A proteína Cpn60 faz parte de um grupo de proteínas altamente conservadas que estão envolvidas em funções celulares essenciais. camundongos BALB\\c foram imunizados com 5 ou 10 µg da proteína recombinante (Cpn60r) sozinha ou adicionada à vacina DTP sem hidróxido de alumínio (NADTP). A vacina DTP do Instituto Butantan (DTP) foi usada como controle. Foi avaliada a produção de citocinas por células esplênicas após reestímulo in vitro com a Cpn60r. Os animais foram desafiados após o protocolo de imunização. A Cpn60r sozinha ou misturada à vacina NADTP foi capaz de induzir níveis de anticorpos contra pertussis mais altos do que os induzidos pela DTP. Os níveis de IgG1 e IgG2a foram similares para todos os grupos. Pôde-se observar a produção de de IL-6 e IFN-&#947 nos grupos imunizados com Cpn60r. Os grupos imunizados com Cpn60r+NADTP apresentaram um índice de proteção entre 60 e 80% contra o desafio pela bactéria virulenta, semelhante ao grupo imunizado com DTP. A proteína Cpn60r é bastante promissora não somente como imunógeno, mas também como adjuvante. / The Cpn60 protein is a member of a group of higly conserved proteins linked to essencial cell functions. The Cpn60 was cloned, expressed and its immune response has been evaluated. BALB\\c mice were immunized with 5 or 10 µg of the recombinant protein (Cpn60r) alone or mixed with DPT vaccine without aluminum hidroxyde (NADPT). The DPT vaccine from Instituto Butantan was used as control. We evaluated the cytokines production by spleen cells after they have been reestimulated in vitro with Cpn60r. The animals were challenged after the immunization protocol. The Cpn60r alone or mixed with NADPT vaccine was able to induce higher antibodies levels than DPT. IgG1 and IgG2a levels were similar in all groups. We could detect levels of IL-6 and IFN-&#947 on groups immunized with Cpn60r. The groups immunized with Cpn60r+NADTP showed a 60 and 80% protection rate against the challenge with the live bacteria, similar to the group immunized with DPT. These results show the immune response of the recombinant protein that could be included in immunization protocols for pertussis.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira. A patogênese da doença em humanos é observada principalmente no pulmão, fígado e rins. Neste trabalho, foi avaliado o papel da resposta imune inata na proteção contra a leptospirose usando camundongos como modelo experimental. Os animais foram infectados com L. interrogans e o desenvolvimento da doença foi acompanhado, observando-se a morte de animais C3H/HeJ, enquanto C3H/HePas apresentou icterícia e BALB/c não apresentou sintomas. O perfil de mRNA foi medido por qPCR nas amostras de rim, fígado e pulmão e as concentrações de proteinas TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, TGF-<font face=\"Symbol\">b, MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 e IL-8 foram analisadas por ELISA em extratos dos tecidos e no soro. Os resultados demonstraram que L. interrogans estimula a expressão prematura de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, TGF-<font face=\"Symbol\">b, MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 e IL-8 na linhagem BALB/c resistente à infecção. A análise histológica indica que estes mediadores podem estar relacionados com o influxo de diferentes células do sistema imune desempenhando importantes funções na proteção contra leptospirose. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by Leptospira. The pathogenesis in humans is mainly observed in lungs, livers and kidneys. In this work the role of innate immune response in protection against leptospirosis is being studied using different mice models. The animals were infected intraperitoneally with virulent cells of L. interrogans serovar Copenhageni and the development of the disease was followed, being observed mortality of C3H/HeJ mice, whereas C3H/HePas presented jaundice and BALB/c mice remained asymptomatic. Samples of liver, kidney, lungs and sera were analyzed following the profiles of mRNA and protein of the cytokines TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; and TGF-<font face=\"Symbol\">b and chemokine MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 and CXCL1/IL-8. We showed that Leptospira infection stimulates early expression of cytokine TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; and TGF-<font face=\"Symbol\">b and chemokine MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 and IL-8 in the resistant mice strain BALB/c. Histological analysis indicates that the expression of those molecules can be related to the influx of distinct immune cells, which play a role in the naturally acquired protective immunity.

A proteína Cpn60 faz parte de um grupo de proteínas altamente conservadas que estão envolvidas em funções celulares essenciais. camundongos BALB\\c foram imunizados com 5 ou 10 µg da proteína recombinante (Cpn60r) sozinha ou adicionada à vacina DTP sem hidróxido de alumínio (NADTP). A vacina DTP do Instituto Butantan (DTP) foi usada como controle. Foi avaliada a produção de citocinas por células esplênicas após reestímulo in vitro com a Cpn60r. Os animais foram desafiados após o protocolo de imunização. A Cpn60r sozinha ou misturada à vacina NADTP foi capaz de induzir níveis de anticorpos contra pertussis mais altos do que os induzidos pela DTP. Os níveis de IgG1 e IgG2a foram similares para todos os grupos. Pôde-se observar a produção de de IL-6 e IFN-&#947 nos grupos imunizados com Cpn60r. Os grupos imunizados com Cpn60r+NADTP apresentaram um índice de proteção entre 60 e 80% contra o desafio pela bactéria virulenta, semelhante ao grupo imunizado com DTP. A proteína Cpn60r é bastante promissora não somente como imunógeno, mas também como adjuvante. / The Cpn60 protein is a member of a group of higly conserved proteins linked to essencial cell functions. The Cpn60 was cloned, expressed and its immune response has been evaluated. BALB\\c mice were immunized with 5 or 10 µg of the recombinant protein (Cpn60r) alone or mixed with DPT vaccine without aluminum hidroxyde (NADPT). The DPT vaccine from Instituto Butantan was used as control. We evaluated the cytokines production by spleen cells after they have been reestimulated in vitro with Cpn60r. The animals were challenged after the immunization protocol. The Cpn60r alone or mixed with NADPT vaccine was able to induce higher antibodies levels than DPT. IgG1 and IgG2a levels were similar in all groups. We could detect levels of IL-6 and IFN-&#947 on groups immunized with Cpn60r. The groups immunized with Cpn60r+NADTP showed a 60 and 80% protection rate against the challenge with the live bacteria, similar to the group immunized with DPT. These results show the immune response of the recombinant protein that could be included in immunization protocols for pertussis.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira. A patogênese da doença em humanos é observada principalmente no pulmão, fígado e rins. Neste trabalho, foi avaliado o papel da resposta imune inata na proteção contra a leptospirose usando camundongos como modelo experimental. Os animais foram infectados com L. interrogans e o desenvolvimento da doença foi acompanhado, observando-se a morte de animais C3H/HeJ, enquanto C3H/HePas apresentou icterícia e BALB/c não apresentou sintomas. O perfil de mRNA foi medido por qPCR nas amostras de rim, fígado e pulmão e as concentrações de proteinas TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, TGF-<font face=\"Symbol\">b, MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 e IL-8 foram analisadas por ELISA em extratos dos tecidos e no soro. Os resultados demonstraram que L. interrogans estimula a expressão prematura de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, TGF-<font face=\"Symbol\">b, MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 e IL-8 na linhagem BALB/c resistente à infecção. A análise histológica indica que estes mediadores podem estar relacionados com o influxo de diferentes células do sistema imune desempenhando importantes funções na proteção contra leptospirose. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by Leptospira. The pathogenesis in humans is mainly observed in lungs, livers and kidneys. In this work the role of innate immune response in protection against leptospirosis is being studied using different mice models. The animals were infected intraperitoneally with virulent cells of L. interrogans serovar Copenhageni and the development of the disease was followed, being observed mortality of C3H/HeJ mice, whereas C3H/HePas presented jaundice and BALB/c mice remained asymptomatic. Samples of liver, kidney, lungs and sera were analyzed following the profiles of mRNA and protein of the cytokines TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; and TGF-<font face=\"Symbol\">b and chemokine MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 and CXCL1/IL-8. We showed that Leptospira infection stimulates early expression of cytokine TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; and TGF-<font face=\"Symbol\">b and chemokine MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 and IL-8 in the resistant mice strain BALB/c. Histological analysis indicates that the expression of those molecules can be related to the influx of distinct immune cells, which play a role in the naturally acquired protective immunity.

Xylella fastidiosa (Xf) e Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) são gama proteobactérias gram negativas, responsáveis por grandes perdas econômicas no setor citrícola brasileiro. Com seus genomas seqüenciados e anotados, fizemos uma análise comparativa entre suas composições gênicas e seus ambientes de vida. Xac apresenta um genoma de 5.2Mb contra 2.7Mb de Xf Isto reflete no número de genes (4432 contra 2838) que acabam refletindo em uma maior complexidade metabólica de Xac, caracterizada por: uma extensa gama de genes de degradação de parede celular (44), biossíntese de proteases (92), genes de funções regulatórias (296), um completo metabolismo energético (209), quimiotático (inexistente em Xf) e secretório (presença dos tipos I, II, III e IV , sendo o II em duplicata), além de um grande número de genes envolvidos com captação de ferro (65), fazem de Xac um patógeno de alto poder invasivo e de rápida propagação e virulência Em contrapartida, Xf por não possuir a complexidade supracitada, parece ter seus recursos adaptados ao ambiente em que vive, como por exemplo um alto número de genes envolvidos com biossíntese de pili, que associado à biossíntese de goma, favorecem sua adesão nas glândulas salivares do vetor (cigarrinha) e a formação de aglomerados celulares responsáveis pelo entupimento dos vasos que levam às patologias decorrentes do evento. / Xylella fastidiosa (Xf) and Xanthomonas axonopodis pv. citri Xac are gram negative gamma proteobacteria, responsible for great economical losses in the Brazilian citrus sector. With their sequenced and annotated genomes, we have done a comparative analysis between their genetic composition and life habitat. Xac displays a genome of 5.2Mb against 2. 7Mb of Xf. This reflects the number of genes (4432 against 2838) which results in a greater metabolic complexity of Xac, characterized by: a wide range of genes of cell wall degradation (44), biosynthesis of proteases (92), many genes of regulatory functions (296), a complex energy metabolism (209), chemotatic (absent in Xf) and secretory systerns (presence of types I, II, III and IV, type II in duplicate), besides a great number of genes involved in iron acquisition (65), make of Xac a pathogen of high invasive power and of quick spreading and virulence. In the other hand Xf, due to the lack of the complexity just cited, seems to have its resources adapted to the habitat in which it lives, as for example a large number of genes involved in pili biosynthesis, that associated with gum biosynthesis, favor its adhesion to the salivary glands of the vector (sharpshooter) and the formation of cellular agglomerations responsible for the blockage of the vessels which leads to the pathologies resulted from this event.

Xylella fastidiosa (Xf) e Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) são gama proteobactérias gram negativas, responsáveis por grandes perdas econômicas no setor citrícola brasileiro. Com seus genomas seqüenciados e anotados, fizemos uma análise comparativa entre suas composições gênicas e seus ambientes de vida. Xac apresenta um genoma de 5.2Mb contra 2.7Mb de Xf Isto reflete no número de genes (4432 contra 2838) que acabam refletindo em uma maior complexidade metabólica de Xac, caracterizada por: uma extensa gama de genes de degradação de parede celular (44), biossíntese de proteases (92), genes de funções regulatórias (296), um completo metabolismo energético (209), quimiotático (inexistente em Xf) e secretório (presença dos tipos I, II, III e IV , sendo o II em duplicata), além de um grande número de genes envolvidos com captação de ferro (65), fazem de Xac um patógeno de alto poder invasivo e de rápida propagação e virulência Em contrapartida, Xf por não possuir a complexidade supracitada, parece ter seus recursos adaptados ao ambiente em que vive, como por exemplo um alto número de genes envolvidos com biossíntese de pili, que associado à biossíntese de goma, favorecem sua adesão nas glândulas salivares do vetor (cigarrinha) e a formação de aglomerados celulares responsáveis pelo entupimento dos vasos que levam às patologias decorrentes do evento. / Xylella fastidiosa (Xf) and Xanthomonas axonopodis pv. citri Xac are gram negative gamma proteobacteria, responsible for great economical losses in the Brazilian citrus sector. With their sequenced and annotated genomes, we have done a comparative analysis between their genetic composition and life habitat. Xac displays a genome of 5.2Mb against 2. 7Mb of Xf. This reflects the number of genes (4432 against 2838) which results in a greater metabolic complexity of Xac, characterized by: a wide range of genes of cell wall degradation (44), biosynthesis of proteases (92), many genes of regulatory functions (296), a complex energy metabolism (209), chemotatic (absent in Xf) and secretory systerns (presence of types I, II, III and IV, type II in duplicate), besides a great number of genes involved in iron acquisition (65), make of Xac a pathogen of high invasive power and of quick spreading and virulence. In the other hand Xf, due to the lack of the complexity just cited, seems to have its resources adapted to the habitat in which it lives, as for example a large number of genes involved in pili biosynthesis, that associated with gum biosynthesis, favor its adhesion to the salivary glands of the vector (sharpshooter) and the formation of cellular agglomerations responsible for the blockage of the vessels which leads to the pathologies resulted from this event.

Orientador: Carlos Emílio Levy / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T01:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarvalhoFilho_ElioBarreto_M.pdf: 1484872 bytes, checksum: da445ed854a5a8f11143d06dd28aab5c (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: Bacilos gram-negativos não fermentadores (BGN-NFs) são microrganismos que se caracterizam pela incapacidade de utilizar a glicose como fonte de energia pela fermentação, degradando-a pela via oxidativa. A identificação dos BGN-NFs continua sendo um desafio para os laboratórios de rotina em microbiologia pela dificuldade de identificação, em virtude, da baixa ocorrência em amostras ambulatoriais, assim como, pela falta de recursos rápidos, eficientes e pela complexidade e alto custo dos testes de identificação. Estes microrganismos têm importância clínica para pacientes imunocomprometidos com infecções sistêmicas e pacientes com Fibrose Cística, com infecções oportunistas pulmonares. Nosso objetivo foi utilizar técnicas fenotípicas e de espectrometria de massas para identificar BGN-NFs pouco frequentes isolados em amostras clínicas de pacientes com FC e de pacientes internados no Hospital de Clínicas-Unicamp. Método: Foram analisados 71 isolados de amostras clínicas recuperadas do Banco de bactérias do Laboratório de Microbiologia do HC-Unicamp, envolvendo Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Cupriavidus pauculus, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, identificados por técnicas fenotípicas (provas bioquímicas manuais padronizadas pelo Laboratório de Microbiologia [método fenotípico manual] e automatizadas pelo Vitek®2, Phoenix¿) e por espectrometria de massa MALDI-TOF MS (BioMerieux®) e MALDI BD (Becton& Dickson®). Para 41 isolados de Ralstonia spp e Ochrobactrum anthropi estes métodos também foram comparados com PCR, pois não foram encontrados oligonucleotídeos específicos para os demais BGN-NFs estudados. Resultados: pelo método Fenotípico Manual foi possível identificar ao nível de espécie 54,9% dos isolados, apenas gênero 19,7% e 25,4% não puderam ser identificados. Houve uma baixa concordância entre as técnicas Fenotípica Manual e a Automatizada Vitek®2, sendo de 50,7%, quando considerada a concordância pelo menos ao nível de gênero. A maior concordância verificou-se entre os dois equipamentos de MALDI-TOF, de 87,3%, quando considerada a concordância pelo menos ao nível de gênero. Discussão: Quando comparamos todos os métodos utilizados para identificação dos 71 isolados encontramos uma concordância simultânea de 23,9% (17/71), quando considerado pelo menos ao nível de gênero e apenas 2 (2,8%) ao nível de espécie. Quando comparamos os métodos Fenotípico Manual, Vitek®2, Phoenix®, MALDI MS, MALDI BD e incluindo PCR para a identificação de 41 amostras de Ralstonia spp e Ochrobactrum anthropi, encontramos uma concordância simultânea de 19,5% (8/41) quando considerado pelo menos ao nível de gênero e 2 (2,8%) de espécie. Possíveis justificativas para a baixa concordância entre as metodologias seriam a diversidade de princípios, de acurácia e de bancos de dados dos métodos. Conclusão: É muito baixa a concordância entre as diferentes metodologias utilizadas, sendo que os equipamentos de MALDI-TOF possuem entre si uma correlação muito boa para identificação de BGN-NFs, porém mostram-se discordantes aos níveis de confiança dos resultados. Foi encontrada uma importante limitação na PCR apresentando reação cruzada com gêneros testados, sugerindo não ser confiável para este fim. Para os gêneros estudados e as metodologias empregadas, a discordância dos resultados sugerem cautela pela possibilidade de erro de identificação / Abstract: Introduction: Gram-negative non-fermenting (GN-NFB) are microorganisms that are characterized by the inability to use glucose by fermentation as an energy source, degrading it by the oxidative pathway. The identification of BGN-NFS remains a challenge for the routine of microbiology laboratories, due to the low occurrence in outpatient samples, the lack of fast and efficient resources and the complexity and high cost of the tests. These microorganisms are clinically important for immunocompromised patients with systemic infections and patients with Cystic Fibrosis, with opportunistic pulmonary infections. Our goal was to use phenotypic and mass spectrometry techniques to identify uncommon GN-NFB isolated in samples from CF patients and patients admitted to the Hospital de Clinicas Unicamp. Method: 71 isolates recovered from clinical specimens were selected from the from the Microbiology Laboratory bacteria collection, previously identified by fenotipic methods as Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Cupriavidus pauculus, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa. The samples were identified by in house Phenotypic manual method, automated by Vitek®2, by Phoenix¿ and MALDI-TOF mass spectrometry MS (BioMerieux®) and MALDI BD (Becton Dickson®). These methods were also compared to PCR for only 41 isolates of Ralstonia spp and Ochrobactrum anthropi, because they were not found specific primers for the other GN-NFB analised. Results: the phenotypic Manual method identified to species level 54.9% of the isolates, 19.7% only to genera and 25.4% were not identified. There was a poor correlation between the techniques phenotypic Manual method and Automated Vitek®2, with 50.7% of agreement, when considering at least in terms of gender. The best agreement of 87.3% occurred between the results of the two MALDI-TOF equipment, when considering the correlation of at least at the level of genus. Discussion: When comparing all the methods used for the identification of 71 isolates were found simultaneous agreement of 23.9% (17/71) when considered at least to genus level and only 2 (2.8%) to species level. When analyzed the phenotypic Manual method, Vitek®2, Phoenix®, MALDI MS, MALDI BD and PCR applied to 41-GN-NFB samples, simultaneous agreement were found for 19.5% (8/41) when considered at least to genus level and 2 (2.8%) to species. Possible reasons for the low agreement between the methodologies could be the diversity of principles, accuracy and databases of the methods. Conclusion: The two methods of MALDI-TOF have a very good correlation for GN-NFB identification, however showed discordance for the confidence levels of results. With the primers tested one important limitation of the PCR is the cross-reaction among many genera, suggesting not to be safe for the discrimination of the analyzed genera. For the genera and methods analised the discrepancy of results suggests caution because of the possibility of wrong identification / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Ciências

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico &#963;32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem. / In Caulobacter crescentus, the groESL operon presents a dual type of control. Heat shock induction of the operon is dependent on the heat shock sigma factor &#963;-32. At physiological temperatures, groESL expression is cell cycle regulated and the control involves the repressor protein HrcA and the element CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin ~xpression). To study the activity of HrcA in vitro, we produced and purified from E. coli a histidine-tagged version of the protein, and specific binding to the CIRCE element was analyzed in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). The amount of retarded DNA increased significantly in the presence of GroES/GroEL, suggesting that these proteins modulate HrcA activity. Further evidence of this modulation was obtained using lacZ transcription fusions with the groESL regulatory region in C. crescentus cells producing different amounts of GroES/GroEL. The mutants proteins HrcA Pro81Ala and HrcA Arg87Ala, that contain amino acid substitutions in the putative DNA-bindíng domain of the protein, were found to be deficient in binding to CIRCE in vitro and in vivo. Furthermore, HrcA Ser56Ala expressed together with the wild type protein within the same cell, produced a dominant-negative phenotype, indicating that C. crescentus HrcA binds to CIRCE in an oligomeric form, most likely as a dimer. Attempts to obtain null mutants for groESL or dnaKJ were unsuccessful indicating the importance of GroES/GroEL and DnaK/lDnaJ to the survival of C. crescentus cells. Conditional mutants were then constructed in our laboratory in which groESL and dnaKJ expression is under the control ofaxylose inducible promoter (PxyIX) , giving rise to strains SG300 and SG400, respectively. These strains were characterized in regard to their morphology under permissive and restrictive conditions, as well as their viability under different types of environmental stresses. SG300 cells depleted of GroES/GroEL are resistant to heat shock at 42°C and can acquire some thermotolerance, but they are sensitive to oxidative, saline and osmotic stresses. SG400 cells depleted of DnaKlJ are quite sensitive to heat shock, ethanol and freezing, and are unable of acquiring thermotolerance. Cells depleted of either GroES/EL or DnaKlJ also present morphological problems. SG300 cells depleted of GroES/EL form long and pinched filaments. SG400 cells depleted of DnaKlJ are only somewhat more elongated than wild-type predivisional cells and most cells do not present septum. These observations indicate a cell division arrest, which should occur at different stages in each strain.

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico &#963;32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem. / In Caulobacter crescentus, the groESL operon presents a dual type of control. Heat shock induction of the operon is dependent on the heat shock sigma factor &#963;-32. At physiological temperatures, groESL expression is cell cycle regulated and the control involves the repressor protein HrcA and the element CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin ~xpression). To study the activity of HrcA in vitro, we produced and purified from E. coli a histidine-tagged version of the protein, and specific binding to the CIRCE element was analyzed in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). The amount of retarded DNA increased significantly in the presence of GroES/GroEL, suggesting that these proteins modulate HrcA activity. Further evidence of this modulation was obtained using lacZ transcription fusions with the groESL regulatory region in C. crescentus cells producing different amounts of GroES/GroEL. The mutants proteins HrcA Pro81Ala and HrcA Arg87Ala, that contain amino acid substitutions in the putative DNA-bindíng domain of the protein, were found to be deficient in binding to CIRCE in vitro and in vivo. Furthermore, HrcA Ser56Ala expressed together with the wild type protein within the same cell, produced a dominant-negative phenotype, indicating that C. crescentus HrcA binds to CIRCE in an oligomeric form, most likely as a dimer. Attempts to obtain null mutants for groESL or dnaKJ were unsuccessful indicating the importance of GroES/GroEL and DnaK/lDnaJ to the survival of C. crescentus cells. Conditional mutants were then constructed in our laboratory in which groESL and dnaKJ expression is under the control ofaxylose inducible promoter (PxyIX) , giving rise to strains SG300 and SG400, respectively. These strains were characterized in regard to their morphology under permissive and restrictive conditions, as well as their viability under different types of environmental stresses. SG300 cells depleted of GroES/GroEL are resistant to heat shock at 42°C and can acquire some thermotolerance, but they are sensitive to oxidative, saline and osmotic stresses. SG400 cells depleted of DnaKlJ are quite sensitive to heat shock, ethanol and freezing, and are unable of acquiring thermotolerance. Cells depleted of either GroES/EL or DnaKlJ also present morphological problems. SG300 cells depleted of GroES/EL form long and pinched filaments. SG400 cells depleted of DnaKlJ are only somewhat more elongated than wild-type predivisional cells and most cells do not present septum. These observations indicate a cell division arrest, which should occur at different stages in each strain.