La stéatose hépatocytaire, définie par l’accumulation de triglycérides dans les hépatocytes, est fréquente au cours de l’hépatite chronique C. La stéatose peut être induite par le VHC de génotype 3 et constitue alors une lésion cytopathique virale au cours de l’hépatite chronique C. Cette observation clinique suggère que la stéatose viro-induite est liée à la fonction d’une ou de plusieurs protéine(s) virale(s) du génotype 3 rarement portée par les protéines correspondantes de génotype non-3. L’objectif de ce travail a été d’identifier des déterminants viraux de la stéatose hépatocytaire viro-induite au cours de l’hépatite chronique C et entrevoir les mécanismes impliqués dans cette pathologie. Des analyses menées sur des séquences de VHC strictement sélectionnés pour leur génotype et leur capacité à induire une stéatose chez les patients atteints d’hépatite chronique C, ont permis de mettre en évidence des déterminants putatifs de la stéatose viro-induite. Des résidus associés au caractère stéatogène ou non stéatogène des séquences de VHC étudiées ont été identifiés dans les régions codant E1, E2 et NS3. Le caractère partiel de la compartimentation de ces mutations nécessite toutefois une étude fonctionnelle de ces séquences pour valider leur pertinence. Le motif FATG164-167 de la protéine de capside, qui a été impliqué dans l’accumulation spécifique de triglycérides par la protéine de capside, se révèle caractéristique du génotype 3 et non associé à un pouvoir stéatogène in vivo. Nous avons examiné, in vitro, selon le génotype de la protéine virale et son association avec une stéatose in vivo, d’une part les interactions entre les gouttelettes lipidiques et les protéines de capside, et d’autre part les changements morphologiques des gouttelettes lipidiques liés à l’expression de la protéine de Capside. Ces travaux montrent que les protéines de Capside de génotypes 1b et 3a sont localisées de manière similaire à la surface des gouttelettes lipidiques indépendamment du caractère stéatogènes de VHC dont elles sont issues. Néanmoins, l’expression de la protéine de capside de génotype 3 est associée à la formation de gouttelettes lipidiques plus grosses et plus nombreuses par rapport à celles de génotype 1b. Ces résultats suggèrent que l’interaction de la protéine de Capside avec les gouttelettes lipidiques pourrait jouer un rôle dans l’induction d’une stéatose par le VHC de génotype 3. L’absence de différences génétique ou fonctionnelle entre les protéines de Capside de génotype 3 issues de VHC stéatogène ou non stéatogène in vivo suggèrent cependant que d’autres protéines virales et/ou facteurs cellulaires doivent certainement être impliqués dans le développement d’une stéatose hépatocytaire chez les patients infectés par un VHC de génotype 3a / Hepatocellular steatosis is common in patients with chronic hepatitis C. Steatosis can be considered as a true cytopathic lesion induced by hepatitis C virus genotype 3, suggesting that one or more viral proteins produced during genotype 3 infection are involved in the steatogenic process, while the same proteins produced during infection by other genotypes are not. Our objective was to identify the viral determinants of HCV-induced steatosis and to understand the underlying mechanisms. Extensive analysis performed on HCV sequences selected on their genotype and their association with in vivo steatosis are revealed putative viral determinants of viral-induced steatosis in E1-E2 and NS3 proteins coding regions. However, we can not rule out the potential role of these positions in HCV-induced steatosis and experimental study should be drawn to explore this issue. In addition, the FATG164-167 motif, which has been implicated in HCV core protein induced steatosis, was constantly present on genotype 3a sequences independently of the original presence or absence of liver steatosis. We examined in vitro interactions between lipid droplets and full-length core protein isolated from patients with HCV genotype 3a infection, with and without steatosis, and from steatosis-free patients infected by hepatitis C HCV 1b. We also examined morphological changes in the lipid droplets according to the HCV genotype and the presence of steatosis in vivo. We showed that the core protein of both HCV genotypes 1b and 3a binds tightly to the surface of intracellular lipid droplets. However, cells transfected with genotype 3a contain more neutral lipids in lipid droplets, and more large lipid droplets, than cells transfected with genotype 1b sequences. This suggests that hepatitis C virus core protein-lipid droplet interaction could play a role in virus-induced steatosis. Importantly, we found no genetic or functional differences between genotype 3a core proteins from patients with and without hepatitis C virus-induced steatosis. This suggests that other viral proteins and/or host factors are involved in the development of hepatocellular steatosis in patients infected by hepatitis C virus genotype 3a

Les anticorps sont des protéines en forme de Y, trouvées comme composant du sérum circulant, qui aident le système immunitaire à cibler et à répondre aux agents pathogènes et aux molécules étrangères, mais peuvent aussi contribuer à la maladie en réagissant aux protéines constitutives. Les anticorps sont produits par des Plasmocytes, qui les sécrètent dans la circulation. Parce qu'il n'y a pas de lien physique entre les plasmocytes et leurs anticorps sécrétés, la détection d'anticorps spécifiques d’un antigène est problématique. Dans cette thèse, j'explore l'utilisation de la microfluidique en gouttelettes pour générer et manipuler des compartiments aqueux homogènes dans lesquels des cellules sécrétant anticorps peuvent être isolées et analysées à haut débit a'échelle d'une seule cellule. Pour caractériser les cellules sécrétant des anticorps à l'intérieur des gouttelettes, j'utilise un nouveau test qui permet d'interroger les cellules en fonction de la spécificité de leur sécrétion. Ces compartiments de gouttelettes peuvent être triés pour le séquençage d'anticorps, ou analysés au cours du temps pour obtenir des informations cinétiques de l'interaction anticorps-antigène à l'intérieur de chaque gouttelette. En utilisant une nouvelle technologie, j'ai pu obtenir le répertoire d'anticorps de souris immunisées contre deux antigènes différents à partir de cellules sécrétant des anticorps spécifiques d’un antigène, avec des capacités égales ou supérieures aux technologies disponibles actuelles. Aussi, j'ai pu suivre le processus de maturation d'affinité des anticorps à l'échelle de la cellule unique, à la fois dans l'immunisation et la maladie auto-immune. Avec ces outils, je démontre comment la microfluidique peut être utilisée pour caractériser les réponses immunitaires et auto-immunes à travers l'évaluation de cellules sécrétant des anticorps. / Antibodies are Y shaped proteins, found as a component of circulating serum, that help the immune system target and respond to pathogens and foreign molecules, but can also contribute to disease when reacting to constitutive self-proteins. Antibodies are produced Plasma Cells, which secrete them into circulation. Because there’s no physical link between Plasma Cells and their secreted antibodies, the detection of antigen-specific antibodies is problematic. In this thesis I explore the use of droplet microfluidics to generate and manipulate homogeneous aqueous compartments in which single antibody secreting cells can be isolated and analyzed in a high-throughput manner. To characterize single antibody secreting cells inside the droplets I use a novel assay that allows to interrogate cells based on the specificity of their secretion. These droplet compartments can be sorted for single cell antibody sequencing, or analyzed over time to obtain kinetic information of the antibody-antigen interaction inside each droplet. Using new established technology I was able to obtain the antibody repertoire of mice immunized against two different antigens from single antigen-specific antibody secreting cells, with equal or better capacities than current available technologies. Also, I was able to follow the affinity maturation process of antibodies at the single-cell level, both in immunization and autoimmune disease. With these tools I demonstrate how microfluidics can be used to characterize the immune and the autoimmune responses through the evaluation of single antibody secreting cells.

La stéatose hépatocytaire, définie par l'accumulation de triglycérides dans les hépatocytes, est fréquente au cours de l'hépatite chronique C. La stéatose peut être induite par le VHC de génotype 3 et constitue alors une lésion cytopathique virale au cours de l'hépatite chronique C. Cette observation clinique suggère que la stéatose viro-induite est liée à la fonction d'une ou de plusieurs protéine(s) virale(s) du génotype 3 rarement portée par les protéines correspondantes de génotype non-3. L'objectif de ce travail a été d'identifier des déterminants viraux de la stéatose hépatocytaire viro-induite au cours de l'hépatite chronique C et entrevoir les mécanismes impliqués dans cette pathologie. Des analyses menées sur des séquences de VHC strictement sélectionnés pour leur génotype et leur capacité à induire une stéatose chez les patients atteints d'hépatite chronique C, ont permis de mettre en évidence des déterminants putatifs de la stéatose viro-induite. Des résidus associés au caractère stéatogène ou non stéatogène des séquences de VHC étudiées ont été identifiés dans les régions codant E1, E2 et NS3. Le caractère partiel de la compartimentation de ces mutations nécessite toutefois une étude fonctionnelle de ces séquences pour valider leur pertinence. Le motif FATG164-167 de la protéine de capside, qui a été impliqué dans l'accumulation spécifique de triglycérides par la protéine de capside, se révèle caractéristique du génotype 3 et non associé à un pouvoir stéatogène in vivo. Nous avons examiné, in vitro, selon le génotype de la protéine virale et son association avec une stéatose in vivo, d'une part les interactions entre les gouttelettes lipidiques et les protéines de capside, et d'autre part les changements morphologiques des gouttelettes lipidiques liés à l'expression de la protéine de Capside. Ces travaux montrent que les protéines de Capside de génotypes 1b et 3a sont localisées de manière similaire à la surface des gouttelettes lipidiques indépendamment du caractère stéatogènes de VHC dont elles sont issues. Néanmoins, l'expression de la protéine de capside de génotype 3 est associée à la formation de gouttelettes lipidiques plus grosses et plus nombreuses par rapport à celles de génotype 1b. Ces résultats suggèrent que l'interaction de la protéine de Capside avec les gouttelettes lipidiques pourrait jouer un rôle dans l'induction d'une stéatose par le VHC de génotype 3. L'absence de différences génétique ou fonctionnelle entre les protéines de Capside de génotype 3 issues de VHC stéatogène ou non stéatogène in vivo suggèrent cependant que d'autres protéines virales et/ou facteurs cellulaires doivent certainement être impliqués dans le développement d'une stéatose hépatocytaire chez les patients infectés par un VHC de génotype 3a

La mise au point en 2005 d’un modèle de propagation sur lignée d’hépatocarcinome basé sur la souche hautement réplicative JFH-1 fut une formidable opportunité d’étudier les différentes étapes du cycle infectieux du VHC. Nous avons souhaité étudier les étapes de morphogenèse et de sécrétion du virus, des phases du cycle viral qui sont largement mal connues encore aujourd’hui, mais ou la protéine de capside joue probablement un rôle majeur. Des études comparatives des séquences de capsides de différentes souches du VHC nous ont permis de mettre en évidence 10 résidus spécifiques à la souche JFH-1 qui pourraient expliquer les déficits fonctionnels connus de cette protéine. En effet, le remplacement de ces 10 résidus par ceux plus communément retrouvés dans les souches de génotype 1 et 2 a permis une amélioration significative de l’assemblage et de la sécrétion des particules infectieuses produites. La mise au point de cette souche optimisée pour la production de virus pourrait par ailleurs permettre constituer un atout pour mieux comprendre la structure du virus par des techniques de microscopie électronique ; ce type d’étude n’ayant pas pu être véritablement menée jusqu’à présent, en raison des titres infectieux insuffisants obtenus avec la souche JFH-1 sauvage. / Development and cloning in 2005 of the highly replicative strain JFH-1 was a great opportunity to study the different stages of the infectious cycle of HCV as this strain easily propagate in the hepatocellular carcinoma cell line. Until now, these lates phases of particles assembly remain poorly understood, although the core protein is thought to probably play a major role in initiation of these mechanisms. Comparative studies of the capsid sequences of different strains of hepatitis C have allowed us to identify 10 specific residues in the JFH-1 strain that could explain the functional deficits of this protein. Indeed, the replacement in JFH-1 strain of these 10 residues by those most commonly found in strains of genotype 1 and 2 showed improvement of the assembly and secretion of new infectious particles and new subcellular localization of core. In addition, replacement of these ten residues by most common amino acid found in patients show a great enhancement of in vitro virus production and secretion. As a perspective, development of this optimized virus could also represent a valuable model to better purify and determine viral structure, and true viral assembly site; HCV fields that remain till now largely unknown.

De par leur qualité d’accumulation de triacylglycérol (TAG) sous forme de gouttelettes lipidiques (LDs) lors destress abiotiques, les microalgues oléagineuses se sont imposées comme des modèles d’études d’intérêt pour denombreuses applications biotechnologiques (nutrition, chimie verte, biocarburants, santé humaine). Ces stresssont cependant responsables d’un arrêt de la croissance et de production de biomasse. Un criblage de petitesmolécules visant à favoriser l’accumulation de TAG chez la diatomée Phaeodactylum a mis en lumière 34composés connus pour agir sur certaines voies métaboliques de signalisation. Une étude approfondie des effetsdu 17α-éthynylestradiol est proposée. La mise en lumières de composés ciblant les nucléotides cycliques et lesoxylipines nous a conduit à réévaluer les effets du monoxyde d’azote (NO.) et à détecter la présenced’isoprostanoïdes après un stress oxydant chez Phaeodactylum.Les LDs sont des structures conservées, des procaryotes jusqu’aux endosymbiontes secondaires, présentant uncoeur hydrophobe entouré d’une monocouche de lipides polaires dans laquelle s’enchâssent des protéines defaçon transitoire ou permanente. Ces protéines peuvent jouer un rôle structural ou être impliquées dans labiologie de la gouttelette. Après optimisation d’un protocole de purification, nous avons déterminé leglycérolipidome et le protéome de la LD de Phaeodactylum. Le coeur hydrophobe des LDs est constituéuniquement de TAG entouré d’une monocouche de lipides polaires composée de phosphatidylcholine (PC),sulfoquinovosyldiacylglycérol (SQDG) et de deux espèces moléculaires (20:5-16:1 et 20:5-16:2) de DGTA, unbétaine lipide. Un stérol libre localisé probablement dans la monocouche, le brassicastérol, a été égalementdétecté. Un enrichissement spécifique en β-carotène a été observé. Le protéome de la LD est composé de 86protéines incluant notamment la LD-protéine StLDP, des acteurs du métabolisme, des protéines associées à desorganites membranaires, au traitement de l’information génétique ou encore des chaperonnes impliquées dans lecontrôle qualité des protéines. Ces travaux nous éclairent sur la biogenèse et la découverte de possiblesnouvelles fonctionnalités de la LD de Phaeodactylum. Nous proposons un nouveau modèle architectural pour laLD nous interrogeant sur ses origines. Des perspectives d’études, pour la caractérisation fonctionnelle desacteurs protéiques de la LD et sur une relocalisation de la LD vers la membrane plasmique pour favoriser sonextraction, sont proposées. / Due to their quality of triacylglycerol (TAG) content in the form of lipid droplets (LDs) accumulating upon abioticstresses, microalgae have emerged as models of interest for many biotechnological applications (nutrition, greenchemistry, biofuels, human health). These stresses, however, are responsible for a growth arrest and lowbiomass yield. A phenotypic screen of small molecules triggering TAG accumulation in Phaeodactylumhighlighted 34 compounds known to act on specific metabolic and signaling pathways. A detailed study of theeffects of 17α-ethynylestradiol is proposed. The identification of compounds interfering with cyclic nucleotides andoxylipins led us to re-evaluate the effects of nitric oxide (NO.) and to characterize the activity of isoprostanoidsafter oxidative stress in the diatom Phaeodactylum.LDs are subcellular structures, conserved from prokaryotes to secondary endosymbionts, containing ahydrophobic core surrounded by a monolayer of polar lipids to which proteins transiently or permanentlyassociate. These proteins may play a structural role or be involved in the function of the droplet. After optimizationof a purification protocol, we determined the glycerolipidome and the proteome of the LD of Phaeodactylum. Thehydrophobic core is only made of TAG surrounded by a monolayer of polar lipids consisting ofphosphatidylcholine (PC), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) and two molecular species (20:5-16:1 and 20:5-16:2) of DGTA, a betaine lipid. A sterol probably located in the monolayer, brassicasterol, was also detected.Specific enrichment of β-carotene has been observed. The proteome of the LD is composed of 86 proteinsincluding most notably the LD-protein StLDP, metabolic actors, organelle membrane associated proteins, proteinsimplicated in the treatment of genetic information or chaperones involved in protein quality control. This thesisallows us a better understanding of the biogenesis and the discovery of possible new functionalities of thePhaeodactylum LD. We propose an architectural model for the LD, and address the question of its origins. Futureprospects on the functional characterization of LD proteins and relocation of LD to the plasma membrane topromote its extraction are proposed.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Ces travaux ont pour contexte de participer à l’optimisation les cycles de décontamination des salles propres en utilisant un nouveau système de décontamination. Le principe de ce système est de décontaminer un volume par condensation de vapeur de peroxyde d’hydrogène sur toutes les parois intérieures du volume. Différents modèles de condensation et d’évaporation pariétaux ont été étudiés, développés et implémentés dans un code CFD, en incluant des modèles simples ainsi que des modèles plus complexes prenant en compte la forme de la phase liquide pariétale. En parallèle, afin de valider les modèles, un dispositif expérimental d’isolateur pour la décontamination a été utilisé afin de créer une base de données expérimentale de condensation de vapeur. Enfin, la validation de ce modèle numérique a été réalisée en comparant les résultats numériques fournis par le modèle développé dans une reproduction numérique de l’isolateur expérimental avec les résultats des expérimentations. / The context of this work is to contribute to the optimization of clean room decontamination cycles by using a new decontamination system. The concept of this system is to decontaminate a volume by condensing hydrogen peroxide vapour on all the inner walls of the volume. Different models of wall condensation and evaporation have been studied, developed and implemented in a CFD code, including simple models as well as more complex models taking into account the shape of the liquid phase at the wall. In parallel, in order to validate the models, an experimental isolator device for decontamination was used to create an experimental steam condensation database. Finally, the validation of this numerical model was carried out by comparing the numerical results provided by the model developed in a digital reproduction of the experimental isolator with the results of the experiments.