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Os impactos ambientais causados pela queima dos combustíveis fósseis e pela sua manipulação, aliados ao crescente preço dos combustíveis, têm fomentado a procura de novos recursos renováveis e o desenvolvimento de novas tecnologias que suportem as necessidades desse mercado. Os biocombustíveis são recursos biodegradáveis e renováveis, que vêm se revelando uma alternativa economicamente viável. No entanto, a atual geração de biocombustíveis possui alguns pontos negativos, tais como: utilização de solos férteis e competição com a indústria de alimentos, uma vez que utiliza culturas como soja, milho e cana-de-açúcar, produtos de extrema importância econômica para seus países produtores. Por estes motivos, há um crescente interesse em explorar outras matérias-primas possíveis, em especial as voltadas exclusivamente para a geração de energia. Neste contexto, as microalgas vêm se mostrando uma opção bastante interessante. Estes organismos apresentam um alto potencial para tal, pois possuem alta taxa de crescimento e capacidade de produzir grande quantidade de óleo. Além disso, a produção do biocombustível por estes organismos pode ser otimizada tanto pela modificação das condições de cultivo (engenharia bioquímica), como através da manipulação genética das linhagens (engenharia genética). Neste trabalho, ambas as estratégias foram utilizadas com o intuito de se aumentar a quantidade de lipídeo produzido pela linhagem CC424 da microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. A via metabólica escolhida para a manipulação genética foi o ciclo do glioxilato, sendo as duas enzimas-chave desse ciclo, isocitrato liase (icl) e malato sintase (ms), os alvos. O plasmídeo pSL18 foi utilizado como vetor da transformação nas microalgas. Seis tipos de linhagens transformantes foram obtidas: duas delas subexpressando os genes icl e ms separadamente, duas subexpressando esses genes e duas contendo duplas transformações, ou seja, uma delas subexpressando ambos os genes ao mesmo tempo e a outra superexpressando os mesmos. Quando se subexpressou ambas as enzimas ao mesmo tempo, houve um aumento significativo na quantidade de lipídeos neutros da célula. Além disso, essa linhagem transgênica foi submetida à escassez de nitrogênio, o que acentuou ainda mais esse resultado. Enquanto em meio normal a diferença entre a quantidade de lipídeos foi de 1,5 vezes, em escassez de nitrogênio essa diferença foi de aproximadamente 3 vezes, corroborada pela diferença nos níveis de expressão gênica, que também foi em torno de 3 vezes. Além disso, a linhagem transgênica também mostrou um aumento em cada um dos ácidos graxos analisados individualmente, revelando uma grande quantidade de todos os tipos de C16 e C18, ácidos graxos importantes para que o biodiesel se adeque ao regulamento da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Apesar de maior quantidade de lipídeos em relação à linhagem selvagem, a nova linhagem transgênica Dupla-ICL-MS-anti não mostrou nenhum efeito deletério crítico. Tanto a produção de biomassa, quanto a quantidade de clorofila a, proteínas totais e carboidratos totais se mantiveram estáveis após a introdução da mutação. Esses resultados sugerem que as enzimas do ciclo do glioxilato, sabidamente ligadas ao catabolismo de ácidos graxos, podem ser utilizadas como alvos promissores para a otimização de linhagens já utilizadas comercialmente na produção de biodiesel. / The environmental impacts caused by gases emitted from burning fossil fuels and their manipulation, combined with rising fuel prices, has stimulated demand for new renewable resources and developing new green technologies that support the industry and market needs. Biofuels are biodegradable and renewable resources, which come out to be an economically viable alternative. However, the current generation of biofuels has some disadvantages, such as: use of fertile soils and competition with the food industry, once it uses crops such as soybeans, corn and sugar cane, products of extreme economic importance to the producing countries. For these reasons, there is a growing interest in exploring other possible raw materials, especially those that are geared exclusively for power generation. In this context, microalgae have shown to be a very interesting option. These organisms have a high potential because they have fast growth rate and the ability to produce large amounts of oil. In addition, biofuel production by these organisms can be optimized for both the modification of culture conditions (biochemical engineering), and through the genetic manipulation of microalgae strains (genetic engineering). In this work, the two strategies have been used in order to increase the amount of lipid produced by the strain CC424 from the model organism Chlamydomonas reinhardtii. The metabolic route chosen for genetic manipulation is the glyoxylate cycle, and the two key enzymes of this cycle, isocitrate lyase (icl) and malate synthase (ms), the targets. The plasmid pSL18 was used as a vector of transformation in the microalgae. Six types of transformant strains were obtained, two of them overexpressing the ms and icl genes separately, two underexpressing these genes and two double transformations, one of them overexpressing both genes at the same time the other one underexpressing them. The strain underexpressing both enzymes at the same time, showed a significant increase in the amount of neutral lipids. In this mutant, the shortage of nitrogen led to an even greater increase in these lipids. While in normal media the difference between the amount of lipids was 1.5 times, under nitrogen starvation the difference was approximately 3 times, corroborated by the difference in gene expression levels, which was also about 3 times. Moreover, the mutant strain also showed an increase in each of the individual fatty acids analyzed, revealing a large amount in all kinds of C16 and C18 fatty acids, important for biodiesel that suits the regulation of Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Although the mutant Dupla-ICL-MS-anti produces higher amounts of lipids compared to the wild type, the strain showed no critical negative effects. Both the production of biomass and the amount of chlorophylla, total protein and total carbohydrates remained stable after the introduction of the mutation. These results suggest that the enzymes of the glyoxylate cycle, which are linked to the catabolism of fatty acids, can be used as promising targets for the optimization of strains already used commercially in the production of biodiesel.

Os impactos ambientais causados pela queima dos combustíveis fósseis e pela sua manipulação, aliados ao crescente preço dos combustíveis, têm fomentado a procura de novos recursos renováveis e o desenvolvimento de novas tecnologias que suportem as necessidades desse mercado. Os biocombustíveis são recursos biodegradáveis e renováveis, que vêm se revelando uma alternativa economicamente viável. No entanto, a atual geração de biocombustíveis possui alguns pontos negativos, tais como: utilização de solos férteis e competição com a indústria de alimentos, uma vez que utiliza culturas como soja, milho e cana-de-açúcar, produtos de extrema importância econômica para seus países produtores. Por estes motivos, há um crescente interesse em explorar outras matérias-primas possíveis, em especial as voltadas exclusivamente para a geração de energia. Neste contexto, as microalgas vêm se mostrando uma opção bastante interessante. Estes organismos apresentam um alto potencial para tal, pois possuem alta taxa de crescimento e capacidade de produzir grande quantidade de óleo. Além disso, a produção do biocombustível por estes organismos pode ser otimizada tanto pela modificação das condições de cultivo (engenharia bioquímica), como através da manipulação genética das linhagens (engenharia genética). Neste trabalho, ambas as estratégias foram utilizadas com o intuito de se aumentar a quantidade de lipídeo produzido pela linhagem CC424 da microalga modelo Chlamydomonas reinhardtii. A via metabólica escolhida para a manipulação genética foi o ciclo do glioxilato, sendo as duas enzimas-chave desse ciclo, isocitrato liase (icl) e malato sintase (ms), os alvos. O plasmídeo pSL18 foi utilizado como vetor da transformação nas microalgas. Seis tipos de linhagens transformantes foram obtidas: duas delas subexpressando os genes icl e ms separadamente, duas subexpressando esses genes e duas contendo duplas transformações, ou seja, uma delas subexpressando ambos os genes ao mesmo tempo e a outra superexpressando os mesmos. Quando se subexpressou ambas as enzimas ao mesmo tempo, houve um aumento significativo na quantidade de lipídeos neutros da célula. Além disso, essa linhagem transgênica foi submetida à escassez de nitrogênio, o que acentuou ainda mais esse resultado. Enquanto em meio normal a diferença entre a quantidade de lipídeos foi de 1,5 vezes, em escassez de nitrogênio essa diferença foi de aproximadamente 3 vezes, corroborada pela diferença nos níveis de expressão gênica, que também foi em torno de 3 vezes. Além disso, a linhagem transgênica também mostrou um aumento em cada um dos ácidos graxos analisados individualmente, revelando uma grande quantidade de todos os tipos de C16 e C18, ácidos graxos importantes para que o biodiesel se adeque ao regulamento da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Apesar de maior quantidade de lipídeos em relação à linhagem selvagem, a nova linhagem transgênica Dupla-ICL-MS-anti não mostrou nenhum efeito deletério crítico. Tanto a produção de biomassa, quanto a quantidade de clorofila a, proteínas totais e carboidratos totais se mantiveram estáveis após a introdução da mutação. Esses resultados sugerem que as enzimas do ciclo do glioxilato, sabidamente ligadas ao catabolismo de ácidos graxos, podem ser utilizadas como alvos promissores para a otimização de linhagens já utilizadas comercialmente na produção de biodiesel. / The environmental impacts caused by gases emitted from burning fossil fuels and their manipulation, combined with rising fuel prices, has stimulated demand for new renewable resources and developing new green technologies that support the industry and market needs. Biofuels are biodegradable and renewable resources, which come out to be an economically viable alternative. However, the current generation of biofuels has some disadvantages, such as: use of fertile soils and competition with the food industry, once it uses crops such as soybeans, corn and sugar cane, products of extreme economic importance to the producing countries. For these reasons, there is a growing interest in exploring other possible raw materials, especially those that are geared exclusively for power generation. In this context, microalgae have shown to be a very interesting option. These organisms have a high potential because they have fast growth rate and the ability to produce large amounts of oil. In addition, biofuel production by these organisms can be optimized for both the modification of culture conditions (biochemical engineering), and through the genetic manipulation of microalgae strains (genetic engineering). In this work, the two strategies have been used in order to increase the amount of lipid produced by the strain CC424 from the model organism Chlamydomonas reinhardtii. The metabolic route chosen for genetic manipulation is the glyoxylate cycle, and the two key enzymes of this cycle, isocitrate lyase (icl) and malate synthase (ms), the targets. The plasmid pSL18 was used as a vector of transformation in the microalgae. Six types of transformant strains were obtained, two of them overexpressing the ms and icl genes separately, two underexpressing these genes and two double transformations, one of them overexpressing both genes at the same time the other one underexpressing them. The strain underexpressing both enzymes at the same time, showed a significant increase in the amount of neutral lipids. In this mutant, the shortage of nitrogen led to an even greater increase in these lipids. While in normal media the difference between the amount of lipids was 1.5 times, under nitrogen starvation the difference was approximately 3 times, corroborated by the difference in gene expression levels, which was also about 3 times. Moreover, the mutant strain also showed an increase in each of the individual fatty acids analyzed, revealing a large amount in all kinds of C16 and C18 fatty acids, important for biodiesel that suits the regulation of Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. Although the mutant Dupla-ICL-MS-anti produces higher amounts of lipids compared to the wild type, the strain showed no critical negative effects. Both the production of biomass and the amount of chlorophylla, total protein and total carbohydrates remained stable after the introduction of the mutation. These results suggest that the enzymes of the glyoxylate cycle, which are linked to the catabolism of fatty acids, can be used as promising targets for the optimization of strains already used commercially in the production of biodiesel.

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes émergents. Après phagocytose macrophagique, C. albicans reprogramme son métabolisme pour faire face à une carence carbonée et induit 2 voies métaboliques, le cycle du glyoxylate et la β-oxydation. Notre objectif est d’étudier le lien entre β-oxydation, capacité de résistance à la phagocytose et virulence dans notre modèle biologique C. lusitaniae. Chez les levures Ascomycètes la β-oxydation, essentielle pour dégrader les acides gras (AG), est présumée être exclusivement peroxysomale.Nous avons construit 3 mutants nuls chez C. lusitaniae : icl1Δ, fox2Δ et pxa1Δ, respectivement défectifs pour l’isocitrate lyase (enzyme clé du cycle du glyoxylate), pour la protéine multifonctionnelle de la β-oxydation et pour une protéine responsable de l’import peroxysomal des AG à longue chaîne. L’étude de l’assimilation des AG et du catabolisme du 14Calpha-palmitoyl-CoA a révélé que les acyl-CoA à longue chaîne étaient toujours dégradés chez fox2Δ. L’étude du catabolisme des AG dans les fractions peroxysomale et mitochondriale des souches sauvage et fox2Δ, l’immunolocalisation de la protéine Fox2p et la mesure de la respiration mitochondriale nous ont permis de montrer pour la première fois chez une levure Ascomycète l’existence d’une β-oxydation Fox2p-dépendante dans la mitochondrie. C’est aussi la première démonstration chez un organisme eucaryote de la double localisation peroxysomale et mitochondriale de Fox2p. L’invalidation des gènes FOX1 et FOX3 (acyl-CoA oxydase et kétoacyl-CoA thiolase) a confirmé pour la première fois chez les champignons l’existence d’une voie peroxysomale alternative de catabolisme des AG, Fox2p-indépendante / The Candida spp. are emerging opportunistic pathogens. Phagocytic cells are a primary line of defense against these opportunistic pathogens. Upon phagocytosis by macrophages, C. albicans reprograms its metabolism because genes involved in the peroxisomal metabolism, such as glyoxylic acid cycle and beta-oxidation pathway, are overexpressed. The objective of this study was to study the relation between fatty acid beta-oxidation, resistance to phagocytosis and virulence in the biological model Candida lusitaniae. In ascomycetous yeasts, the fatty acid β-oxidation is assumed to be exclusively located to peroxisomes.We constructed three null-mutants in C. lusitaniae: icl1Δ, fox2Δ et pxa1Δ, respectively lacking the isocitrate lyase (a key enzyme of the glyoxylate cycle), the multifunctional fatty acid beta-oxidation protein (essential in C. albicans to the β-oxidation pathway), and a protein involved in the peroxisomal import of long-chain fatty acids. The study of fatty acid assimilation and 14Calpha-palmitoyl-CoA catabolism revealed that long-chain fatty acids were still catabolized in fox2Δ. The observation of 14Calpha-palmitoyl-CoA catabolism in mitochondrial and peroxisomal fractions of wild-type and fox2Δ strains, the immunolocalization of Fox2p and mitochondrial respiration measurements yielded to the first demonstration in ascomycetous yeast of a mitochondrial Fox2p-dependent fatty acid β-oxidation pathway. We also demonstrated for the first time in Eucaryota that Fox2p co-localized in both peroxisomes and mitochondria. The invalidation of FOX1 and FOX3 genes (acyl-CoA oxidase and ketoacyl-CoA thiolase, respectively) confirmed for the first time in Fungi the existence of an alternative peroxisomal pathway for fatty acid catabolism, Fox2p-independently.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O pinhÃo-manso (Jatropha curcas L.) à uma planta oleaginosa, pertencente à famÃlia Euphorbiaceae, cujas sementes sÃo reconhecidas como matÃria-prima com potencial para a produÃÃo de Ãleo. Essa planta tambÃm à considerada tolerante a condiÃÃes adversas, tais como dÃficit hÃdrico e deficiÃncia nutricional do solo, o que favorece o seu cultivo em regiÃes Ãridas e semiÃridas. Objetivou-se avaliar os efeitos do estresse salino sobre a germinaÃÃo e a mobilizaÃÃo das reservas de sementes e plÃntulas de pinhÃo-manso, por meio de anÃlises bioquÃmicas, fisiolÃgicas e ultraestruturais. Os parÃmetros germinativos foram negativamente afetados pelo estresse salino, observando-se reduÃÃes significativas principalmente no percentual de germinaÃÃo e no Ãndice de velocidade de germinaÃÃo. Similarmente, a matÃria seca, avaliada no eixo embrionÃrio e no endosperma, foi reduzida pela salinidade. Com relaÃÃo aos compostos de reserva, os lipÃdios foram os mais abundantes, correspondendo a 64,0% da matÃria seca do endosperma da semente quiescente. Estes compostos apresentaram forte retardo em sua mobilizaÃÃo em condiÃÃo de estresse salino. As proteÃnas, a segunda reserva mais abundante (21,3%), tambÃm tiveram sua mobilizaÃÃo severamente afetada pelo tratamento salino. O amido foi detectado em pequena quantidade (5,5%), porÃm, verificou-se o aumento transiente de seu teor aos 5 dias apÃs a semeadura (DAS), que coincidiu com a intensa mobilizaÃÃo de lipÃdios, em condiÃÃes controle. Entretanto, em condiÃÃes de estresse salino, o amido foi pouco mobilizado. Os produtos da mobilizaÃÃo das reservas, em condiÃÃes controle, principalmente os aÃÃcares nÃo-redutores e aminoÃcidos livres aumentaram no endosperma, enquanto que, sob condiÃÃes de salinidade, eles foram pouco alterados. AlÃm disso, as anÃlises citoquÃmicas e ultraestruturais confirmaram a abundante quantidade de lipÃdios e proteÃnas, sendo detectados inÃmeros corpos proteicos e lipÃdicos no citoplasma das cÃlulas endospÃrmicas dessas sementes. A salinidade tambÃm promoveu alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais nas cÃlulas endospÃrmicas durante a germinaÃÃo e desenvolvimento de plÃntulas. O presente estudo tambÃm avaliou o metabolismo lipÃdico atravÃs da anÃlise da composiÃÃo dos Ãcidos graxos do endosperma e da anÃlise da atividade enzimÃtica e da expressÃo gÃnica das enzimas lipase, liase do isocitrato e sintase do malato. Os Ãcidos graxos insaturados foram os mais abundantes, destacando-se o oleico e o linoleico-linolÃnico, que apresentaram incrementos em seus teores, em condiÃÃes controle, ao longo do perÃodo avaliado, porÃm, sob estresse salino foram pouco alterados. A lipase apresentou incremento na sua atividade ao longo da germinaÃÃo, que coincidiu com a intensa mobilizaÃÃo de lipÃdios observada no controle. Similarmente, a reduÃÃo dessa atividade foi correspondente ao retardo na mobilizaÃÃo dos lipÃdios em condiÃÃo de estresse salino. A atividade enzimÃtica da liase do isocitrato nÃo apresentou diferenÃas significativas entre os tratamentos atà Ãs 96 horas apÃs a semeadura (HAS), porÃm apÃs esse perÃodo, verificaram-se as maiores reduÃÃes na condiÃÃo de estresse salino, quando comparado ao controle. Jà a atividade da sintase do malato foi significativamente maior em condiÃÃes controle atà Ãs 144 HAS, entretanto, a partir desse perÃodo, essa atividade se mostrou superior em condiÃÃes salinas. Verificaram-se reduÃÃes na atividade dessas enzimas em decorrÃncia do estresse, o que teve correlaÃÃo com as mudanÃas na expressÃo dos genes da lipase e liase do isocitrato. Portanto, pode-se concluir que a salinidade contribuiu para o retardo na mobilizaÃÃo dos lipÃdios, a principal reserva encontrada nas sementes de J. curcas, o que foi correlacionado a reduÃÃo na atividade das enzimas envolvidas no seu metabolismo. / Jatropha curcas L. is an oilseed species belonged to Euphorbiaceae family, whose seeds are recognized as promising source for biodiesel production. Its ability to survive in adverse conditions, such as water stress and poor nutritional soil, is noteworthy, which favors its cultivation in arid and semiarid regions. Here we evaluate the negative effects promoted by NaCl salt stress on seed germination, reserve mobilization of J. curcas through biochemical, physiological and ultrastructural analysis. The seed germination parameters were significantly affected by salt stress, being observed that the main parameters affected were germination percentage and germination speed index. Similarly, the embryo and endosperm dry mass were reduced by Na+ and Cl- increase in the medium. Considering the reserve compounds, the most abundant reserve of these seeds were the lipids, which corresponded to 64.0% of endosperm seed quiescent dry mass. They showed a stronger delay in reserve mobilization under saline conditions. Proteins were the second most important reserve (21.3%), being severally affected by salinity. The starch was detected in little amount (5.5% of quiescent seed dry mass), however there was a transient increase in this contents at 5 DAI (days after imbibition), which was correlated to the intense lipid mobilization, in control conditions. On the other hand, in salinity, it was observed that starch mobilization was reduced. The seed reserve products (mainly non-reducing sugars and free amino acids) were increased in endosperm in control in relation to quiescent seed, during germination, whereas for salt conditions, these products were few changed. Additionally, cytochemical and ultrastructural analyses confirmed the large amount of protein and lipid bodies in endosperm cells, reaching the identification of a huge amount of protein and lipid bodies. Salt stress promoted morphological and ultrastructural changes in endospermic cells, during germination and seedling development confirming the biochemical analyses. The present study also evaluated the lipid metabolism, using the fatty acid composition analysis and enzymatic and expression genic analyses for lipase, isocitrate liase, malate sintase. The unsaturated fatty acids were the most abundant, highlighting oleic (C18:1) and linoleic-linolenic (C18:2; C18:3), showing increase in their contents, in control conditions, during the evaluated period. However, the fatty acids practically were not changed in salinity conditions. Lipase showed increase in their activity during germination, which corresponded to intense mobilization in lipids in control. In similar way, the reduction of this activity happened in salinity, correlating to lipid delay mobilization. The evident delay of protein and oil body mobilization could strongly affect initial seedling development. The liase isocitrate activity did not show significant differences between treatments until 96 hours after imbibition (HAI), however, following this period, it was verified the strongest reduction in salt stress condition. The activity of malate synthase was not significantly higher in control conditions until 144 HAI, however, following this period, this activity was higher in salinity. It were verified reductions in enzymatic activity due to salt stress, which were correlated to gene expression changes of lipase and isocitrate lyase. Therefore, salinity contributed negatively to lipid mobilization, the main reserve of J. curcas seeds, which was correlated to reduction in activity of the enzymes involved in lipid metabolism.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert part 1 Benedito.pdf: 5001631 bytes, checksum: 7d51091e361c98586e384be80ebe9178 (MD5) Previous issue date: 2009-05-11 / The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis causative of Paracoccidioidomycosis (PCM), a pulmonary mycose acquired by inhalation of fungal airborne propagules, which may disseminate to several organs and tissues leading to a severe form of the disease. Adhesion and invasion to host cells are essential steps involved in the internalization and dissemination of pathogens. Inside host, P. brasiliensis use the glyoxylate cycle for intracellular survival. Here, we provide evidence that malate synthase of P. brasiliensis (PbMLS) is localized on the cell wall, and is secreted. PbMLS was overexpressed in Escherichia coli, and polyclonal antibody against this protein was obtained. By using Confocal Laser Scanning Microscopy and Western blot analysis, PbMLS was detected in the cytoplasm and the cell wall of the yeast phase of P. brasiliensis of mother and bud yeast cells. PbMLSr and the respective polyclonal antibody produced against this protein inhibited the interaction of P. brasiliensis to in vitro cultured epithelial cells A549. These observations indicated that cell wall-associated MLS of P. brasiliensis could be mediating the binding of fungal cells, thus contributing to the adhesion of fungus to host tissues and to the dissemination of infection. / O fungo de patogênico Paracoccidioides brasiliensis agente causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose pulmonar adquirida pela inalação de propágulos aéreos do fungo que pode se disseminar a vários órgãos e tecidos levando a uma forma severa da doença. Dentro do hospedeiro, P. brasiliensis usa o ciclo do glioxalato (CG) para sobrevivência intracelular. Adesão e invasão das células do hospedeiro são passos essenciais envolvidos na internalização e disseminação do patógeno. Aqui, nós evidênciamos que malato sintase de P. brasiliensis (PbMLS) é secretada, e é localizada na parede da célula. PbMLS foi superexpressa em Escherichia coli, e o anticorpo policlonal contra esta proteína foi obtido. Usando Microscopia Laser Confocal (CLSM) e análise de Western blot, PbMLS foi encontrada no citoplasma e na parede da célula na fase leveduriforme de P. brasiliensis nas células mãe e broto. PbMLSr e o respectivo anticorpo policlonal produzido contra esta proteína inibiram a interação de P. brasiliensis com células epiteliais A549 cultivads in vitro. Estas observações indicariam que MLS associada à parede da célula de P. brasiliensis pode estar mediando a ligação do fungo às células, contribuindo assim com a adesão do fungo aos tecidos hospedeiros e para a disseminação da infecção.