Le virus de l’hépatite C (VHC) est un problème mondial. La majorité des personnes infectées (70-85%) développent une infection chronique qui cause des complications hépatiques. Le seul régime thérapeutique approuvé pour le VHC est l'interféron alpha (IFN-α). Ce traitement a un taux de réussite de 50-80% selon le génotype de virus et le moment de l'initiation de la thérapie. Les facteurs régissant la réponse au traitement ne sont pas bien définis. Des études antérieures ont suggéré un rôle potentiel de la réponse immunitaire de l'hôte au succès de la thérapie, toutefois, ces résultats sont controversés. Nous avons émis l'hypothèse que la réponse immunitaire de l’hôte sera plus efficace chez les patients qui commencent la thérapie tôt pendant la phase aiguë de l'infection. En revanche, la réponse immunitaire sera épuisée lorsque le traitement est initié pendant la phase chronique. L'objectif principal de ce mémoire est d’étudier les facteurs immunologiques qui régissent la réponse à la thérapie, et de déterminer si la contribution de la réponse immunitaire de l'hôte peut être influencée par la période de l'infection. Nos résultats démontrent l'efficacité de la restauration de la réponse immunitaire spécifique au VHC lorsque la thérapie par l'interféron est initiée tôt. Ceci est démontré par le sauvetage des cellules T efficaces spécifiques au VHC efficace similaires à celles observées chez les individus qui ont résolu spontanément, suggérant ainsi qu'elles jouent un rôle actif dans la réponse au traitement. Toutefois, cette réponse n'a pas été restaurée chez les patients traités au cours de la phase chronique. Ces résultats ont des implications importantes dans la compréhension des mécanismes sous-jacents à la réponse aux traitements actuels et au développement des nouvelles thérapies. / Hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem worldwide. Only 15-30% of infected individuals clear the virus spontaneously, while the majority develops chronic infection that causes liver complications. The only approved therapy for HCV is interferon alpha (IFN-α) based. This therapy has a 50-80% success rate depending on the infecting virus genotype and the timing of initiation of therapy. Factors governing the response to therapy are not well defined. Previous studies have suggested a role for the host immune response in the success of therapy. However, these results were controversial. We hypothesized that host immunity has an effective role in the success of IFN-α therapy when initiated early during the acute phase of HCV infection, while late initiation during the chronic phase minimizes this role. The main objective of this thesis was to dissect the immunological factors governing the differential response to IFN-α therapy, and to determine if the contribution of the immune response to success of therapy might be influenced by the period of infection. Our results demonstrate restoration of efficient HCV-specific immune responses when therapy is initiated early during the acute phase. This is demonstrated by the rescue of functional HCV-specific T cells similar to those observed in spontaneously resolved individuals, suggesting that they may play an active role in response to therapy. However, such responses were not restored following late therapy suggesting irreversible damage to the host’s defence system with chronicity. These findings have important implications in understanding the mechanisms underlying response to current treatments and development of novel therapies.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le virus de l'hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladie chronique du foie et de carcinome hépatocellulaire. Les options thérapeutiques pour traiter l'hépatite chronique sont limitées par des coûts élevés, des effets secondaires et une résistance virale. L'entrée du HCV est la première étape d'interaction entre le virus et la cellule hôte. Elle est requise pour l'initiation, la propagation et le maintien de l'infection, ce qui en fait une cible prometteuse pour les traitements antiviraux. L'entrée du HCV nécessite l'interaction coopérative de plusieurs facteurs cellulaires, y compris CD81 et claudine-1 (CLDN1). Nous avons récemment identifié un rôle pour le récepteur à l'EGF (EGFR) et le récepteur à l'ephrine A2 (EphA2) dans l'entrée du HCV par la régulation de la formation du complexe de co-récepteurs CD81-CLDN1, ce qui suggère que la signalisation de ces récepteurs joue un rôle dans l'entrée du virus. Nous avons voulu identifier les mécanismes moléculaires de signalisation de l'EGFR requis pour l'entrée du HCV et avons identifié HRas comme un transducteur de signalisation clé de l'hôte. Des études d'imagerie ont révélées que la signalisation de HRas peut moduler la diffusion et le trafic membranaire de CD81, ce qui permet l'assemblage du complexe de récepteurs. De plus, HRas s'associe avec les récepteurs de l'hôte CD81 et CLDN1 et des facteurs d'entrée du HCV inconnus jusque là: l'intégrine beta1 et Rap2B. Le HCV profite donc de la signalisation de HRas pour l'entrée cellulaire. Ces données améliorent notre compréhension des mécanismes moléculaires de l'entrée du HCV induite par l'EGFR et ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'antiviraux.

Ce travail concerne le développement d'un système de vectorisation nanoparticulaire pour l'interférence ARN, constituant une nouvelle proposition thérapeutique applicable à des pathologies virales ou tumorales, et possiblement complémentaire aux traitements existants. La vectorisation de siRNA est ici basée sur l'enrobage multicouche de nanoparticules de phosphate de calcium, la multicouche étant constituée de dépôts alternés de PEI modifié et de siRNA. Ce système permet d'obtenir une efficacité de transfection des cellulaires cibles supérieure à celle des procédés conventionnels et une rémanence fonctionnelle in vitro jusqu'à neuf jours. Les résultats d'interférence ARN obtenus ont permis notamment d'inhiber l'infection par le virus de l'hépatite C jusqu'à 99,95%, l'inhibition de l'expression d'une protéine intrinsèque jusqu'à90,5%, et le ralentissement de la croissance cellulaire dans un modèle 3D mimant une tumeur hépatique jusqu'à 46,5%. Ces nanoparticules pourraient présenter un intérêt majeur, en offrant une action à long terme et en résolvant la plupart des difficultés rencontrées en utilisant des siRNA en thérapie.

Campylobacter jejuni is the commonest cause of bacterial foodborne gastroenteritis in industrialised countries. Despite its significance, it remains unclear how C. jejuni is disseminated in the environment, whether particular strains are more pathogenic than others, and by what routes this bacterium is transmitted to humans. One major factor hampering this knowledge is the lack of a standardised method for fingerprinting C. jejuni. Therefore, the overall aim of this project was to develop systematic and novel genotyping methods for C. jejuni. Chapter Three describes the use of single nucleotide polymorphisms (SNPs) derived from the multilocus sequence typing (MLST) database of C. jejuni and the closely related Campylobacter coli for genotyping these pathogens. The MLST database contains DNA sequence data for over 4000 strains, making it the largest comparative database available for these organisms. Using the in-house software package "Minimum SNPs", seven SNPs were identified from the C. jejuni/C. coli MLST database that gave a Simpson's Index of Diversity (D), or resolving power, of 0.98. An allele-specific real-time PCR method was developed and tested on 154 Australian C. jejuni and C. coli isolates. The major advantage of the seven SNPs over MLST is that they are cheaper, faster and simpler to interrogate than the sequence-based MLST method. When the SNP profiles were combined with sequencing of the rapidly evolving flaA short variable region (flaA SVR) locus, the genotype distributions were comparable to those obtained by MLST-flaA SVR. Recent technological advances have facilitated the characterisation of entire bacterial genomes using comparative genome hybridisation (CGH) microarrays. Chapter Four of this thesis explores the large volume of CGH data generated for C. jejuni and eight binary genes (genes present in some strains but absent in others) were identified that provided complete discrimination of 20 epidemiologically unrelated strains of C. jejuni. Real-time PCR assays were developed for the eight binary genes and tested on the Australian isolates. The results from this study showed that the SNP-binary assay provided a sufficient replacement for the more laborious MLST-flaA SVR sequencing method. The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) region is comprised of tandem repeats, with one half of the repeat region highly conserved and the other half highly diverse in sequence. Recent advances in real-time PCR enabled the interrogation of these repeat regions in C. jejuni using high-resolution melt differentiation of PCR products. It was found that the CRISPR loci discriminated epidemiologically distinct isolates that were indistinguishable by the other typing methods (Chapter Five). Importantly, the combinatorial SNP-binary-CRISPR assay provided resolution comparable to the current 'gold standard' genotyping methodology, pulsed-field gel electrophoresis. Chapter Six describes a novel third module of "Minimum SNPs", 'Not-N', to identify genetic targets diagnostic for strain populations of interest from the remaining population. The applicability of Not-N was tested using bacterial and viral sequence databases. Due to the weakly clonal population structure of C. jejuni and C. coli, Not-N was inefficient at identifying small numbers of SNPs for the major MLST clonal complexes. In contrast, Not-N completely discriminated the 13 major subtypes of hepatitis C virus using 15 SNPs, and identified binary gene targets superior to those previously found for phylogenetic clades of C. jejuni, Yersinia enterocolitica and Clostridium difficile, demonstrating the utility of this additional module of "Minimum SNPs". Taken together, the presented work demonstrates the potentially far-reaching applications of novel and systematic genotyping assays to characterise bacterial pathogens with high accuracy and discriminatory power. This project has exploited known genetic diversity of C. jejuni to develop highly targeted assays that are akin to the resolution of the current 'gold standard' typing methods. By targeting differentially evolving genetic markers, an epidemiologically relevant, high-resolution fingerprint of the isolate in question can be determined at a fraction of the time, effort and cost of current genotyping procedures. The outcomes from this study will pave the way for improved diagnostics for many clinically significant pathogens as the concept of hierarchal combinatorial genotyping gains momentum amongst infectious disease specialists and public health-related agencies.

[Truncated abstract] Around 50,000 hip and knee replacements are performed every year in Australia and this number has been increasing by around 13% annually since 1998 (Transplantation Society 2006). The incidence and number of revision surgery has increased by a similar proportion. Autogenous bone or allograft is still the gold standard grafting material and is currently used in a variety of reconstructive surgical procedures. The use of any allograft material carries with it the risk of transfer of disease from donor to recipient. These tissues can transmit the same viral and bacterial infections as blood, and the products of a single donation may be transplanted to several recipients. In contrast to blood, musculoskeletal tissues may come from surgical and cadaveric donation. Overall, the prevention of infection relies on the maintenance of rigid protocols for procurement, donor and allograft testing, secondary sterilisation, and the adherence to internal safety standards within the tissue banks. This thesis aims to determine the risk of viral infection among musculoskeletal tissue donors in Australia. We retrieved and analysed data retrospectively from three large tissue banks in Australia (Perth, Queensland, Victoria). This includes 12,415 musculoskeletal tissue donors, 10,937 of which are surgical donors and 1,478 of which are deceased donors, for the period of 1993 -2004. This data was analysed to determine the prevalence and incidence of viral infections such as human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV) and human T-lymphotropic virus (HTLV) in musculoskeletal allografts. The results indicate that the risk of viral infection from musculoskeletal tissue transplantation in Australia is low. ... The results indicate that the overall prevalence of screened transfusion-transmitted viral infections did not vary significantly for musculoskeletal donors over the study period, despite falling in the general population and first-time blood donors. In tissue donors, HIV incidence significantly decreased over time, and HBV decreased significantly during 1999-2001; however, there was an apparent increase in the estimated incidence of HCV in 2002-2004 compared with earlier years. Furthermore the residual risk estimate of HIV in the period 2002-2004 has declined 5-fold compared to estimates in the period 1993-1995. This is perhaps due to greater awareness of high risk behaviours among donors, improvement in donor recruitment and an overall decrease in infection levels in the general population. Musculoskeletal tissue is second only to blood as the most frequent transplanted human tissue. Viral infection is a potential complication of tissue transplantation. In this thesis the rates of HIV, HBV, HCV and HTV infection in musculoskeletal donors in Australia were identified and then compared with results in published data from Canada, Scotland and the United States. The study also compared that result with first-time blood donors because they have satisfied similar donor selection criteria (Galea et al. 2006). The results indicate that prevalence and incidence estimates for viral infection in Australian tissue donors are higher than those in blood donors. This was also reported in studies from other countries. Accordingly, it is crucial that viral prevalence and incidence be monitored to evaluate the safety of tissue supply and to improve donor selection processes.

L’hépatite C est une maladie silencieuse, souvent asymptomatique, mais qui entraîne des lésions du foie et peut évoluer vers une cirrhose et, dans certains cas, vers un cancer. Le carcinome hépatocellulaire engendré par l’hépatite C constitue la première cause de transplantation hépatique. Les virus de l’hépatite C (VHC) et de la diarrhée virale bovine (VDVB) sont deux pestivirus possédant un ARN monocaténaire, de la famille des Flaviviridae. Bien qu’ayant des génomes différents, ils présentent une organisation structurelle et des processus de développement de l’enveloppe cellulaire comparables. Le screening de la chimiothèque du laboratoire a permis d’identifier cinq composés chefs de files, actifs à l’encontre du virus de l’hépatite C. Deux de ces composés de la série imidazo[1,2-a]pyridine ont fait l’objet d’un travail de pharmacomodulation dans le cadre des thèses de Jean-Baptiste Véron et Nicolas Henry. La première partie de mon travail de recherche a donc consisté à poursuivre ces travaux de pharmacomodulation afin de tenter d’améliorer l’activité de cette série chimique à l’égard du VHC ainsi que son index thérapeutique. La synthèse convergente de ces molécules a été effectuée grâce à des couplages métallo-catalysés.La seconde partie de mon projet de recherche a porté sur l’étude de la bifonctionnalisation des positions 7 et 8 du noyau imidazo[1,2-a]pyridine. Ces travaux ont permis de développer de nouvelles méthodologies pour introduire une diversité fonctionnelle sur ces positions. Ces molécules ont également été évaluées à l’encontre du VHC et l’une d’entre elle a montré une activité intéressante à l’encontre de ce virus. L’activité à l’encontre du VHC et l’index thérapeutique ont été améliorés pour deux molécules, analogues du BPIP. / Hepatitis C is a silent disease, often asymptomatic, responsible for hepatic lesions which may lead to cirrhosis and in some cases, to cancer. Hepatocellular carcinoma caused by hepatitis C virus is the leading cause of liver transplantation. Bovine viral diarrhoea (BVDV) and hepatitis C (HCV) viruses are two pestiviruses from the Flaviviridae family that have a single-stranded RNA. Despite having different genomes, they present a similar structural organization and processes of development of the cell envelope.The laboratory’s chemical library screening has identified five hits, active against the HCV. Two of these compounds from the imidazo[1,2-a]pyridine serie were pharmacomodulated as part of the Ph.D. thesis of Jean-Baptiste Véron and Nicolas Henry.The first part of my research work was therefore to continue the pharmacomodulation study of these chemical series to improve their activity against HCV and their therapeutic index. To do so, the convergent synthesis of these molecules was performed using metal-catalyzed couplings.The second part of my project has focused on the study of the difunctionalization of positions 7 and 8 of the imidazo[1,2-a]pyridine nucleus. This work helped to develop new methodologies for introducing a functional diversity on these positions. The antiviral activity of these molecules was also assessed against HCV and one of them has shown interesting activity against this virus.In conclusion, activity against HCV and therapeutic index have been improved for two molecules, analogues of BPIP.

Plus de 170 millions d'individus sont infectés par le VHC dans le monde et 37 millions par le VIH. La coinfection VIH/VHC est fréquente et représente un élément clé de la prise en charge des patients infectés par le VIH. Depuis l'arrivée des HAART, les maladies du foie sont devenues la cause principale de mortalité chez les patients coinfectés VIH/VHC. L'évolution naturelle et le pronostic de l'hépatite C sont plus sévères en cas de coinfection par le VIH du fait d'une fibrose accélérée et d'une évolution rapide vers la cirrhose et ses complications. Certains facteurs accélérant la fibrose hépatique sont clairs aujourd'hui comme: l'absence de recours au traitement anti-VHC, la réplication active du VHC et la consommation excessive d'alcool. De plus, il existe de plus en plus de preuves que les variants génétiques contribuent à la fibrose hépatique chez les patients monoinfectés par le VHC, mais cet aspect a été peu étudié dans la coinfection VIH/VHC.Durant ma thèse, j'ai eu accès aux données d'un échantillon de 494 patients coinfectés génotypés issu de la cohorte ANRS CO13 HEPAVIH. L'histoire naturelle du VIH et du VHC y est renseignée de manière très détaillée et le suivi clinique des patients permet d'avoir des informations précises sur l'état de fibrose hépatique. J'ai pu alors réaliser deux études d'association « génome-entier » pour identifier des polymorphismes associés à la sévérité de la fibrose à l'aide de données complètes de 292 patients. La première étude a mis en évidence une association entre la quantification de l'élasticité hépatique par Fibroscan® et un locus, également répliqué dans la monoinfection par le VHC. Cette association a permis d'identifier deux gènes impliqués dans des mécanismes de maintien de structure et de signalisation cellulaire (CAV3) mais aussi dans la réplication du VHC (RAD18). La seconde étude a identifié deux associations significatives en comparant deux groupes de scores METAVIR (F0F1F2 vs F3F4), en particulier dans le gène CTNND2 qui est impliqué dans un réseau d'interaction associé à des mécanismes moléculaires lié à des maladies hépatiques.Ces deux études sont en cours de publication dans des revues scientifiques internationales à comité de lecture. Ces nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes de fibrose dans le contexte de la coinfection VIH/VHC pourraient aider à l'identification de nouvelles cibles pour la création de médicaments ou de tests diagnostiques afin d'améliorer les soins des patients. / Over 170 million people worldwide are infected by HCV and 37 million by HIV. Both viruses share the same modes of transmission, and HIV/HCV coinfection is common and represents a key element in the management of patients infected with HIV. Since the appearance of HAART, liver diseases have become the leading cause of death in HIV/HCV coinfected patients. The natural history and prognosis of hepatitis C are more severe in case of coinfection with HIV due to accelerated rate of fibrosis progression and rapid progression to cirrhosis and its complications. Factors accelerating liver fibrosis are known today such as the lack of recourse to anti-HCV treatment, active HCV replication and excessive alcohol consumption. There is increasing evidence that genetic variants contribute to liver fibrosis in HCV monoinfection, but this aspect has been little studied in HIV/HCV coinfection.I have exploited the genotype information from 494 coinfected patients from the cohort ANRS CO13 HEPAVIH. These patients are very-well documented regarding the history of their HIV/HCV infection and are very carefully followed-up, especially regarding the status of liver fibrosis. I have performed two genome-wide association studies to identify polymorphisms associated with the severity of fibrosis from complete data of 292 patients. The first study has dealt with the quantification of liver stiffness by Fibroscan® and an association with the 3p25 region has been identified, also replicated in monoinfection HCV. Two genes involved in cell signaling and structure of holding mechanisms (CAV3) but also in HCV replication (RAD18) appear as good candidates. The second study has unraveled two significant associations by comparing the METAVIR score group (F0F1F2 vs F3F4), especially in the CTNND2 gene implicated in a network of interactions with molecular mechanisms involved in liver diseases.These results are under publications in peer-review international scientific journals. These new insights into the molecular mechanisms of liver fibrosis in patients with HIV/HCV co- infection may help to define new targets for drug development or new diagnostic tests, to improve patient care.

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