentially impair its quantification through epitope masking. We tested this hypothesis by incubating these ligands, from physiological to pathological concentrations, with recombinant sRAGE and serum to evaluate their effects on sRAGE quantification. Anti-sRAGE autoantibodies were identified and further purified and their effects on sRAGE measurement evaluated. The presence of ligands or anti-sRAGE autoantibodies did not impair recombinant or serum sRAGE quantification. Obesity is a condition of dyslipidemia, glycemia deregulation and inflammation where RAGE is believed to play an important role. We aimed then to investigate the levels of sRAGE and its autoantibodies according to metabolic improvement in obese subjects submitted to weight loss surgery. Patients were highly selected from a well established cohort (morbidly obese patients eligible for gastric bypass, ABOS, Lille). Patients under statins treatment, with kidney dysfunction or hypertension, factors that could affect sRAGE levels, were excluded. In obese patients, significant higher levels of sRAGE and anti-sRAGE autoantibodies were observed before weight-loss surgery. In parallel to body-mass Index, both sRAGE and anti-sRAGE titers were significantly decreased one year after surgery.We demonstrate that the variations of sRAGE levels among the literature are, most likely, not due to an interaction between RAGE ligands and sRAGE. Other hypothesis like the regulation of sRAGE formation and clearance are further discussed. We have, for the first time demonstrated the presence of anti-sRAGE autoantibodies in obese subjects and that their levels decrease after bariatric surgery. Although our data suggest that morbid obese status leads to an autoimmune reactions against sRAGE. Together, our findings argue against sRAGE as a good biomarker but suggest that anti-sRAGE autoantibodies may have a potential implication to evaluate metabolic risk and autoimmunity associated to RAGE

Human thyroid cancer is the most commonly occurring cancer of the endocrine gland having good survival rate, but some patients show recurrence with an invasive phenotype and treatment failures. The mechanisms behind this invasive phenotype are not well understood in TC. Previously our group has identified a pro-migratory role of relaxin-like peptides in thyroid cancer that is mediated by S100A4. We have observed in human TC cells that extracellular S100A4 induces migration and activates ERK1/2, JNK/SAPK and NFkB signaling pathways. Employing immunohistochemistry and immunofluorescence we have identified the expression of RAGE in human TC primary cells, cell lines, and in tumor tissues but not in normal thyroid tissues. We showed that S100A4 binds to RAGE in TC cells and that RAGE and its cytoplasmic partner Dia-1 mediate the S100A4-induced migration of TC cells. This study identified a crucial role of RAGE in TC cell migration induced by S100A4.

Proteingebundene Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) und Crosslink-Aminosäuren (CLAS) werden mit der Nahrung täglich in nicht unerheblichen Mengen aufgenommen. In Humanstudien wurde gezeigt, dass einzelne dieser Produkte resorbiert werden. Die Beteiligung einzelner MRP und CLAS an pathophysiologischen Prozessen wird diskutiert. Im ersten Teil der Arbeit wurden MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, CML, CEL, Pyrralin, MG-H1, Pentosidin) und CLAS (LAL, Glutamyllysin) in Casein angereichert und die Caseine einer simulierten gastrointestinalen Verdauung unterzogen. Mit der posttranslationalen Modifizierung ging eine Verschlechterung der Verdaubarkeit einher. Dies zeigte sich daran, dass während der Verdauung bei zunehmendem Modifizierungsgrad Peptide mit Molmassen > 1000 Da schlechter abgebaut wurden und somit die Bildung von Peptiden < 1000 Da abnahm. Die Verschlechterung der Verdaubarkeit ließ sich vor allem auf die Quervernetzung der Caseine, weniger auf die Modifizierung von Aminosäuren zurückführen. Zudem wurde die Freisetzbarkeit einzelner Aminosäuren durch posttranslationale Modifizierung gesenkt. Dies konnte praktisch ausschließlich auf die Modifizierung von Lysinresten, nicht auf die Quervernetzung, zurückgeführt werden. Vor allem Aminosäuren, die im Casein in der Nähe von Lysinresten überrepräsentiert sind, wurden mit zunehmender Modifizierung schlechter freigesetzt. Die modifizierten Aminosäuren selbst wiesen ein sehr differenziertes Freisetzungsmuster auf. Amadori-Produkte wurden sehr gut freigesetzt, quervernetzende Aminosäuren dagegen nur zu einem geringen Anteil. Als Referenzsubstanzen für chromatographische Messungen und als Testsubstanzen für Inhibitions- und Transportexperimente wurden im zweiten Teil der Arbeit insgesamt 19 freie MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, Tagatoselysin, Ribuloselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, 3-DG-H, PIO, Argpyrimidin, Pentosidin) und CLAS (Lysinoalanin, π- und τ-Histidinoalanin, Ornithinoalanin, Lanthionin) in hohen Ausbeuten synthetisiert und charakterisiert. Zwölf der Produkte (Fructoselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, Argpyrimidin, Lysinoalanin, π- und τ-Histidino¬alanin und N-ε-(γ-Glutamyl)-Lysin) wurden erstmals auch Dipeptidderivate (Ala-Xaa bzw. Xaa-Ala) synthetisiert und charakterisiert. Mithilfe von Kompetitionsexperimenten an Caco-2-Zellen konnte gezeigt werden, dass freie MRP und CLAS die Aufnahme von L-[3H]Lysin kaum hemmten und somit nicht mit Transportsystemen für basische Aminosäuren wechselwirken können. Der überwiegende Teil der dipeptidgebundenen Derivate hemmte jedoch in konzentrationsabhängiger Weise den Transport von [14C]Gly-Sar . Diese Dipeptide stellen somit z.T. hoch affine Inhibitoren des Peptidtransporters dar. Die Affinität zum Transporter ist stark sequenzabhängig. Caco-2-Zellen, die als Monolayer wachsen, wurden auf porösen Polycarbonatmembranen kultiviert und zu Transportstudien eingesetzt. Keines der freien MRP und CLAS wurde aktiv über den Monolayer transportiert. Wurden die Derivate dagegen dipeptidgebunden eingesetzt, stieg, außer bei fructosylierten Peptiden, der transepitheliale Transport stark an. Allerdings wurden die Peptide meist nicht intakt transportiert, sondern intrazellulär gespalten und die freien Aminosäuren basolateral abgegeben. Zum Teil reicherten sich die modifizierten Aminosäuren, besonders die hydrophilen, intrazellulär an. Hydrophobe Aminosäuren (Pyrralin, Formylin, Maltosin, Argpyrimidin) konnten die Zelle dagegen schnell verlassen. Diese Aminosäuren sollten daher auch in vivo effektiv resorbiert werden. In Kompetitionsexperimenten an OK-Zellen zeigte sich, dass modifizierte Aminosäuren auch an Nierenzellen nicht mit Transportsystemen für Lysin wechselwirken. Keine der freien Aminosäuren wurde aktiv über den OK-Zellmonolayer transportiert. Somit ist nicht von einer renalen Reabsorption der untersuchten MRP und CLAS auszugehen.

Το Hypericum perforatum (Υπερικό το διάτρητο) είναι ένα από τα πιο παλιά φαρμακευτικά φυτά που χρησιμοποιούταν στη λαϊκή θεραπευτική πολλών διαφορετικών πολιτισμών, ως επουλωτικό, αντιφλεγμονώδες και αντικαταθλιπτικό. Αλκοολικά εκχυλίσματα αυτού συνιστούν σκευάσματα που κυκλοφορούν ως συμπληρώματα ή φάρμακα για διαταραχές της ήπιας και μέτριας κατάθλιψης. Φλαβονοειδή, φαινολικά οξέα, ναφθοδιανθρόνες και φλωρογλουκινόλες είναι οι κύριες ομάδες συστατικών που βρίσκονται σε μεγάλη περιεκτικότητα στα φυτικά εκχυλίσματα. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση κύριων βιοδραστικών συστατικών του Hypericum perforatum με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων (Ηigh Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector, HPLC-DAD). Μετά από πιλοτικά πειράματα σε στήλη ανάστροφης φάσης Luna C-18, ο διαχωρισμός των συστατικών του μεθανολικού εκχυλίσματος έγινε με χρήση συστήματος βαθμιδωτής έκλουσης με τρεις διαλύτες: ρυθμιστικό διάλυμα 10 mM οξικού αμμωνίου, pH=4,5/ ακετονιτρίλιο/ μεθανόλη και ροή 1.0 mL/min. Η μέθοδος πιστοποιήθηκε με πρότυπα χλωρογενικού οξέος, ρουτίνης, υπεροζίτη, κερσετίνης, ισοκερσετίνης και υπερικίνης και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου είναι εντός των αποδεκτών ορίων που θεσπίζει ο ΕΜΕΑ. Η αναπτυχθείσα μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί για τον ποιοτικό και ποσοτικό έλεγχο εκχυλισμάτων Hypericum, όπως και για τον χαρακτηρισμό της σύστασης διαφόρων taxa Hypericum τα οποία δεν έχουν μελετηθεί. Πρόσφατη μελέτη αναφέρθηκε στις νευροπροστατευτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος σε διαβητικά πειραματόζωα και αυτό αποτέλεσε το έναυσμα διερεύνησης της επίδρασης αυτού στη μη ενζυμική γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών, που συμβαίνει σε συνθήκες υπεργλυκαιμίας στους ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη. Η πλεονάζουσα γλυκόζη αντιδρά μη ενζυμικά με πλήθος πρωτεϊνικών μορίων, επηρεάζοντας τη δομή και τη λειτουργία αυτών. Σε συνθήκες εμμένουσας υπεργλυκαιμίας και διάρκειας εβδομάδων η αντίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό φθοριζουσών τελικών προϊόντων, μη-αναστρέψιμων (Advanced Glycation End-products, AGEs), τα οποία συνεισφέρουν στην ανάπτυξη των αγγειακών διαβητικών επιπλοκών. Ο έλεγχος της έντασης φθορισμού έγινε μετά από επώαση τριών ημερών αλβουμίνης βόειου ορού (10 mg/mL) και ριβόζης (0,5 M) σε όγκο 350 μL, παρουσία ή απουσία του φυτικού εκχυλίσματος και των συστατικών αυτού. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική ανασταλτική δράση του εκχυλίσματος (100 μg/mL) (70%) και των μεμονωμένων συστατικών του (100 μΜ), κύρια δε των φλαβονοειδών. Τα αποτελέσματα αυτά συνεισφέρουν στην επιστημονική αναζήτηση μη τοξικών αναστολέων σχηματισμού AGEs για την αντιμετώπιση των αγγειακών επιπλοκών του διαβήτη. Λέξεις-κλειδιά: Hypericum perforatum, HPLC ανάλυση, Τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs) / Hypericum perforatum (Saint John’s wort) has been used since antiquity in folk medicine as a wound-healing, anti-inflammatory and antidepressant drug. Alcoholic extracts of this plant are the constituents of drug preparations or supplements that are used for mild to moderate depression. Flavonoids, phenolic acids, napthodianthrones and phloroglucinols are the main constituents of high content in herbal extracts. In the present study, a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) analytical method was developed for the quality and quantity control of bioactive components of Hypericum perforatum methanolic extracts. After a great variety of elution gradients on a C-18 Luna column, the natural products were completely separated by a linear gradient of 10mM ammonium acetate (pH=4,5) -acetonitrile-methanol in one run within 60 min and flow 1.0 mL/min. The chromatographic method was validated using commercially available standards of chlorogenic acid, rutin, hyperoside, quercetin, isoquercitrin and hypericin and the quality values were within the acceptable limits of EMEA. The developed method can be applied towards the quality and quantity control of hypericum extracts and the characterization of the composition of Hypericum taxa, which have not been studied. A recent study mentioned the neuroprotective capacity of the extract in diabetic rats and that was the beginning of a research about its effect in non-enzymatic glycosylation of proteins that occurs in diabetic patients, in hyperglycaemia conditions. The redundant glycose react non-enzymatically with a number of proteins, affecting their structure and function. Under sustained hyperglycaemia conditions and in natural aging, further glycation of proteins causes the generation of AGEs (Advanced Glycation End-products).AGEs may fluoresce under ultraviolet light and contribute to the development of diabetic vascular complications. The measurement of fluorescence intensity was realized after a 3-days incubation of bovine serum albumin (10 mg/mL) with ribose (0,5 M) in the presence or absence of herbal extract and its constituents. The final volume of reaction was 350 μL. The results showed significant inhibitory effect of the extract (100 μg/mL) (70%) and its components (100 μΜ), mainly that of flavonoids. The present results contribute to scientific research of non-toxic inhibitors of AGEs formation in order to get faced the diabetic vascular complications.

Chez l’Homme, le vieillissement de la rétine peut aboutir à des pathologies telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) ou la rétinopathie diabétique (RD). Il semble qu’une alimentation riche en acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC), notamment en oméga-3 comme l’EPA et le DHA, soit potentiellement protecteur vis-à-vis du développement de la DMLA et de l’insulinorésistance (IR), principal facteur de risque de la RD. Dans ce contexte, nous avons tenter d’évalué 1- l’impact de facteurs endogènes et environnementaux générateurs de stress oxydatif, de produits terminaux de glycation (PTG) ou d’insulinorésistance sur la fonction et le vieillissement de la rétine, et 2- l’adaptation de la rétine à un régime riche en AGPI-LC oméga-3 dans modèle murin de vieillissement de la rétine humaine, la souris ApoB100,LDLR-/-.Les animaux soumis à un stress oxydatif et à des PTG présentent une altération de la fonction rétinienne associée à une accumulation de cellules microgliales et/ou macrophages dans la rétine externe. L’IR induit une modulation de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides, l’inflammation et dans la synthèse de facteurs nucléaires. Une alimentation riche en AGPI-LC oméga-3 induit une amélioration de l’incorporation d’acides gras oméga-3 dans la rétine et la modulation du gène codant le récepteur aux LDL dans la rétine neurosensorielle.En conclusion, nos travaux montrent une adaptation de la rétine d’une part à des conditions propices au vieillissement de la rétine et l’insulinorésistance, et d’autre part à un régime alimentaire riche en acides gras oméga-3 et pauvre en oméga-6, reconnu comme protecteur du vieillissement de la rétine / With advanced age, aging of the human retina can evolve into pathological forms, age-related macular degeneration (AMD) or diabetic retinopathy (DR). Meanwhile, epidemiological studies suggest that a diet rich in long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) such as EPA and DHA, potentially protects against the development of AMD and insulin resistance, the main risk factor for DR. Within this context, our research objectives were to assess: 1 - the impact of endogen and environmental factors, known to trigger oxidative stress, advanced glycation end-products (AGEs) or insulin resistance, on the function and aging of the retina, and 2 - the response of the retina to a omega-3 LC-PUFA-enriched diet in a murine model of aging of the human retina, the ApoB100,LDLR-/- mouse.The animals exposed to oxidative stress and AGEs showed an alteration of the retinal function associated with an accumulation of microglial cells and/or macrophages in the outer retina. The insulin resistance induced a modulation of the expression of genes coding proteins involved in lipid metabolism, inflammation and nuclear factors. An omega-3 LC-PUFA-enriched diet improved the incorporation of omega-3 LC-PUFA in the retina and modulated the expression of the LDL-receptor gene in the neurosensory retina.In conclusion, our works reported the adaptive response of the retina to environmental and endogenous factors known to promote aging of the retina. It included the impairment of the retinal function, and the modulation of gene expression. Our data also gave a better understanding of the effects of omega-3 LC-PUFA against aging of the retina

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-15T12:45:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Emanuela Paz Rosas Final.pdf: 1301979 bytes, checksum: 812637acf4c6404700fd08c4dbcc4009 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-15T12:45:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Emanuela Paz Rosas Final.pdf: 1301979 bytes, checksum: 812637acf4c6404700fd08c4dbcc4009 (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / CAPEs / Os produtos finais de glicação avançada (AGEs) são compostos heterogêneos gerados a partir da reação não enzimática, irreversível, conhecida como reação de Maillard ou Glicação. Essa reação ocorre entre açúcares redutores e seus metabólitos reativos ou lipídeos oxidados e proteínas ou ácidos nucléicos. Os AGEs são formados endógena (hiperglicemia e estresse oxidativo) e exogenamente (alimentos e fumo), e podem ser acumulados em vários tecidos causando efeitos deletérios em diversas patologias relacionadas a idade e a diabetes. Uma de suas principais ações é gerar estresse oxidativo através do aumento da expressão de mediadores inflamatórios. Os macrófagos são células fundamentais no reconhecimento, degradação e remoção dessas substâncias, além disso, têm papel crucial na produção de espécies reativas de nitrogênio (RNS) na resposta imune, e podem estar envolvidos com variadas patologias. Neste estudo avaliou-se o efeito dos AGEs sobre a produção de óxido nítrico e a viabilidade celular em macrófagos. Macrófagos J774 foram incubados com diferentes concentrações de BSA- AGE (15, 30, 60, 120 ou 240μg/mL) por 24 ou 48 h e em seguida foram expostas (ou não) ao LPS (100ng/ml) por 24h. Para analisar a produção de óxido nítrico e a viabilidade celular utilizaram-se os métodos de Griess e de MTT, respectivamente. As células J774 submetidas ao tratamento com AGE apresentaram alterações nos níveis de NO e na viabilidade celular. Notou-se que os macrófagos quando incubados com AGE nas maiores concentrações (60, 120, 240μg/mL), sem LPS, produziram um aumento significativo na liberação de NO por 24 h. Também foi visto que o tratamento com AGE nas concentrações 120 e 240μg/mL, e com LPS, também elevaram os níveis de NO significativamente. Os resultados mostraram um aumento na produção de NO quando as células foram tratadas com AGE em todas as concentrações (15, 30, 60, 120 e 240μg/mL) por 48 h. A incubação de células J774 com AGE nas concentrações de 240 μg/ml por 24h com LPS, como também as concentrações de 120 e 240 μg/ml por 48h sem LPS, reduziram a viabilidade celular quando comparados com seus respectivos controles. Em conclusão, os AGEs podem causar aumento da produção de NO por macrófagos quando estes são estimulados ou não por LPS, e por consequência conduzir a morte celular. / The advanced glycation end products (AGEs) are heterogenic compounds generated from Maillard reaction or Glycation reaction. It is an irrevesible nonenzymatic reaction involving reductive sugars and reactive metabolites or oxidated lipids, proteins or nucleic acids. AGEs could be originated by endogenous way (hyperglycemia or oxidative stress) and by exogenous way (certain types of food and tobacco). They could be accumulated in several organic tissues causing deleterious effects seen in diabetes and age-related diseases. One of the main AGE effects is the induction and maintenance of stress oxidative through inflammatory mediators increasing expression. In this scenario, macrophages are fundamental cells on the recognition, degradation and clearance of AGEs. They also play an important role on immune response by stimulating reactive nitrogen species production (RNS), which could be involved on the evolution of several diseases. The present study evaluated the AGE effect on the macrophages nitric oxide production as well as the cell viability. J774 macrophages were incubated with different concentrations of BSA- AGE (15μg, 30μg, 60μg, 120μg ou 240μg/mL) by 24 or 48 hours, following a second incubation with or without LPS (100ng/mL) by 24 hours. Nitric oxide production was evaluated by Griess reaction and cell viability by MTT production. Macrophages incubated with AGE presented nitric oxide and cell viability alterations. It was noted that macrophages when incubated with AGE in higher concentrations (60, 120, 240μg/mL) without LPS produced a significant increase in the release of NO for 24 h. It has also been seen that treatment with AGE concentrations 120 and 240μg/mL and stimulation by LPS have also increased NO levels significantly. The results showed an increase in NO production when cells were treated with AGE at all concentrations (15, 30, 60, 120 and 240μg/ mL) for 48 h. The incubation J774 cells with AGE at concentrations of 240 μg/ mL for 24 hours with LPS, as well as the concentrations of 120 and 240 μg/ mL for 48h without LPS, reduced the cell viability compared to their respective controls. In conclusion, AGEs can cause increased production of NO by macrophages when these are stimulated or not with LPS, leading to cell death.