La protéine core du virus de l’hépatite C (VHC) serait responsable des principaux effets pathogènes du VHC, dont le développement de fibrose, stéatose, cirrhose et carcinome hépatocellulaire. Un cadre de lecture alternatif existe dans le gène de core, permettant la synthèse d’une autre protéine appelée ARFP (pour alternatate reading frame protein) ou protéine F (pour frameshift), dont le rôle reste encore mal compris. La présence de la protéine F lors de l’étude des fonctions biologiques de core ne pouvant être exclue, il est possible que certains rôles attribués à core reflètent en réalité l’activité de la protéine F. Afin de déterminer les fonctions biologiques de la protéine F dans les hépatocytes et son influence dans la pathogenèse associée au VHC, nous avons généré des lignées transgéniques de poissons zébrés (Danio rerio) dans lesquelles l’expression de deux versions de la protéine F (AF11opti et AUG26opti) a été ciblée au foie par l’utilisation du promoteur de la liver fatty acid binding protein (L-FABP). Le phénotype des poissons transgéniques de génération F2 a été analysé au niveau morphologique, histologique et microscopique afin de rechercher des signes de pathologie hépatique. Nos résultats ont démontré l’implication de la protéine F dans le développement de stéatose hépatique chez les deux lignées transgéniques, mais aucun signe de fibrose ou d’oncogenèse n’a été détecté. L’identification des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’accumulation lipidique induite par la protéine F pourrait permettre de mieux comprendre son rôle dans la pathogenèse du VHC, et mener au développement de nouvelles stratégies antivirales. / Hepatitis C virus (HCV) core protein is thought to be responsible for the major pathogenic effects of HCV, including the development of fibrosis, steatosis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. An alternate translational open reading frame exists in the core gene that allows the synthesis of another protein called ARFP (alternate reading frame protein) or F protein (frameshift), the role of which remains poorly understood. Since we cannot exclude the presence of F protein in most studies of core biological functions, it is possible that the roles attributed to core reflect the activity of ARFP. To determine the biological functions of F protein in hepatocytes and their influence on HCV-associated pathogenesis, we generated transgenic lines of zebrafish (Danio rerio) in which the liver fatty acid binding protein (L-FABP) promoter was used to direct liver-specific expression of two forms of ARFP (AF11opti and AUG26opti). The phenotype of F2 transgenic zebrafish was analyzed for morphological, histological and microscopic signs of liver-associated pathology. Our results demonstrated the implication of the HCV F protein in the development of hepatic steatosis in transgenic zebrafish liver but not fibrosis or oncogenesis. Identification of the cellular and molecular mechanisms underlying F protein-induced lipid accumulation will lead to a better understanding of the role of ARFP in HCV-associated pathology, which could lead to the development of novel antiviral strategies.

L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) conduit au développement de pathologies hépatiques, telles que la fibrose dont le terme évolutif est la cirrhose sur laquelle peut se développer un carcinome hépatocellulaire. Les observations cliniques indiquent que le VHC interfère avec la voie de signalisation du Transforming Growth Factor β (TGFβ). Entre autres fonctions, cette cytokine induit la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), ce qui favorise la migration cellulaire et l'invasion tumorale. Le but de cette thèse est d'analyser l'impact des protéines non structurales du VHC sur la voie de signalisation du TGFβ.Nous avons montré que le réplicon subgénomique du VHC induit une augmentation de la signalisation du TGFβ résultant en une plus forte expression de gènes associés à l’EMT et induisant un phénotype d’EMT. L’expression de la protéase virale NS3-4A seule, augmente et prolonge la phosphorylation de Smad2/3 en aval du récepteur du TGFβ et renforce l’expression de certains gènes cibles du TGFβ. L’analyse des interactions entre les protéines du VHC et les protéines de la voie du TGFβ a permis d’identifier l’interaction entre NS3-4A et la protéine Smurf2. Le réplicon subgénomique ou la protéase NS3-4A ont des rôles antagonistes à la protéine Smurf2 sur la voie de signalisation du TGFβ. L’analyse globale des gènes régulés par le TGFβ dans les cellules exprimant le réplicon subgénomique a permis d’identifier, que dans ces cellules, le TGFβ induit une réponse pro-tumorale.Ces résultats montrent que NS3-4A induit une plus forte réponse des cellules au TGFβ, en inhibant la fonction de Smurf2 dans le rétrocontrôle négatif de la voie du TGFβ. Ce nouveau mécanisme d’interférence du VHC avec la voie du TGFβ pourrait contribuer à l’EMT des cellules hépatocytaires infectées favorisant ainsi la cancérisation. Ce travail apporte de nouvelles pistes dans la compréhension des mécanismes associés à la cancérisation chez les patients chroniquement infectés par le VHC. / Chronic infection by hepatitis C virus (HCV) leads to the development of hepatic diseases like fibrosis which evolves into cirrhosis on which can develop hepatocellular carcinoma. Clinical observations indicate that HCV interferes with the TGFβ signaling pathway. Among other functions this cytokine induces epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) promoting cell migration and tumor invasion. The aim of this study is to analyze the impact of HCV non structural proteins on TGFβ signaling pathway. We have demonstrated that the HCV subgenomic replicon induces an enhancement of the TGFβ signaling pathway resulting in a strong expression of EMT associated genes and inducing EMT phenotype. The expression of the NS3-4A viral protein alone enhances and stabilizes Smad2/3 phosphorylation downstream TGFβ receptor and increases the expression of some TGFβ target genes. The analysis of interactions between HCV proteins and proteins of the TGFβ signaling pathway has shown the interaction of NS3-4A with Smurf2 protein. HCV subgenomic replicon and NS3-4A have antagonistic roles to Smurf2 on TGFβ signaling pathway. The global analysis of genes regulated by TGFβ in cells expressing HCV subgenomic replicon indicates that in these cells TGFβ induces a pro-tumor answer.These results show that NS3-4A enhances TGFβ answer by inhibiting Smurf2 functions in the negative feedback loop of the TGFβ pathway. This new mechanism of HCV interference with the TGFβ pathway can contribute to EMT in infected hepatocytes thus promoting carcinogenesis. This work provides new leads to understand the mechanisms associated to carcinogenesis in HCV chronically infected patients.

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Le virus de l’hépatite C (VHC) dépend de facteurs cellulaires pour accomplir son cycle viral et persister dans l’hôte. L’une des stratégies de notre laboratoire consiste à étudier de manière approfondie le réseau d’interactions virus-hôte, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques cellulaires et de développer des antiviraux plus efficaces pour vaincre la résistance virale. Durant ma thèse j’ai étudié deux facteurs cellulaires importants pour le VHC. Le premier est la protéine ribosomale RACK1. Nous avons montré que cette protéine est spécifiquement requise pour la traduction IRES-dépendante du VHC, et non pour la traduction coiffe-dépendante. Le deuxième facteur est une protéine de surface des gouttelettes lipidiques appelée TIP47. Nous avons montré que cette protéine est importante à la fois pour l’assemblage et pour l’export des particules virales. L’ensemble de ces travaux montre que de nouvelles cibles thérapeutiques pourraient être envisagées pour lutter contre le VHC. / The hepatitis C virus (HCV) relies on cellular factors to complete its life cycle and persist in its host. One of the strategies employed by our laboratory is the in-depth study of the network of virus-host interactions to identify new therapeutic cellular targets and develop more effective antivirals to overcome viral resistance.During my PhD, I studied two cellular factors involved in the HCV life cycle. The first factor is the ribosomal protein RACK1. We have shown that this protein is specifically required for the HCV IRES-mediated translation but not for the cap-mediated translation. The second factor is the lipid droplets binding protein TIP47. We have shown that this protein is important for both assembly and export of viral particles. This work shows that new therapeutic targets could be considered in the fight against HCV.

The hepatitis C virus (HCV) was characterised in 1989. HCV was transmitted through transfusion of blood/blood products, but injection drug use is now the most common route of transmission. The infection is usually asymptomatic but becomes chronic in about 75%, and in 20 years 15-25% develops liver cirrhosis, with a risk for liver failure and liver cancer. HCV has also been associated with lymphoproliferative disorders. The aim of this thesis was to study morbidity and mortality in a national, population-based cohort of HCV-infected individuals. The study population consisted of all persons with a diagnosed HCV-infection recorded in the national surveillance database. This file was linked to other national registers to obtain information of emigration, deaths, cancers, and inpatient care. All personal identifiers were removed before analysis. In Paper I the standardized incidence ratios (SIR) for Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma (NHL), multiple myeloma, acute and chronic lymphatic leukaemia, and thyroid cancer were studied. In the HCV-cohort (n: 27,150) there was a doubled risk for NHL and multiple myeloma in patients infected for more than 15 years, compared with the general population (age-, sex- and calendar-year specific incidence rates). The results strengthened these earlier controversial associations. The SIR and also the absolute risk for primary liver cancer were estimated in Paper II. In the HCV-cohort (n: 36,126) the individuals infected for more than 25 years had a more than 40 times increased risk for liver cancer compared with the general population. The absolute risk of primary liver cancer was 7% within 40 years of HCV-infection. Mortality and cause of death were studied in Paper III. The standardized mortality ratio (SMR) demonstrated a 5.8 times excess mortality in the HCV-cohort (n: 34,235) compared with the general population, and a 35.5 times excess mortality from liver disease. Deaths from illicit drugs and external reasons were common in young adults. Paper IV presents a study of inpatient care. The HCV-cohort (n: 43,000) was compared with a matched reference population (n: 215,000). Cox regression was used to estimate the likelihood, a hazard ratio, for admission to hospital, and frequencies and rates to estimate the total burden. In the HCV-cohort inpatient care was high and about 50% was psychiatric, often drug-related care. The likelihood for liver-related admissions was very high, and serious liver complications increased in the 2000s, indicating that HCV-associated liver disease will increase the next decade. In the 2000s, about 1000 individuals per year were treated with HCV-combination therapy. To conclude, the risk for NHL and multiple myeloma was doubled, and liver- and drug-related morbidity and mortality was very high in the HCV-cohort. Serious liver complications increased in the 2000s and will probably increase the coming decade.

Mémoire en recherche subventionné par le Conseil de recherche en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) / Le génome du virus de l’hépatite C (VHC), membre des Flaviviridae, est constitué d’un ARN monocaténaire linéaire de polarité positive, et contient un seul cadre de lecture ouvert flanqué par deux régions non traduites désignées 5’UTR et 3’UTR. Ces régions contiennent des éléments structurés qui sont importants pour la régulation des processus de traduction et de réplication virale. Mon projet de recherche vise le 3’UTR. Celui-ci a une structure tripartite composée d’une région variable (VR), une région poly (U/UC) et une région X. Notre laboratoire a identifié une séquence VR qui forme une structure duplexe avec une séquence distale située dans le NS5B. Considérant que le gène NS5B code pour la polymérase virale, et que la 3’UTR est impliquée dans la réplication virale, nous postulons que ce duplex pourrait contrôler le niveau de synthèse de l'ARN du VHC. Afin de tester cette hypothèse, nous avons construit des mutants individuels des séquences VR et NS5B du VHC 1b afin d’empêcher la formation du duplex, ainsi qu’un mutant complémentaire aux deux sites permettant la reconstitution du duplex. L’ARN provenant de ces constructions a été synthétisé in vitro et transfecté dans les cellules Huh7.5. Au 9e jour de culture, l’ARN a été extrait des cultures, et la technique RT-qPCR a été ensuite utilisée afin de quantifier et comparer les niveaux d’ARN viral provenant des cultures transfectées avec les mutants versus celles transfectées avec le virus parental. Les résultats obtenus montrent une augmentation de 5.3X et 3.4X, respectivement, entre les niveaux d’ARN viral produits de cultures transfectées avec le virus muté dans les régions 3’UTR-VR et NS5B, comparé au virus parental. Cependant, l’ARN viral obtenu suite à la reconstitution des deux sites complémentaires montre une augmentation de 2.6X. Malgré que la différence entre les niveaux d’ARN des virus mutants ne soit pas statistiquement significative lorsqu’on les compare avec le niveau d’ARN généré par le virus parental, la tendance suggère que la fonction des séquences appariées serait de moduler à la baisse la synthèse de l’ARN viral. Il sera nécessaire de poursuivre davantage ce travail afin de mieux comprendre le rôle de la structure duplexe VR-NS5B sur la réplication du VHC. / The hepatitis C virus (HCV), a member of the Flaviviridae, contains a single (+) strand linear RNA genome which incorporates one long open reading frame flanked by two untranslated regions known as the 5’UTR and 3’UTR. These regions contain structures known to function in the regulation of HCV translation and replication. The 3’UTR is the focus of this research project. Its tripartite structure consists of a variable region (VR), a poly (U/UC) region and the X-tail. Our laboratory recently identified a VR sequence forming a duplex structure with a distal sequence located in the NS5B gene. Because NS5B encodes the viral polymerase, and seeing that the 3’UTR is involved in viral replication, we postulated that this duplex may function in controlling the level of HCV RNA replication. To test this hypothesis, we constructed HCV 1b mutants in the respective VR and NS5B annealing sequences to disrupt complementarity and prevent duplex formation. We also created a mutant with complementary mutations at both sites to reconstitute the duplex. RNA from these constructs was synthesized in vitro and transfected into Huh7.5 cells. Following a 9-day incubation period, RNA from all transfected cultures was harvested and HCV RNA was quantified by RT-qPCR. The data indicate an increase of 5.3X and 3.4X for HCV viral RNA harvested from cultures with disrupted 3’UTR-VR and NS5B, respectively, relative to wild-type HCV 1b, whereas the reconstituted HCV construct yielded a 2.6X increase in viral RNA. While these figures do not reach statistical significance, they suggest that the duplex structure modulates HCV replication downward. Further pursuit of this work is necessary to better elucidate the role of the VR-NS5B duplex structure on HCV replication.

Les interférons de type I (IFN-I) peuvent être produits par toutes les cellules mais les rares cellules dendritiques plasmacytoïdes en sont les principales cellules productrices. L’IFNa orchestre de nombreux mécanismes pathogéniques dans l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). L’étude de modèles physiologiques et pathophysiologiques peut fournir des informations cruciales sur les moyens d’exploiter la signalisation de l’IFNa dans un but thérapeutique. Les pDCs de femmes produisent plus d’IFNa en réponse à la stimulation du récepteur Toll-like 7 (TLR7) que les pDCs d’hommes. Les mécanismes impliqués dans cette différence n’ont été que partiellement identifiés. Nous démontrons ici un mécanisme par lequel la plus forte expression d’IRF5 dans les pDCs chez les sujets sains féminins, sous le contrôle d’ERa, participe à leur production plus élevée d’IFNa en réponse à TLR7. La co-infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité parmi les individus infectés par le VIH-1. Nous avons émis l’hypothèse que l’activation immunitaire chronique plus élevée rapportée chez des individus co-infectés par le VIH-1 et VHC pourrait être due à un dysfonctionnement de la voie de TLR7/IFN-I dans les pDCs. Nos données montrent que le VHC entraîne, chez des individus infectés par le VIH-1, des altérations associées aux pDCs et à l’IFNa, qui sont associées ˆ la sévérité de la maladie hépatique. Nos résultats suggèrent que les patients co-infectés par le VIH-1 et le VHC, même à fibrose minime, pourraient bénéficier d’un traitement plus précoce. / Type I interferons (IFN) can be produce by any cell type but plasmacytoid dendritic cells (pDC) are the main producers. IFNa orchestrates multiple pathogenic mechanisms in human immunodeficiency virus 1 (HIV-1). Studying physiological and pathophysiological model scan provide critical informations on how to harness IFNa signaling for therapeutic purposes. pDCs from females produce more IFNa upon Toll-like receptor (TLR) 7 stimulation than pDCs from males. The mechanisms underlying such difference have only been partially identified. We demonstrate here a mechanism by which increased IRF5 expression in females, under the control of the esrogen receptor a, contribute to increased IFN? production upon TLR7 stimulation. HCV co-infection is one of the major cause of mortality among HIV-1 infected individuals. We hypothesized that increased chronic immune activation observed in HCV-HIV-1 co-infected individuals may be related to altered TLR7/IFNa signaling in pDCs. Our data show that HCV triggers alterations in pDCs and IFNa signaling in HIV-1 co-infected individuals, which are associated to hepatic disease severity. Our results suggest that HCV-HIV-1 co-infected individuals, even with minimal fibrosis, may benefit from ealier treatment initiation.

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Natural Killer (NK) cells, members of the innate lymphoid cells (ILCs), are known to play an important role in the defense against foreign cells and abnormal host cells that have arisen due to viral infection or cancer inducing mutations. The typical immune response of NK cells involves the release of cytotoxic granules containing perforin and granzyme, and the secretion of immune-regulatory cytokines such as interferon gamma (IFN-γ). Unlike the adaptive lymphocytes such as T cells and B cells, NK cells do not require prior sensitization, enabling them to initiate an immune response much faster. This unique feature of NK cells is made possible by the utilization of an array of germline encoded receptors; but on the other hand, it limits NK cells ability to respond against rapidly evolving pathogens. NK cells overcome this shortcoming with an antibody-assisted process called antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC). A novel subset of human NK cells, which displays potent and broad antiviral responsiveness in concert with virus-specific antibodies, was recently discovered in cytomegalovirus positive (CMV+) individuals. This NK cell subset, called g-NK cell, was characterized by a deficiency in the expression of FcεRIγ, an adaptor protein that associates with CD16 which enables ADCC. Surprisingly, despite this deficiency, g-NK cells displayed an enhanced ADCC as compared to their conventional counterparts. Furthermore, having a long-lasting memory-like NK-cell phenotype suggests a role for g-NK cells in chronic infections. This study investigates the importance of g-NK-cells in clinical settings, first by investigating whether the presence of g-NK cells is associated with the magnitude of liver disease during chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Analysis of g-NK cell proportions and function in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy controls and chronic HCV subjects showed that chronic HCV subjects had slightly lower proportions of g-NK cells, while having similarly enhanced ADCC responses compared to conventional NK cells. Notably, among CMV+ chronic HCV patients, lower levels of liver enzymes and fibrosis were found in those possessing g-NK cells. g-NK cells were predominant among the CD56neg NK cell population often found in chronic HCV patients, suggesting their involvement in the immune response against HCV. Rituximab is a chimeric anti-CD20 antibody used to treat B cell lymphoma patients; and studies have suggested that its efficacy is associated with the ADCC potency and CD16 affinity. Since g-NK cells are characterized by their superior ADCC compared to their conventional counterpart, I decided to investigate whether the presence of g-NK cells can improve the effectiveness of rituximab against malignant B cells in the context of lymphoma and leukemia. The analysis of g-NK cells’ ADCC response against rituximab-coated lymphoma cell lines and B cells from a CLL patient indicated a superior ADCC by g-NK cells compared to their conventional NK cell counterparts. Taken together, for the first time, my findings indicate that the presence of g-NK cells in CMV+ individuals is associated with milder liver disease in chronic HCV infection. In addition, an enhanced ADCC response by g-NK cells upon encountering rituximab coated target cells suggests the beneficial roles of g-NK cells, and opens an avenue for novel therapeutic approaches where g-NK cells can be utilized to treat persistent diseases such as chronic viral infection and cancer.

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