WW domain-containing oxidoreductase WWOX, a putative tumor suppressor, has been suggested to be involved in the hyperphosphorylation of Alzheimer¡¦s tau. Tau is a microtubule-associated protein which plays an important role in microtubule assembly and stability. GSK-3b regulates tau by phosphorylation as well as by regulating splice variance. Hyperphosphorylated tau has less affinity toward the microtubules and disrupting microtubule stability. By bioinformatics analysis, we found that WWOX has three GSK3£] binding motifs, FXXXLI/VXRLE. The results of immunoprecipitation demonstrated that WWOX interacted physically with GSK3£], which was supported by the colocalization of WWOX and GSK3£] in immunofluorescence study. Using in vitro GST pull down assay, we demonstrated that WWOX can bind directly to GSK3£] through its ADH/SDR domain. The site-direct mutagenesis was performed to locate the GSK3£] binding sequences within the ADH/SDR domain precisely. By in vitro kinase assay, we found that WWOX can inhibit Ser396 and Ser404 phosphorylation of Tau by GSK3£] in a dose- and time- dependent manner, indicating that WWOX may be involved in regulating GSK3£] activity in cells. It has been demonstrated that inhibition of GSK3£] plays an essential role during neuron differentiation. By in vitro MT formation assay, we showed that GSK3£] hyperphospohorylated Tau failed to promote tubulin polymerization. Together with the Tau hyperphosphorylation inhibited its function to promote microtubule formation and neurite outgrowth, we investigated the effect of WWOX in neuron differentiation. Interestingly, overexpression of WWOX enhanced the SH-SY5Y differentiation with or without retinoic acid treatment. SH-SY5Y cells increase expression of WWOX and decrease expression of pTau S396 as they differentiate in culture. RNAi-mediated knockdown of WWOX in RA-differentiated SH-SY5Y cells caused a decrease in neurite outgrowth. Furthermore, inhibition of GSK3 by Bio enhanced SH-SY5Y differentiation and overexpression of GSK3£] caused a decrease in neurite outgrowth. We concluded that WWOX may be involved in regulating GSK3£] activity to reduce the level of phosphorylated Tau that subsequently promoted the neurite outgrowth during neuron differentiation.

Alzheimer¡¦s disease (AD), one of the most common dementia, is characterized by the formation two types of aggregation in the brain: senile plaques and neurofibrillary tangles (NFTs). NFTs are composed of hyperphosphorylated Tau. Tau protein mainly expressed in brain and was identified as one of the microtubule-associated proteins (MAPs). Hyperphophorylation on Tau affects its binding to tubulin and capacity to promote microtubule assembly. A number of proline-directed kinase capable of phosphorylating PHF-Tau have been identified, including Glycogen Synthase Kinase-3£] (GSK-3£]). Here we demonstrated that GSK3£] can co-purify with PHFs and can co-localize with Tau in vitro in N18 cells. To examine the phosphorylation mechanism of Tau by GSK-3£], N-terminal, C-terminal, T231A, T231E, 154~441, S396A, S400A, S404A, S413A and S396A S400A mutants of Tau were used, respectively. We were able to demonstrate that phosphorylation on Thr231 and Ser404 in Tau may play important roles for GSK3£] phosphorylation and its functional regulation. Most importantly, we have proved that T231P motif is necessary and critical for Tau phosphorylation by GSK3£]. Moreover, we used T231E, S396E and S400E mutants of Tau to understand the functional regulation of Tau by GSK3£] phosphorylation by tubulin assembly assay. Surprisingly, we observed all of these Tau mutants can promote tubulin assembly and form tubulin bundles in N18 cells. It has been proved that Pin1 WW domain can bind to Cdc2-phosphorylated Thr-231-Pro motif of Tau and restore the ability of Tau to promote tubulin assembly. In this study, we also studied whether Pin1 can regulate GSK3£]- phosphorylated Tau. The results show that Pin1 WW domain can bind to phosphorylated Thr-231 of Tau by GSK3£] and restore the ability of Tau to promote tubulin assembly.

A atividade física (AF) demonstrou um efeito protetor contra a doença de Alzheimer (DA), mas não se sabe qual a influência da AF sobre o biomarcador de neuroproteção, a glicogênio sintase-quinase 3 (GSK3). O Objetivo do nosso estudo é avaliar o efeito do exercício físico sobre os níveis séricos da GSK3. Foi realizado um estudo observacional de corte transversal, no qual 72 idosos saudáveis e sem demência foram selecionados e divido em dois grupos de acordo com o nível de atividade física. A atividade da GSK3 foi semelhante entre os grupos estudados, houve uma tendência a maior inativação da GSK3 (fator neuroprotetor) entre os ativos e maior ativação entre os sedentários e muito ativos, porém sem significância estatística. É possível que a atividade física de baixa intensidade já tenha um efeito protetor. Uma maior população de idosos e métodos mais precisos de mensurar AF serão necessários para demonstrar efeito da AF sobre a GSK3 / The physical activity (PA) was demonstrated to have a protective effect against Alzheimers disease, but the influence of exercising on the biomarker of neuroprotection such as Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) are hitherto imprecise. This study aims at assessing the effect of PA on the serum levels of GSK3. We have performed a cross-sectional observational study with 72 healthy elders, without dementia, selected and classified into two groups according to the level of PA. The GSK3 activity resulted similar in both groups; there was a tendency of inactivation of GSK3 (neuroprotective factor) among active elders and a higher activation among sedentary and highly active elders, although without statistical significance. Its possible that low-intensity physical activity may already have a protective effect. Further studies with higher number of participants and methods more accurate to measure PA will be needed to demonstrate effect of PA on the GSK3

La stéatose hépatique non-alcoolique consiste en une accumulation de lipides dans le cytoplasme des hépatocytes. Longtemps considérée comme une pathologie bénigne, elle peut être à l’origine du développement d’un stade plus sévère : la stéatohépatite non alcoolique (NASH). La NASH s’accompagne de lésions sévères du foie liées à la genèse d’un stress oxydant, d’une inflammation et de la mort cellulaire. Le rôle de la mitochondrie est au centre de cette maladie, bien que les connaissances sur la dysfonction mitochondriale et ses conséquences sur l’apoptose soient encore insuffisantes. En effet, la mitochondrie est responsable de la dégradation des lipides par -oxydation et elle agit comme un centre intégrateur des signaux apoptotiques en déclenchant une perméabilisation des membranes mitochondriales (PMM) aboutissant à la libération de facteurs apoptogènes. Ce processus est considéré comme le point de non-retour de la voie mitochondriale de l’apoptose. Nos travaux ont porté sur la compréhension des mécanismes moléculaires liant l’apoptose hépatocytaire mitochondriale et la stéatose. La combinaison de quatre modèles expérimentaux de stéatose (biopsies de patients, mitochondries isolées de souris obèses ob/ob ou recevant un régime hypercalorique, et lignées cellulaires) a permis de montrer, dans le foie stéatosique, une sensibilité accrue à l’induction de la PMM et une augmentation de la perméabilité de VDAC (voltage-dependent anion channel), protéine formant un canal dans la membrane externe mitochondriale. Ces observations sont associées à une diminution de la phosphorylation de VDAC sur un résidu thréonine et sa perte d’interaction avec la protéine anti-apoptotique Bcl-XL et la kinase GSK3, révélant ainsi une nouvelle voie de signalisation par les lipides. Cette découverte s’est notamment appuyée sur l’utilisation de tests fonctionnels en mitochondries isolées que nous avions développés et validés dans plusieurs études aux stratégies expérimentales variées. En conclusion, notre étude permet de mieux comprendre la fragilité mitochondriale lipo-induite, stade précédant l’apoptose hépatocytaire, et ouvre des perspectives à visée biomédicale. / Non-alcoholic steatosis is a liver disease characterized by lipid accumulation in the cytoplasm of hepatocytes. For a long time, it has been considered as a benign condition. Now it is known that it can precede the development of a severe stage, non-alcoholic steatohepatitis (NASH). NASH is accompanied by severe dammages of the liver linked to the genesis of oxidative stress, inflammation and cell death. Mitochondrion is a central player of this disease; however, the knowledge of mitochondrial dysfunction and its consequences on apoptosis is still insufficient. Indeed, mitochondria are responsible for lipid degradation by -oxidation. Mitochondria act as a central integrator of apoptotic signals by triggering the mitochondrial membrane permeabilization (MMP) leading to the release of apoptogenic factors. This process is considered as the point of no return of the mitochondrial pathway of apoptosis. We aimed to better understand the molecular mechanisms linking mitochondrial liver apoptosis and steatosis. Combination of four experimental models of steatosis (human biopsies, isolated mitochondria from ob/ob obese mice, high fat diet-fed mice or hepatic cell lines) displayed, in steatotic livers, increased sensitivity to MMP induction and permeability of VDAC (Voltage dependent anion channel), a protein which forms a channel in the outer mitochondrial membrane. These findings are associated with the hypo-phosphorylation of VDAC on a threonine residue and the loss of its interaction with the anti-apoptotic Bcl-XL and GSK3 kinase, thus revealing a new lipid-induced signaling pathway. Our work is based on the use of functional assays on isolated mitochondria that we have developed and validated in several studies involving various strategies. To conclude, our study increases the knowledge on the lipid-induced mitochondrial weakness preceding hepatic apoptosis and opens perspectives in biomedical applications

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A atividade física (AF) demonstrou um efeito protetor contra a doença de Alzheimer (DA), mas não se sabe qual a influência da AF sobre o biomarcador de neuroproteção, a glicogênio sintase-quinase 3 (GSK3). O Objetivo do nosso estudo é avaliar o efeito do exercício físico sobre os níveis séricos da GSK3. Foi realizado um estudo observacional de corte transversal, no qual 72 idosos saudáveis e sem demência foram selecionados e divido em dois grupos de acordo com o nível de atividade física. A atividade da GSK3 foi semelhante entre os grupos estudados, houve uma tendência a maior inativação da GSK3 (fator neuroprotetor) entre os ativos e maior ativação entre os sedentários e muito ativos, porém sem significância estatística. É possível que a atividade física de baixa intensidade já tenha um efeito protetor. Uma maior população de idosos e métodos mais precisos de mensurar AF serão necessários para demonstrar efeito da AF sobre a GSK3 / The physical activity (PA) was demonstrated to have a protective effect against Alzheimers disease, but the influence of exercising on the biomarker of neuroprotection such as Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) are hitherto imprecise. This study aims at assessing the effect of PA on the serum levels of GSK3. We have performed a cross-sectional observational study with 72 healthy elders, without dementia, selected and classified into two groups according to the level of PA. The GSK3 activity resulted similar in both groups; there was a tendency of inactivation of GSK3 (neuroprotective factor) among active elders and a higher activation among sedentary and highly active elders, although without statistical significance. Its possible that low-intensity physical activity may already have a protective effect. Further studies with higher number of participants and methods more accurate to measure PA will be needed to demonstrate effect of PA on the GSK3

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une pathologie hématologique dont le pronostic reste très défavorable, malgré les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-tendant son développement. Identifier de nouvelles stratégies anti-leucémiques représente donc une étape clé dans la concrétisation des avancées thérapeutiques. Grâce à la combinaison de plusieurs approches de criblage génétiques et pharmacologiques, l’objectif de ma thèse a été de définir et valider de nouvelles cibles thérapeutiques dans les LAM. La première partie de ma thèse a eu pour but de transposer en clinique l’inhibition de la Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3). La stabilisation de la β-caténine secondaire à l'inhibition concomitante des deux paralogues de GSK3, représente un obstacle à l’utilisation clinique de cette classe thérapeutique. Mettant à profit la présence d'un «switch» Asp133 à Glu196 dans les domaines de liaison ATP de GSK3, nous avons identifié un inhibiteur sélectif du paralogue GSK3α et mené des études précliniques validant le BRD0705 comme nouveau traitement pro-différenciant dans les LAM. De plus, une combinaison de profilage métabolomique et d'approches de criblage haut débit à l’aide d’une banque de shRNA a permis d'identifier un nouveau lien entre EVI-1, la voie de la créatine kinase et la voie de signalisation GSK3. La deuxième partie de ma thèse a porté sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques en utilisant une approche de criblage par banque de shRNA dans le modèle murin de LAM porteur de la translocation MLL-AF9. VCP, une AAA-ATPase, a ainsi été identifiée puis validée comme cible thérapeutique. Nous avons montré que VCP orchestre la génération d'une plateforme à ADN simple brin recouverte de RPA, ce qui entraîne l'activation de la kinase ATM et la HR. Dans leur ensemble, nos découvertes permettent une meilleure compréhension de la biologie des LAM et participeront ainsi à l’amélioration des traitements futurs de cette pathologie. / Despite the significant progress made in understanding Acute Myeloid Leukemia oncogenesis over the last decades, this disease remains devastating and the overall five-year survival does not exceed 17%. Developing new translational research strategies focused on the identification of druggable oncogenic targets is critical to continued progress in AML treatment. The goal of this work was to define and validate novel leukemia-specific dependencies using small-molecule inhibitors and RNA-interference-based high-throughput screening methods.The first part of my thesis work aimed at translating Glycogen synthase kinase 3 (GSK3) inhibition into the clinic. Mechanism-based toxicities, driven in part by the inhibition of both GSK3 paralogs and subsequent β-catenin stabilization, were a concern in the clinical translation of this target candidate. Specific knock-down of GSK3α or GSK3β alone does not increase β-catenin, thereby offering a conceptual resolution to GSK3 targeting. The design of selective ATP-competitive inhibitors posed a drug discovery challenge due to the high homology in the GSK3α and GSK3β ATP binding domains. Taking advantage of an Asp133 ® Glu196 “switch” in the GSK3 paralog hinge binding domains, we identified a first-in-class GSK3α selective inhibitor and conducted preclinical studies validating BRD0705 as a promising new differentiation therapy in AML. In addition, a combination of a metabolomic profiling and a pooled shRNA screening method identified a new interplay between the oncogene EVI-1, the creatine kinase pathway and GSK3 signaling. The second part of my studies focused on identification of new therapeutic targets using an in vivo pooled shRNA screening approach in the MLL-AF9-driven AML mouse model. VCP, an AAA-ATPase, was thus identified and validated as a top target. We demonstrated that VCP orchestrates RPA-coated-single-stranded-DNA platform generation, resulting in ATM kinase activation and subsequent HR. Taken together, our discoveries increased our understanding of AML biology and may therefore contribute to novel and more efficacious treatments for this highly aggressive and lethal disease.

Depuis leur découverte, les glycogènes synthase kinases 3 (GSK3) ont été associées à de multiples fonctions cellulaires, incluant notamment la prolifération et la survie cellulaire. La délétion homozygote de GSK3? chez les souris est létale au stade embryonnaire E13,5 et il a été démontré que l'apoptose massive des hépatocytes due à une hypersensibilité au TNF? serait la principale cause de la létalité suggérant que l'activité de GSK3? est nécessaire pour la survie cellulaire. Plusieurs études suggèrent une activité des GSK3 plus élevée dans certains types de cancers, particulièrement au niveau des adénocarcinomes pancréatiques. Différentes études proposent que les GSK3 pourraient réguler la voie NF?B et influencer la prolifération et la survie des cellules pancréatiques tumorales. Mes travaux de maîtrise visaient à déterminer le rôle des GSK3 dans la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Dans un premier temps, l'inhibition prolongée (24 à 72h) de l'activité des GSK3 a permis d'observer une diminution de l'activité métabolique des cellules pancréatiques tumorales humaines : MIA PaCa2 et PANC-1. Cette diminution semble être due en partie à une induction de l'apoptose et à une inhibition de la prolifération cellulaire. En effet, l'inhibition des GSK3 induit l'apoptose chez les cellules pancréatiques tumorales humaines (MIA PaCa2, PANC-1 et BxPC3) après 48 et 72h, mais non chez les cellules d'origine non-tumorale (HPDE6 et HEK293T). L'étude plus approfondie du mécanisme moléculaire de l'apoptose induit suite à l'inhibition des GSK3 par l'inhibiteur pharmacologique spécifique SB216763 démontre 1- l'activation des caspases 3 et 7, 2- l'augmentation de l'homologue BCL-2 pro-apoptotique BIM et 3- la diminution de l'homologue anti-apoptotique BCL-2. L'analyse des voies de signalisation associées à la survie cellulaire et à l'apoptose suite à l'inhibition des GSK3 a permis d'observer l'activation de la voie JNK-c-Jun qui contribuerait potentiellement à l'induction de l'apoptose. À cet égard, nous avons observé que la voie JNK est nécessaire 1- au clivage de PARP, 2- à l'activation de la caspase 7 et 3- à l'augmentation de BIM induit par l'inhibition des GSK3. De plus, la diminution de l'expression de c-Jun, une cible des JNK, à l'aide d'un siARN prévient la modulation de BIM par l'inhibition des GSK3, alors que l'induction de l'apoptose n'est pas bloquée. Donc, l'activation de la voie JNK-c-Jun semble également nécessaire à la régulation de l'homologue BCL-2 proapoptotique BIM. Nous avons ensuite observé que la voie MEKK1-JNK-c-Jun semble insuffisante pour induire l'apoptose des cellules PANC-1, suggérant que l'activation de la voie JNK pourrait requérir la régulation de d'autres voies afin d'induire l'apoptose. Dans un deuxième temps, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h inhibe la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. En effet, nous avons observé que l'inhibition des GSK3 pendant 16h empêche l'atteinte du point de restriction en phase G1 du cycle cellulaire. Nous avons observé qu'en réponse au sérum les GSK3 sont inactivées de façon transitoire (0- 10h) avant d'être réactivées (10-16h). L'inhibition de l'activité des GSK3 lors de leur réactivation (10-16h) par le SB216763 prévient 1- l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et 2- l'augmentation d'E2F1 induites par le sérum et 3- diminue l'expression d'E2F4, suggérant un rôle des GSK3 dans la phase G1 tardive du cycle cellulaire. Également, nous avons observé la présence de complexes formés de GSK3-pRb et de GSK3?-E2F4 dans les cellules pancréatiques tumorales humaines. Ces observations suggèrent que l'activité des GSK3 pourrait contribuer à l'hyperphosphorylation de pRb et de p130 et pourrait également réguler directement l'activité des E2F. Bref, ces résultats suggèrent que l'activité des GSK3 est essentielle pour la survie et la prolifération des cellules pancréatiques tumorales humaines. Les auteurs suggèrent donc que l'inhibition des GSK3 pourrait s'avérer un traitement potentiel du cancer pancréatique, en ciblant les cellules cancéreuses. [Symboles non conformes]

Plusieurs études ont suggéré une implication des glycogène synthase kinases 3 (GSK3) dans la carcinogenèse, notamment du pancréas. Des études ont rapporté des résultats contradictoires quant à l’impact des GSK3 sur la survie cellulaire. Au niveau du pancréas, il a été observé que l’inhibition des GSK3 inhibe la croissance entre autres via la régulation de la voie JNK ou NFkB. Les inhibiteurs des GSK3 sont présentement à l’étude comme traitement de différentes pathologies, notamment pour le cancer pancréatique. Une meilleure compréhension des voies de signalisation régulées par les GSK3 sera donc nécessaire. Nous avons entrepris ces travaux afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de la survie des cellules pancréatiques tumorales par les GSK3. Nous avons démontré que l’inhibition des GSK3 induit l’apoptose et l’autophagie dans les cellules pancréatiques tumorales humaines. L’inhibition des GSK3 stimule l’autophagie autant dans les cellules pancréatiques tumorales que non tumorales, alors que l’apoptose est induite spécifiquement dans les cellules tumorales. Contrairement à l’apoptose, l’autophagie est induite indépendamment de la voie JNK-cJUN suite à l’inhibition des GSK3. Nos résultats démontrent que l’inhibition des GSK3 mène à l’inactivation de la voie mTORC1 qui pourrait contribuer à l’induction de l’autophagie. D’autre part, nos travaux ont démontré pour la première fois que les GSK3 régulent le facteur de transcription EB (TFEB) dans les cellules pancréatiques tumorales. En effet, l’inhibition des GSK3 entraîne la déphosphorylation de TFEB, notamment sur la Ser211, la dissociation des 14-3- 3 et sa translocation nucléaire. Nos résultats suggèrent que la régulation de TFEB par les GSK3 impliquerait des Ser/Thr phosphatases et pourrait être indépendante de l’activité mTORC1. L’inhibition de l’autophagie ou la déplétion de l’expression de TFEB sensibilise les cellules pancréatiques tumorales à l’apoptose induite suite à l’inhibition des GSK3 suggérant un rôle pro-survie de l’autophagie et de TFEB dans ces cellules. Enfin, l’inhibition des GSK3 semble mener à l’inhibition de la glycolyse qui contribuerait à l’induction de l’apoptose. En résumé, nos résultats démontrent que l’inhibition des GSK3 induit à la fois des signaux pro-apoptotiques et pro-survie suggérant que l’équilibre entre ces signaux dicterait l’impact des GSK3 sur la survie des cellules pancréatiques tumorales humaines.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.