Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2006. / Härtill 5 uppsatser.

Articular cartilage plays a vital role in load-bearing joints, providing an almost frictionless surface to articulating bones. However, the avascular nature and low cell density of the tissue means that following injury, there is limited potential for regeneration and repair. With the ageing population, the prevalence and economic burden associated with osteoarthritis (OA) is increasing rapidly, but as of yet there are no fully effective ways to treat the condition. Research into novel therapies has therefore become a popular avenue of investigation, and human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) have been highlighted as particularly promising targets. However, current, methods for inducing the chondrogenic differentiation of hMSCs, which typically employ the use of transforming growth factor beta 1 or 3 (TGFβ1/3), result in the production of hypertrophic rather than hyaline tissue, hampering translational progress. Growth differentiation factor 5 (GDF5) belongs to the TGFβ superfamily of proteins and is vital for skeletal formation, however its use in cartilage tissue engineering (TE) strategies has been somewhat neglected. Here we demonstrate that GDF5 significantly increases aggrecan gene expression (a marker of articular cartilage), without affecting collagen type X expression (a marker of chondrocyte hypertrophy), in chondrocyte pellet cultures derived from hMSCs, making it a promising target for the formation of permanent articular cartilage. The therapeutic application of growth factors is, at present, limited due to their expense, susceptibility to proteolytic degradation, and rapid clearance, leading to large quantities being required to get anywhere near the desired outcome. The highly sulfated glycosaminoglycan (GAG), heparin, is already extensively used in the clinic as an anticoagulant, and is also able to bind and potentiate the activity of a wide range of growth factors. As such, researchers are now using it to enhance stem cell expansion/ differentiation protocols, as well as to improve the delivery/ activity of growth factors in TE strategies. Here, we identify GDF5 as a novel heparin/heparan sulfate (HS)-binding protein, and show that endogenous HS proteoglycans (HSPGs) are vital for localizing GDF5 to the cell surface, but are not required for its signalling activity. Importantly, we report that clinically relevant doses of heparin (≥ 10 nM), but not equivalent concentrations of HS, inhibit GDF5’s biological activity, in both hMSC-derived chondrocyte pellet cultures, and in the skeletal cell line ATDC5. We demonstrate that these inhibitory effects are due to heparin (but not HS) inhibiting both GDF5 binding to endogenous HSPGs and GDF5-induced induction of Smad 1/5/8 signalling. This study may therefore explain the variable (and disappointing) results seen with heparin-loaded biomaterials for skeletal TE, and the adverse skeletal effects, such as osteoporosis, that have been reported in the clinic following long-term heparin treatment. Together, our results caution the use of heparin in the clinic and in TE applications, and prompt the transition to using more specific GAGs (e.g. HS derivatives or synthetics), with better-defined structures and fewer off-target effects, if optimal therapy is to be achieved. In the case of GDF5, we have used a variety of developed techniques to begin uncovering important structural and functional information regarding the HS-GDF5 interaction, which are hoped to ultimately pave the way towards achieving this aim. Although further analysis is necessary, our data indicate that relatively long HS sequences are required for binding, and that both ionic and non-ionic interactions play a role in the interaction. In addition we suggest that low- rather than high-affinity HS variants may be key to potentiating the activity of this growth factor.

Introdução: As mucopolissacaridoses (MPS) são um conjunto de sete doenças genéticas incluídas dentro das Doenças Lisossômicas que por sua vez fazem parte dos Erros Inatos do Metabolismo (EIM). São doenças multissistêmicas que afetam todo o organismo, com variações conforme o tipo de MPS, sendo que algumas delas possuem tratamento específico. Quase todas comprometem, em graus variados, o sistema osteoarticular, e praticamente todos os pacientes apresentam excreção alterada de glicosaminoglicanos (GAGs) na urina. As MPS são doenças raras que podem ser subdiagnosticadas em função do pouco conhecimento dos profissionais de saúde sobre elas, do pouco acesso aos métodos de triagem e diagnóstico e da sua ampla heterogeneidade clínica, podendo ocorrer formas atenuadas nas quais pode ser difícil de levantar a suspeita clínica de MPS. Material e métodos: o presente estudo foi realizado no período de março de 2012 à janeiro de 2014, tendo incluído 55 pacientes atendidos em serviços de Reumatologia e/ou Ortopedia de Porto Alegre, RS, Brasil e que, apresentavam como principal queixa, manifestações articulares sem etiologia definida. Esses pacientes foram inicialmente investigados através da avaliação quantitativa e qualitativa dos GAGs urinários. Resultados e Discussão: entre os 55 casos investigados, em 1 paciente de 15 anos de idade foi observada na análise dos GAGs urinários excreção aumentada e alteração do padrão qualitativo, sendo posteriormente confirmado o diagnóstico de uma forma atenuada de MPS II, a qual não havia sido suspeitada anteriormente. Conclusão: embora a proporção de pacientes identificados com MPS na amostra estudada tenha sido pequena (1/55), este estudo mostra que ocorre subdiagnóstico dessas doenças e que a triagem sistemática pode contribuir para a identificação de pacientes, os quais podem se beneficiar das medidas de tratamento disponíveis. / Introduction: Mucopolysaccharidoses (MPS) are a set of 7genetic diseases including Lysosomal Diseases , which in turn are part of Inborn Errors of Metabolism (IEM). The MPS are multisystemic conditions that affect the entire body, with variations depending on the type, some of which have specific treatment. Almost all affect, in variable degrees, the osteo-articular system, and virtually all patients have abnormal excretion of glycosaminoglycans (GAGs) in urine. The MPS are rare diseases that are being underdiagnosed due to the little knowledge of health professionals about them, the poor access to screening and diagnostic methods and their extensive clinical heterogeneity. Also, attenuated forms may occur in which it may be difficult to raise the clinical suspicion of MPS. Material and Methods: The present study was conducted from March 2012 to January 2014 and included 55 patients from Rheumatology and/or Orthopedics services of Porto Alegre, RS, Brazil and which had, as main complaint, articular manifestations without defined etiology. These patients were screened by quantitative and qualitative assessment of urinary GAGs. Results and Discussion: Among the 55 cases investigated, in 1 patient 15 years of age was observed in the analysis of urinary GAG excretion and increased change in qualitative standard and subsequently confirmed the diagnosis of an attenuated form of MPS II, which had not previously been suspected. Conclusion: Although the proportion of patients with MPS identified in the study sample was small (1/55), this study shows that occurs underdiagnosis of these diseases and that systematic screening can help to identify patients who may benefit from measures treatment available.

INTRODUÇÃO: As mucopolissacaridoses (MPS) são doenças de depósito lisossômico, caracterizadas pela deficiência de enzimas lisossômicas envolvidas na degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs). O acúmulo anormal dessas macromoléculas no interior dos lisossomos provoca alterações estruturais e funcionais, de caráter multissistêmico e progressivo. Os GAGs acumulados também são excretados na urina, onde podem ser identificados através de diversos métodos bioquímicos. Estas doenças estão presentes em todos os grupos étnicos e a incidência conjunta das MPS, é estimada entre 1:10.000 a 1:25.000 nascidos vivos. (Baehner, 2005). A causa das MPS é a deficiência de uma enzima específica na rota de degradação dos GAGs. As MPS são classificadas segundo o tipo de substrato (GAGs) acumulado e a enzima específica deficiente. Na síndrome de Morquio A, ou mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), o substrato acumulado é o queratan sulfato e a enzima deficiente é a N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. (GALNS). Os pacientes afetados por MPS IVA apresentam baixa estatura, disostose múltipla, opacidade de córnea, entre outros sinais e sintomas. O desenvolvimento psicomotor e mental é normal. O método de detecção inicial das MPS baseia-se na identificação dos GAGs, que são excretados em excesso na urina destes pacientes. A presença de queratan sulfato na eletroforese ou a detecção de níveis aumentados na dosagem quantitativa, direciona a investigação laboratorial para a MPS IV. O diagnóstico definitivo se estabelece através da medida da atividade enzimática em leucócitos ou fibroblastos, onde se constata a deficiência enzimática. OBJETIVOS: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um novo método, mais simples, rápido e acessível, para o diagnóstico bioquímico de mucopolissacaridose tipo IVA, utilizando amostras de sangue impregnadas em papel filtro (SIPF). MATERIAIS E MÉTODOS: Amostras de SIPF e leucócitos de 35 pacientes de ambos os sexos, com idade entre 3 e 47 anos, com diagnóstico previamente estabelecido de MPS IVA, pelo método convencional, em leucócitos e /ou fibroblastos, foram analisadas. Para o estabelecimento dos valores de referência, foram estudadas amostras de leucócitos e de SIPF de 54 indivíduos saudáveis (18-50 anos), de ambos os sexos. Após assinatura do termo de consentimento, amostras de sangue periférico de pacientes e controles, foram coletadas, para a obtenção de leucócitos e sangue impregnado em papel filtro.(SIPF). Os ensaios enzimáticos foram realizados nas amostras de leucócitos e SIPF, simultaneamente, para comparar os resultados. RESULTADOS: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de todos os pacientes apresentando MPS IVA, confirmaram a deficiência da atividade enzimática em ambos materiais (leucócitos e SIPF) com uma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. (Mann-Witney U test, p< 0,001). Neste estudo, a medida de GALNS em amostras de SIPF permitiu a identificação dos pacientes com MPS IVA, com sensibilidade de 100 %. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de SIPF indicaram que amostras coletadas para a medida da atividade de GALNS devem ser mantidas a 4ºC sempre que possível, sendo estáveis nesta temperatura por mais de 30 dias. CONCLUSÕES: Nas condições utilizadas, amostras de SIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA. O método que utiliza amostras de SIPF é mais acessível e rápido, simplificando a etapa de coleta e transporte, podendo ser utilizado para detectar pacientes afetados, especialmente em áreas de difícil acesso para a coleta e transporte de amostras líquidas. / INTRODUCTION: Mucopolysaccharidosis (MPS) are lysosomal deposit diseases characterized by lysosomal enzymes deficiency involved in the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). The abnormal accumulation of these macromolecules inside the lysosomes provokes structural and functional alterations multi-systemically and progressively. The accumulated GAGs are also excreted in the urine, where they may be identified through many different biochemical methods. These diseases occur among all ethnical groups and the combined incidence of MPS is estimated at 1:10.000 to 1:25.000 live births. (Baehner, 2005). The MPS’ cause is the deficiency of a specific enzyme in the GAGs degradation route. The MPS are classified according to a type of substrate accumulated (GAGs) and the deficiency of a specific enzyme. In Morquio syndrome A or Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA), the accumulated substrate is the keratan sulfate and the deficient enzyme is the N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS). The patients affected by MPS IVA present short stature, dysostosis multiplex, corneal opacity, among others signs and symptoms. The cognitive and mental developments are normal. The MPS initial detection method is based on the identification of the GAGs which are excreted in the patients’ urine. The presence of the keratan sulphate in the electrophoresis or the detection of the increased levels in the quantitative dosage directs the laboratory investigation to MPS IV. The definitive diagnosis is established through measuring the enzymatic activity in leukocytes or fibroblasts, in which the enzymatic deficiency is proved. OBJECTIVE: This study’s main purpose is to offer an original, simpler, faster and more accessible method for biochemical diagnosis of Mucopolysaccharidosis type IVA using dried blood samples (DBS). MATERIALS AND METHODS: DBS and leukocytes from 35 patients from both sexes between 3 and 47 years of age with previously established diagnosis of MPS IVA through the conventional method in leukocytes and/or fibroblasts were analyzed. In order to establish reference values DBS and leukocytes samples from 54 healthy people (18-50 years of age) from both sexes were studied. After signing a paper consent form, peripheral blood samples from patients and controls were collected for obtaining leukocytes and dried blood samples (DBS). To validate the method, we made a simultaneous GALNS assay in leukocytes and DBS. RESULTS: The results obtained in the enzymatic assays from all patients presenting MPS IVA confirmed the deficiency of enzymatic activity in both materials (leukocytes and DBS) with a significant statistical difference in relation to the control group. (Mann-Witney U tes, p< 0,001). In this study, the quantity of GALNS in DBS allowed the identification of patients with MPS IVA with sensibility of 100%. The stability tests indicate that DBS samples collected for measuring the activity of GALNS must be kept at 4ºC whenever possible, being stable in this temperature for more than 30 days. CONCLUSION: In the used conditions, DBS were adequate for a safe identification of patients with MPS type IVA. The method which utilizes DBS is cheaper and faster, what simplifies the collection and transportation stage and can be used to detect affected patients especially in difficult access areas for the collection and transportation of liquid samples.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00275a.pdf: 1984852 bytes, checksum: b59b9eec047c1dde85258ab2627be073 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00275a.pdf: 1984852 bytes, checksum: b59b9eec047c1dde85258ab2627be073 (MD5) Publico-00275b.pdf: 1888267 bytes, checksum: ec53e005babae0faeb59e5531e84717a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 3 Publico-00275a.pdf: 1984852 bytes, checksum: b59b9eec047c1dde85258ab2627be073 (MD5) Publico-00275b.pdf: 1888267 bytes, checksum: ec53e005babae0faeb59e5531e84717a (MD5) Publico-00275c.pdf: 1700699 bytes, checksum: 0b64f1d6737aec3687de494ae30df256 (MD5) / O processo de reparação tecidual é um complexo de reações entre células e mediadores bioquímicos que são desencadeados a partir de uma lesão. Neste estudo avaliamos a ação do peptídeo 4 obtido a partir da sequência de aminoácidos do Lopap (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) em cultura de fibroblastos para se avaliar a expressão de moléculas de matriz extracelular e receptores de membrana de interleucina-8 e em modelo experimental de lesão cutânea em ratos para se analisar o efeito da molécula em estudo no processo de reparação tecidual. Foram utilizados 40 ratos Wistar machos de 6 a 8 semanas, randomizados em 5 grupos experimentais. Após a anestesia, os ratos foram submetidos a procedimento cirúrgico, onde oito secções circulares de pele de 6 mm de diâmetro foram circunscritas na região dorsal e tratadas com solução salina ou com o peptídeo 4. Após diferentes períodos (3, 7, 14 e 21 dias) realizaram-se análises para se avaliar o processo de reparação tecidual entre os grupos. Concluímos que o peptídeo 4 é capaz de estimular fibroblastos em cultura, além de promover o aceleramento do processo de reparação tecidual em modelo in vivo, com maior deposição de colágeno, glicosaminoglicanos e melhor reorganização tecidual. / The process of tissue repair is a complex of reactions between cells and biochemical mediators that are triggered from an injury. This study evaluated the effect of peptide 4 derived from the amino acid sequence of Lopap (Lonomia obliqua prothrombin activator protease) in culture of fibroblasts to evaluate the expression of molecules of extracellular matrix and the membrane receptors of interleukin-8 and in experimental model of skin lesion in rats to examine the effect of the molecule in the process of tissue repair. We used 40 male Wistar rats with 6 to 8 weeks, randomized to 5 experimental groups. After anesthesia, the rats were submitted to surgery, where eight circular full-thickness of skin from 6 mm of diameter were surrounded in the back and treated with saline or with peptide 4. After different periods (days 3, 7, 14 and 21 days after wounding) were carried out tests to evaluate the process of tissue repair between the groups. We conclude that peptide 4 is able to stimulate fibroblasts in culture and promote the acceleration of the process of tissue repair in vivo model with greater deposition of collagen, glycosaminoglycans and better tissue reorganization. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Glicosaminoglicanos (GAG) no urotélio e na urina possuem um efeito protetor contra desordens tais com urolitíase e cistite intersticial. Adicionalmente, foi demonstrado que hormônios sexuais femininos podem modular a excreção urinária de GAG (Maroclo M.V. et al. J Urol. 2005;173:1789-92). O presente estudo investigou se os anticoncepcionais hormonais orais combinados (AHOC) influenciam na excreção urinária de GAG. Amostras de urina foram doadas por mulheres jovens que utilizavam anticoncepcionais orais regularmente: EE + D (0,030 mg etinilestradiol + 3,0 mg drosperinona), n=9; EE + C (0,035 mg etinilestradiol + 2,0 mg acetato de ciproterona), n=9; e EE + G (0,020 mg etinilestradiol + 0,075 mg gestodeno), n=7. Controles foram 10 mulheres da mesma faixa etária não usuárias de AHOC. Valores de GAG urinário total das primeira e segunda metades do ciclo menstrual foram expressos como &#956;g ácido hexurônico por mg de creatinina urinária. A proporção de GAG sulfatado foi determinada pela eletroforese em gel de agarose. Em contraste com o grupo controle, a excreção de GAG total na primeira e segunda metades do ciclo menstrual foi bastante similar nos grupos usuários de AHOC. Valores de excreção em todo o ciclo foram maior no grupo usuário de AHOC (p < 0,01), particularmente para o grupo usuário de EE + C, no qual os valores foram o dobro dos valores do controle (p < 0,005). Comparados com o controle, os 3 grupos usuários de AHOC produziram diferenças marcantes na composição urinária de GAG sulfatado, com diminuição de aproximadamente 50% no HS (p < 0,02) e DS (p < 0,02), e um aumento próximo de 100% no CS (p < 0,004). O padrão de excreção urinário de GAG está claramente alterado em mulheres que ingerem os AHOC estudados. Sendo assim, esta mudança na excreção constitui um efeito benéfico adicional dos AHOC, pois ela aumenta o potencial efeito protetor dos GAG contra desordens do trato urinário. / Glycosaminoglycans (GAG) on the urothelium and in the urine have protective effects against disorders such as urolithiasis and interstitial cystitis. Additionally, we have shown that female sex hormones may modulate urinary GAG excretion (Maroclo MV et al. J Urol 2005;173:1789-92). Here we investigated whether oral hormonal contraceptives (OC) affect urinary GAG excretion. Urine specimens were obtained from young women regularly taking the following OC: EE + D (0.030 mg ethinyl estradiol + 3.0 mg drospirenone), n=9; EE + C (0.035 mg ethinyl estradiol + 2.0 mg cyproterone acetate), n=9; and EE + G (0.020 mg ethinyl estradiol + 0.075 mg gestodene), n=7. Controls were from ten age-matched women not taking OC. Total urinary GAG from the first and second halves of the menstrual cycle was assayed as g hexuronic acid per mg urinary creatinine. Content of sulfated GAG species was determined by agarose gel electrophoresis. In contrast to controls, excretion of total GAG in the first and second halves of the menstrual cycle was quite similar in the OC groups. Excretion values for the whole cycle were higher in the OC groups (p < 0.01), especially for EE + C, in which the values were twice those from controls (p < 0.005). Compared with controls, the three OC produced marked changes in the composition of urinary sulfated GAG, with decreases of ~50% in HS (p < 0.02) and DS (p < 0.02), and a ~100% increase in CS (p < 0.004). The pattern of urinary GAG excretion is clearly changed in women taking commonly used OC. However, this altered excretion should constitute an additional beneficial effect of OC, as it enhances the protective effects of GAG against urinary tract disorders.

INTRODUÇÃO: As mucopolissacaridoses (MPS) são doenças de depósito lisossômico, caracterizadas pela deficiência de enzimas lisossômicas envolvidas na degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs). O acúmulo anormal dessas macromoléculas no interior dos lisossomos provoca alterações estruturais e funcionais, de caráter multissistêmico e progressivo. Os GAGs acumulados também são excretados na urina, onde podem ser identificados através de diversos métodos bioquímicos. Estas doenças estão presentes em todos os grupos étnicos e a incidência conjunta das MPS, é estimada entre 1:10.000 a 1:25.000 nascidos vivos. (Baehner, 2005). A causa das MPS é a deficiência de uma enzima específica na rota de degradação dos GAGs. As MPS são classificadas segundo o tipo de substrato (GAGs) acumulado e a enzima específica deficiente. Na síndrome de Morquio A, ou mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), o substrato acumulado é o queratan sulfato e a enzima deficiente é a N-acetilgalactosamina-6-sulfatase. (GALNS). Os pacientes afetados por MPS IVA apresentam baixa estatura, disostose múltipla, opacidade de córnea, entre outros sinais e sintomas. O desenvolvimento psicomotor e mental é normal. O método de detecção inicial das MPS baseia-se na identificação dos GAGs, que são excretados em excesso na urina destes pacientes. A presença de queratan sulfato na eletroforese ou a detecção de níveis aumentados na dosagem quantitativa, direciona a investigação laboratorial para a MPS IV. O diagnóstico definitivo se estabelece através da medida da atividade enzimática em leucócitos ou fibroblastos, onde se constata a deficiência enzimática. OBJETIVOS: Este estudo teve como objetivo principal, tornar disponível um novo método, mais simples, rápido e acessível, para o diagnóstico bioquímico de mucopolissacaridose tipo IVA, utilizando amostras de sangue impregnadas em papel filtro (SIPF). MATERIAIS E MÉTODOS: Amostras de SIPF e leucócitos de 35 pacientes de ambos os sexos, com idade entre 3 e 47 anos, com diagnóstico previamente estabelecido de MPS IVA, pelo método convencional, em leucócitos e /ou fibroblastos, foram analisadas. Para o estabelecimento dos valores de referência, foram estudadas amostras de leucócitos e de SIPF de 54 indivíduos saudáveis (18-50 anos), de ambos os sexos. Após assinatura do termo de consentimento, amostras de sangue periférico de pacientes e controles, foram coletadas, para a obtenção de leucócitos e sangue impregnado em papel filtro.(SIPF). Os ensaios enzimáticos foram realizados nas amostras de leucócitos e SIPF, simultaneamente, para comparar os resultados. RESULTADOS: Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos de todos os pacientes apresentando MPS IVA, confirmaram a deficiência da atividade enzimática em ambos materiais (leucócitos e SIPF) com uma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. (Mann-Witney U test, p< 0,001). Neste estudo, a medida de GALNS em amostras de SIPF permitiu a identificação dos pacientes com MPS IVA, com sensibilidade de 100 %. Os testes de estabilidade realizados nas amostras de SIPF indicaram que amostras coletadas para a medida da atividade de GALNS devem ser mantidas a 4ºC sempre que possível, sendo estáveis nesta temperatura por mais de 30 dias. CONCLUSÕES: Nas condições utilizadas, amostras de SIPF se mostraram adequadas para a identificação segura de pacientes com MPS tipo IVA. O método que utiliza amostras de SIPF é mais acessível e rápido, simplificando a etapa de coleta e transporte, podendo ser utilizado para detectar pacientes afetados, especialmente em áreas de difícil acesso para a coleta e transporte de amostras líquidas. / INTRODUCTION: Mucopolysaccharidosis (MPS) are lysosomal deposit diseases characterized by lysosomal enzymes deficiency involved in the degradation of glycosaminoglycans (GAGs). The abnormal accumulation of these macromolecules inside the lysosomes provokes structural and functional alterations multi-systemically and progressively. The accumulated GAGs are also excreted in the urine, where they may be identified through many different biochemical methods. These diseases occur among all ethnical groups and the combined incidence of MPS is estimated at 1:10.000 to 1:25.000 live births. (Baehner, 2005). The MPS’ cause is the deficiency of a specific enzyme in the GAGs degradation route. The MPS are classified according to a type of substrate accumulated (GAGs) and the deficiency of a specific enzyme. In Morquio syndrome A or Mucopolysaccharidosis type IVA (MPS IVA), the accumulated substrate is the keratan sulfate and the deficient enzyme is the N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS). The patients affected by MPS IVA present short stature, dysostosis multiplex, corneal opacity, among others signs and symptoms. The cognitive and mental developments are normal. The MPS initial detection method is based on the identification of the GAGs which are excreted in the patients’ urine. The presence of the keratan sulphate in the electrophoresis or the detection of the increased levels in the quantitative dosage directs the laboratory investigation to MPS IV. The definitive diagnosis is established through measuring the enzymatic activity in leukocytes or fibroblasts, in which the enzymatic deficiency is proved. OBJECTIVE: This study’s main purpose is to offer an original, simpler, faster and more accessible method for biochemical diagnosis of Mucopolysaccharidosis type IVA using dried blood samples (DBS). MATERIALS AND METHODS: DBS and leukocytes from 35 patients from both sexes between 3 and 47 years of age with previously established diagnosis of MPS IVA through the conventional method in leukocytes and/or fibroblasts were analyzed. In order to establish reference values DBS and leukocytes samples from 54 healthy people (18-50 years of age) from both sexes were studied. After signing a paper consent form, peripheral blood samples from patients and controls were collected for obtaining leukocytes and dried blood samples (DBS). To validate the method, we made a simultaneous GALNS assay in leukocytes and DBS. RESULTS: The results obtained in the enzymatic assays from all patients presenting MPS IVA confirmed the deficiency of enzymatic activity in both materials (leukocytes and DBS) with a significant statistical difference in relation to the control group. (Mann-Witney U tes, p< 0,001). In this study, the quantity of GALNS in DBS allowed the identification of patients with MPS IVA with sensibility of 100%. The stability tests indicate that DBS samples collected for measuring the activity of GALNS must be kept at 4ºC whenever possible, being stable in this temperature for more than 30 days. CONCLUSION: In the used conditions, DBS were adequate for a safe identification of patients with MPS type IVA. The method which utilizes DBS is cheaper and faster, what simplifies the collection and transportation stage and can be used to detect affected patients especially in difficult access areas for the collection and transportation of liquid samples.

Resumo: Paramyxoviridae, é um vírus envelopado com tamanho médio de 120 a 300nm, de simetria helicoidal, que apresenta um genoma de RNA fita simples não segmentado de polaridade negativa. Este genoma codifica 11 proteínas, dentre as quais as glicoproteínas de membrana que são responsáveis pela infectividade do vírus. A proteína F, em associação com a proteína G e SH, é responsável pela fusão da membrana viral à célula que será infectada, ou seja, esta proteína proporciona a entrada e instalação do vírus na célula. Conhecer a forma de interação das proteínas da membrana viral com a célula que será infectada é importante para propor um mecanismo de inibição deste processo de infecção viral. Existem evidências que os glicosaminoglicanos são potenciais inibidores da infecção causada por vários vírus. A hipótese é de que este processo de inibição ocorra devido à ligação dos glicosaminoglicanos às proteínas da membrana viral, mais especificamente na proteína G, que apresenta um domínio de ligação para heparina, impedindo desta forma, que o vírus se ligue na célula hospedeira e que inicie o processo de infecção. O objetivo deste trabalho foi verificar a atuação de glicosaminoglicanos como potenciais inibidores da infecção viral. Esta análise foi realizada por meio de experimento de cultivo de células Hep2 na presença dos glicosaminoglicanos heparina e dextrana sulfatada que foram inoculadas com o vírus sincicial respiratório do tipo A (RSVA) e analisados por meio das técnicas de PCR e Imunofluorescência Indireta. Os resultados mostraram que a heparina e a dextrana sulfatada apresentam efeito inibitório da infecção viral em cultivo de células Hep2. / Abstract: The respiratory sincicial virus (RSV) is part of Pneumovirus genus of the Paramyxoviridae family, is an enveloped virus with average size of 120 to 300nm, helical symmetry, that presents a genome consisting of a single strand, no segmented, RNA negative. This genome codifies for 11 proteins including the membrane glycoproteins which are responsible for the infectivity of the virus. Protein F in association with protein G and SH is responsible for the fusion of the viral membrane with the cell that will be infected, that is, this protein provides the entrance and the virus to settle in the cell. To know the form of interaction of viral membrane proteins with the cell that will be infected is important to propose a mechanism to inhibit of this process of viral infection. Evidences exist that the glycosaminoglycans are potential inhibitors of the infection caused by some viruses. The hypothesis is that this process of inhibition occurs more specifically due to the interation between glycosaminoglycans and the proteins of the viral membrane, more specifically in protein G, that presents a domain of linking for heparin, avoiding the virus to bind to the host cell and initiating the infection process. The aim of this work was to verify the performance of glycosaminoglycans as inhibitors of the viral infection. This analysis was accomplished through experiments of Hep2 cell culture in the presence of these glycosaminoglycans (heparin and dextran sulfate) that was inoculated with the respiratory sincicial virus type A (RSVA) and analyzed through the technique of PCR and Indirect Imunofluorecence. The results had shown that the heparin and the dextran sulfate presented an inhibitory effect of the viral infection in Hep2 cells culture. / Orientador: Fátima Pereira de Souza / Coorientador: Paula Rahal / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: Paola Jocelan Provazzi Scaranzi / Mestre

Dans cette thèse, nous rapportons qu'un dendrigraft de poly-L-Lysine(DGL) est capable de former un complexe multi-ligand avec un peptide fluorescent, conduisant à la disparition quasi-totale du signal optique,qui peut ensuite être restauré en présence d'héparine. Ce système simple permet, pour la première fois, la détection de l'anticoagulant dans le sang humain à des doses cliniques. Ensuite, nous démontrons que ce système simple peut évoluer vers une barrette de senseurs. En fonction de la quantité d'indicateur sur le récepteur, des glycosaminoglycanes chargés négativement (GAG) induisent une variation du signal fluorescent selon s'ils déplacent ou compactent les indicateurs à la surface du récepteur. Cette stratégie unique permet non seulement l'identification aveugle de GAGs purs avec un niveau de précision de 100 %, mais aussi la différenciation de mixtures.Nous présentons également une méthodologie originale et simple pour la construction de structures tridimensionelles des DGLs. Nous étudions ensuite les caractéristiques structurelles de ces polymères par dynamique moléculaire. Cette méthodologie repose sur l'encodage des caractéristiques expérimentales des DGLs (i.e. degré de polymérisation, rapports de branchement, charges) en chaînes alphanumériques, qui seront ensuite interprétées par le programme de mécanique moléculaire Amber. Ce travail ouvre des perspectives pour l'exploration in silico des propriétés des dendrigrafts et des polymères hyperbranchés. Finalement, nous avons développé ChemBrows, un logiciel qui assiste les scientifiques/enseignants/étudiants dans leur veille bibliographique. Fonctionnant comme un lecteur de flux RSS amélioré qui intègre des filtres par mots-clés et un moteur de recommandation basé sur l'apprentissage machine, ChemBrows est un logiciel libre et open-source: www.chembrows.com. / In this thesis, we report that a "tree-like" dendrigraft ofpoly-L-Lysine (DGL) is able to form a multi-ligand complex with afluorescently labelled peptide, leading to the almost complete extinction ofthe optical signal that can be restored upon the introduction of heparin. This simple system allows, for the first time, the turn-ON fluorescent sensing of the anticoagulant in human blood at clinically relevant levels. Then, we demonstrate that this sensing ensemble can evolve toward a sensorarray. Depending on the loading of the indicator on the receptor, negatively charged glycosaminoglycans (GAGs) induce a positive or negative variation of the fluorescent signal as they displace the indicators from the receptor or they compact the indicators on the receptor’s surface, respectively. This unique strategy allows not only the blind identification of pure GAGs with a level of accuracy of 100 %, but also the differentiation of mixtures.We also report an original and simple methodology for the construction of three-dimensional structures of DGLs, and the subsequent investigation of their structural features using molecular dynamics simulations. This methodology relies on the encoding of the polymers’ experimental characterizations (i.e. degrees of polymerization, branchingratios, charges) into alphanumeric strings that are "readable" by the Ambersimulation package. This work opens avenues toward the in silico exploration of dendrigrafts and hyperbranched polymers.Finally, we developed ChemBrows, an in-house software that will significantly help scientists/teachers/ students to tame the flood of publications.Working as an enhanced RSS reader that integrates keyword-based filters anda machine-learning-based recommendation engine, ChemBrows is available onmultiple platforms as a free and open-source software at www.chembrows.com.

Glicosaminoglicanos (GAG) no urotélio e na urina possuem um efeito protetor contra desordens tais com urolitíase e cistite intersticial. Adicionalmente, foi demonstrado que hormônios sexuais femininos podem modular a excreção urinária de GAG (Maroclo M.V. et al. J Urol. 2005;173:1789-92). O presente estudo investigou se os anticoncepcionais hormonais orais combinados (AHOC) influenciam na excreção urinária de GAG. Amostras de urina foram doadas por mulheres jovens que utilizavam anticoncepcionais orais regularmente: EE + D (0,030 mg etinilestradiol + 3,0 mg drosperinona), n=9; EE + C (0,035 mg etinilestradiol + 2,0 mg acetato de ciproterona), n=9; e EE + G (0,020 mg etinilestradiol + 0,075 mg gestodeno), n=7. Controles foram 10 mulheres da mesma faixa etária não usuárias de AHOC. Valores de GAG urinário total das primeira e segunda metades do ciclo menstrual foram expressos como &#956;g ácido hexurônico por mg de creatinina urinária. A proporção de GAG sulfatado foi determinada pela eletroforese em gel de agarose. Em contraste com o grupo controle, a excreção de GAG total na primeira e segunda metades do ciclo menstrual foi bastante similar nos grupos usuários de AHOC. Valores de excreção em todo o ciclo foram maior no grupo usuário de AHOC (p < 0,01), particularmente para o grupo usuário de EE + C, no qual os valores foram o dobro dos valores do controle (p < 0,005). Comparados com o controle, os 3 grupos usuários de AHOC produziram diferenças marcantes na composição urinária de GAG sulfatado, com diminuição de aproximadamente 50% no HS (p < 0,02) e DS (p < 0,02), e um aumento próximo de 100% no CS (p < 0,004). O padrão de excreção urinário de GAG está claramente alterado em mulheres que ingerem os AHOC estudados. Sendo assim, esta mudança na excreção constitui um efeito benéfico adicional dos AHOC, pois ela aumenta o potencial efeito protetor dos GAG contra desordens do trato urinário. / Glycosaminoglycans (GAG) on the urothelium and in the urine have protective effects against disorders such as urolithiasis and interstitial cystitis. Additionally, we have shown that female sex hormones may modulate urinary GAG excretion (Maroclo MV et al. J Urol 2005;173:1789-92). Here we investigated whether oral hormonal contraceptives (OC) affect urinary GAG excretion. Urine specimens were obtained from young women regularly taking the following OC: EE + D (0.030 mg ethinyl estradiol + 3.0 mg drospirenone), n=9; EE + C (0.035 mg ethinyl estradiol + 2.0 mg cyproterone acetate), n=9; and EE + G (0.020 mg ethinyl estradiol + 0.075 mg gestodene), n=7. Controls were from ten age-matched women not taking OC. Total urinary GAG from the first and second halves of the menstrual cycle was assayed as g hexuronic acid per mg urinary creatinine. Content of sulfated GAG species was determined by agarose gel electrophoresis. In contrast to controls, excretion of total GAG in the first and second halves of the menstrual cycle was quite similar in the OC groups. Excretion values for the whole cycle were higher in the OC groups (p < 0.01), especially for EE + C, in which the values were twice those from controls (p < 0.005). Compared with controls, the three OC produced marked changes in the composition of urinary sulfated GAG, with decreases of ~50% in HS (p < 0.02) and DS (p < 0.02), and a ~100% increase in CS (p < 0.004). The pattern of urinary GAG excretion is clearly changed in women taking commonly used OC. However, this altered excretion should constitute an additional beneficial effect of OC, as it enhances the protective effects of GAG against urinary tract disorders.