Le virus de l'hépatite C (VHC) est détecté dans les sérums de patients infectés sous forme de particules infectieuses lipidées de très faibles densités. Le VHC est un virus enveloppé dont l'assemblage de particules virales se produit à la membrane du réticulum endoplasmique consécutivement au clivage séquentiel de sa polyprotéine et à sa maturation en protéines structurales et non structurales. Dans ce travail, nous avons cherché à mieux comprendre les mécanismes d'assemblage, d'enveloppement et de sécrétion des particules infectieuses. Dans une première étude, nous avons montré la connexion fonctionnelle entre les complexes de réplication et les sites d'assemblage. Dans une seconde étude, nous avons montré que p7 ralentissait de manière dose-dépendante le trafic ER-Golgi, conduisant à une rétention intracellulaire de la glycoprotéine virale E2. En outre, nous avons montré que le clivage du précurseur protéique E2p7 contrôle l'expression intracellulaire E2 et les niveaux de sécrétion des particules subvirales et des virions infectieux. Enfin, nous avons également mis en évidence que l'extrémité N-terminale de p7 gouverne l'infectivité spécifique des particules en coordonnant la rencontre des composants de la nucléocapside avec les glycoprotéines, mais aussi l'enveloppement de la nucléocapside. Dans une troisième étude, nous avons découvert des fonctions et des facteurs spécifiques du sérum, des cellules productrices et des séquences du VHC qui modulent la lipidation des particules virales au cours de leur assemblage et de leur sécrétion. Au total, ces différents travaux ont contribué à mieux comprendre les étapes de l'assemblage du VHC et les mécanismes modulant i) le transfert des ARN viraux des complexes de réplication vers les sites d’assemblage, ii) la rencontre des nucléocapsides et des glycoprotéines, et enfin, iii) l'acquisition de lipides par des particules virales / Hepatitis C virus (HCV) is detected in the sera of infected patients as lipidated infectious particles of very-low density. HCV is an enveloped virus whose assembly of viral particles occurs at the endoplasmic reticulum membrane following sequential cleavage of its polyprotein and its maturation as structural and non-structural viral proteins. In this work, we aimed at better understanding the mechanisms of assembly, envelopment and secretion of infectious particles. In a first study, we highlighted the functional connection between replication complexes and assembly sites. In a second study, we showed that p7 dose-dependently slows down the ER-to-Golgi traffic, leading to intracellular retention of E2 viral glycoprotein. In addition, we showed that cleavage of an E2p7 precursor protein controls E2 intracellular expression and secretion levels of subviral particles and infectious virions. Finally, we also highlighted that p7 N-terminal extremity governs the specific infectivity of the infectious particles by coordinating the encountering of the nucleocapsid components with the glycoproteins and the envelopment of the nucleocapsids. In a third study, we discovered specific functions and factors from serum, producer cells, and HCV sequences that modulate lipidation of viral particles during their assembly and secretion. Altogether, these different works contributed at better understanding the steps of HCV assembly and the mechanisms modulating i) the transfer of viral RNAs from replication complexes to assembly sites, ii) the encountering of the nucleocapsids and glycoproteins followed by virion envelopment, and finally, iii) the acquisition of lipids by viral particles

Lors de la réplication du virus de la grippe, la protéine de matrice M1 prend part au transport des complexes vRNP. Elle interagit également avec les queues cytoplasmiques des protéines virales membranaires et la membrane plasmique de la cellule hôte au site d'assemblage, et est responsable de la structure de la particule virale. Le domaine N-terminal de M1, composé des 164 premiers acides aminés, possède deux motifs basiques exposés : un signal de localisation nucléaire (NLS, 101-105) sur l'hélice 6 et un triplet d'arginines (76-78) sur l'hélice 5. L'objectif de cette thèse était d'étudier (1) le rôle de ce domaine basique, en comparaison avec le NLS, dans l'accrochage membranaire de M1 et dans l'assemblage du virus de la grippe A/H1N1pdm2009 et (2) de définir dans notre système expérimental cellulaire les protéines virales requises pour la production de VLP (Virus Like Particles) de la grippe contenant M1. In vitro, par des tests de cosédimentation de protéines recombinantes M1 (domaine N-terminal) sauvages ou mutées avec des LUVs (Large Unilamellar Vesicles) contenant des lipides chargés négativement, il fut possible d'observer que les domaines basiques (NLS et triplet d'arginines) sont impliqués dans l'interaction M1-membranes biomimétiques, via une interaction électrostatique entre M1 et les lipides chargés négativement (comme la PS). In cellulo, nous avons pu observer que M1, lorsqu'elle est exprimée seule, ne s'accroche pas de manière efficace à la membrane. Par contre, lorsque M2 et NS1/NEP sont coexprimées, la fraction de M1 liée aux membranes est dix fois plus importante. De plus, la coexpression de M1, M2 et NS1/NEP nous permet d'observer la production de VLP par Western blot et AFM (Atomic Force Microscopy), même en absence des glycoprotéines d'enveloppe HA et NA. Par mutagenèse dirigée, nous avons pu observer que les résidus chargés négativement de la queue cytoplasmique de M2 sont nécessaires à la localisation membranaire de M1 et à la production de VLP, comme décrits dans la littérature. De manière intéressante, quand un mutant du triplet d'arginines est exprimé, il y a trois fois moins de M1 accrochée aux membranes (M1 reste cytosolique), et la production de VLP est fortement diminuée. Un mutant du NLS diminue également l'accrochage membranaire de M1 mais seulement de 10%. Ces domaines basiques, et plus particulièrement le triplet d'arginines, semblent donc être impliqués dans des interactions électrostatiques entre M1 et les lipides chargés de la membrane, ou M1 et les résidus chargés de la queue cytoplasmique de M2, ou les deux. L'ensemble de ces travaux apporte une nouvelle vision moléculaire de l'assemblage du virus de la grippe A/H1N1. / The M1 matrix protein, lying beneath the viral lipid envelop, plays many roles in influenza virus assembly. Not only it structures the viral particle but it also associates to the vRNP complexes in the nucleus and it supposedly binds to the cell plasma membrane and to the cytoplasmic tails of the viral membrane proteins at the assembly site. M1 N-terminal domain, composed of 164 amino acids, exhibits two basic domains: the NLS (Nuclear Localization Signal) on helix 6 and a triplet of arginines on helix 5. We decided to investigate the role of those basic domains regarding the molecular assembly mechanism of the influenza A/H1N1pdm2009 virus and the attachment of M1 at the cell membrane. In vitro, we observed that when the triplet of arginines is mutated, the percentage of M1 bound to LUVs (Large Unilamellar Vesicles) containing negatively charged lipids decreases, as it is the case for a full mutant of the NLS motif. In cellulo, by using cellular fractionation, membrane flotation assays, and immunofluorescence microscopy, we observed that when expressed alone, M1 is poorly bound to the cellular membranes whereas in the presence of NS1/NEP (Non Structural protein 1 and Nuclear Export Protein) and M2 viral proteins, the M1 membrane bound fraction is increased by 10 times. M2 appears to be essential for M1 membrane localization. In order to decipher the mechanism, we used directed site mutagenesis of M1 and M2. When we mutated some negatively charged residues of the M2 cytoplasmic tail, we no longer observed either the localization of M1 at the cell membrane or VLP (Virus Like Particles) production, in agreement with the literature. In addition, when we mutated the M1 arginine triplet, M1 remained cytosolic and VLP production was almost completely abolished, even when M2 and NS1/NEP were coexpressed. Whereas a mutant of the arginine triplet decreases by 20% the percentage of M1 attached to cellular membranes, a mutant of the NLS has a mild effect (10% of decrease is observed). Thus, M1 basic domains, particularly the arginine triplet, can trigger electrostatic interactions between M1 and the lipids, or M1 and the cytoplasmic tail of M2, or both, at the viral assembly site. These results highlight the molecular mechanism of A/H1N1 influenza virus assembly.

Aujourd’hui, le Virus de l'Hépatite C (VHC) infecte plus 70 millions de personnes dans le monde. L’Organisation mondiale de la santé prévoit l’élimination du virus VHC d’ici 2030, grâce aux récentes découvertes dans le milieu du développement médical. Ces derniers ont conduit à la production des antiviraux pangenotypiques à action directe (ADD). Le VHC est un virus enveloppé de l’ARN, avec une polarité positive. Il est constitué de nucléocapside entouré d’une membrane lipidique. La nucléocapside contient l’acide ribonucléique (ARN) et la protéine core. La membrane lipidique quant à elle contient à la surface les glycoprotéines E1 et E2. Ainsi ces protéines, sont les premières à rencontrer les hépatocytes, c’est donc grâce à elles que le virus parvient à entrer dans les cellules. Parmi les deux protéines, l’E2 a été la mieux caractérisée pour ses fonctions de liaisons aux récepteurs spécifiques. De plus les anticorps neutralisants ciblent majoritairement cette protéine. En se basant sur le fait que ce virus est membre de la famille des Flaviviridae, il a été suggéré par analogie, que le VHC contient des protéines de fusion de classe II et que la protéine E2 est la protéine de fusion. Cependant, les structures cristallines récentes d’E2 ont révélé qu'il lui manquait les caractéristiques structurelles des protéines de fusion de classe II. Ainsi, tous les regards se sont tournés sur la glycoprotéine E1, suggérant qu’elle est responsable de l’étape de fusion, seule ou à l’aide d’E2. En effet, la partie N-terminale de l'ectodomaine E1 a été récemment cristallisée. La caractérisation des résidus conservés dans cette région a démontré son importance pour l'infectivité du virus, pour l'interaction entre E1 et E2, ainsi que pour son implication dans l'interaction avec les récepteurs du VHC. En soutenant le rôle potentiel d'E1 dans le processus de fusion, différents segments de l'extrémité C-terminale de l'ectodomaine seraient impliqués dans les interactions avec les membranes modèles. Nous avons étudié en particulier deux régions d’intérêt. La première située dans la zone du peptide de fusion putatif (PFP) entre les acides aminés 270 et 291. Cette région se compose des séquences hydrophobes, soutenant son implication dans l'étape de fusion. La deuxième région englobant les acides aminés 314-342, d’une activité membranotrope située à proximité de la zone transmembranaire d’E1, a été démontrée par la cristallographie aux rayons X et les études de RMN comme comprenant deux hélices α (α2 et α3).Nous avons introduit 22 mutations dans la partie C-terminale de l'ectodomaine E1 dans le contexte d'un clone infectieux JFH1. Nous avons remplacé les résidus les plus conservés par de l'alanine, puis analysé l'effet des mutations sur le cycle de vie du virus. Vingt des vingt-deux mutants ont été atténué ou ont perdu leur pouvoir infectieux, ce qui indique leur importance dans le cycle viral. Nous avons observé différents phénotypes; certaines mutations ont modulé la dépendance du virus vis-à-vis des récepteurs CLDN1 et SRBI pour l’entrée cellulaire. Plusieurs mutations dans la région PFP, ont affecté la sécrétion et l'assemblage du virus, ainsi que l'hétérodimérisation E1E2. D’autres mutations, telles que les mutations de l'hélice α2 ont entraîné une atténuation grave ou une perte complète d'infectivité, sans affecter le repliement d’E1 et E2, ni la morphogenèse virale. Une caractérisation plus poussée de certains mutants au sein de la région hélice α2 a suggéré l'implication de cette région dans une étape tardive de l'entrée du VHC. Enfin, nos résultats montrent le rôle important joué par la glycoprotéine E1 dans l'hétérodimérisation de E1E2, la morphogenèse du virus, ainsi que son interaction avec les récepteurs du VHC et son implication potentielle dans l'étape de fusion. / Hepatitis C virus is currently estimated to infect around 71 million people around the world. However, recent advances in drug development led to the generation of pangenotypic direct acting antivirals (DAA), which may make it possible to eliminate HCV by 2030 as planned by the World health organization (WHO). HCV is a small RNA enveloped virus of positive sense. The RNA is encapsidated and surrounded by a lipid bilayer in which the E1 and E2 envelope glycoproteins are anchored on the surface. Thus, E1 and E2 are the first viral proteins to encounter the hepatocytes and mediate the entry step. HCV entry into hepatocytes is a sophisticated process that includes several steps ranging from interaction of glycoproteins with cellular host attachment factors and HCV specific-receptors, which is followed by internalization via clathrin-mediated endocytosis. Finally, viral and endosomal membranes merge at acidic pH leading to the release of viral RNA into the cytoplasm. Among the two glycoproteins, E2 has been the better characterized, as it is responsible for binding to cellular receptors and targeted by neutralizing antibodies. As a member of the Flaviviridae family, it has been suggested by analogy that HCV encodes class II fusion proteins and that E2 is the fusion protein. Nevertheless, the recent crystal structures of E2 revealed that it lacks structural features of class II fusion proteins. Thus, E1 glycoprotein became under the spotlight with the assumption that it is responsible for the fusion step whether alone or with the help of E2. Indeed, the N-terminal part of E1 ectodomain was recently crystallized, and the characterization of conserved residues within this region demonstrated its importance for virus infectivity, E1E2 interaction as well as its involvement in the interplay with HCV receptors. Supporting the potential role of E1 in the fusion process, different segments in the C-terminal of the ectodomain have been reported to be involved in interactions with model membranes. In particular, we investigated two regions of interest. The first one located in the putative fusion peptide (PFP) region between amino acid 270 and 291, containing hydrophobic sequences, supporting its involvement in the fusion step. The second region spanning amino acids 314-342, a membranotropic region located proximal to the transmembrane region of E1 and has been shown by X-ray crystallography and NMR-studies to comprise two α-helices (α2 and α3). We introduced 22 mutations in the C-terminal part of E1 ectodomain in the context of a JFH1 infectious clone. We replaced the most conserved residues with alanine and analyzed the effect of the mutations on the viral life cycle. Twenty out of the 22 mutants were either attenuated or lost their infectivity, indicating their importance for the viral life cycle. We observed different phenotypes; some mutations modulated the dependence of the virus on CLDN1 and SRBI receptors for cellular entry. Most mutations in the PFP region affected virus secretion and assembly as well as E1E2 heterodimerization. Nevertheless, the majority of mutations in the α2-helix (aa 315-324) led to severe attenuation or complete loss of infectivity without affecting E1E2 folding or viral morphogenesis. Further characterization of some mutants within this region suggested the involvement of the α2-helix in a late step of HCV entry. Finally, our results show the important role of E1 played in E1E2 heterodimerization, virus morphogenesis, interaction with HCV receptors and its potential involvement in the fusion step.

Les rétrovirus sont un enjeu de santé publique, aussi bien humaine qu'animale. La compréhension des déterminants structuraux sous-jacents à la fonction de leurs protéines constitue une étape essentielle dans le développement de stratégies antirétrovirales efficaces.Ce manuscrit porte sur l'étude des bases structurales des mécanismes moléculaires impliqués dans les fonctions clés des rétrovirus que sont i) la régulation de l'expression des protéines de rétrovirus complexes et ii) l'assemblage des particules virales, à travers l'étude de deux protéines rétrovirales d'intérêt thérapeutique : la protéine Tax du virus T-lymphotrope humain (HTLV) et la protéine de capside du virus de l'immunodéficience féline (FIV). L'étude structurale de ces deux protéines d'intérêt et la compréhension des mécanismes moléculaires nécessaires à leurs fonctions permettraient d'ouvrir la voie à la conception de nouvelles stratégies antirétrovirales.Malgré de nombreux tests d'expression et de purification, l'étude structurale de la protéine Tax du HTLV n'a pu être réalisée, en raison de son insolubité. Cependant, ce travail doctoral a permis de résoudre, pour la première fois, la structure cristallographique de la protéine de capside entière du FIV. Bien que cette dernière adopte un repliement similaire aux autres capsides rétrovirales dont la structure est connue, elle présente également des spécificités structurales dont les conséquences fonctionnelles seront discutées / Retroviruses are a major concern of public health in humans but also in animals. A better understanding of the structural determinants underlying the functions of retroviral proteins is a crucial step for the development of efficient antiretroviral therapies.This manuscript studies the structural basis of the molecular mechanisms implicated in key functions of retroviruses such as, i) the regulation of complex retroviruses protein expression and ii) the assembly of viral particles, through the study of two retroviral proteins of therapeutic interest: the human T-lymphotropic virus (HTLV) Tax protein and the feline immunodeficiency virus (FIV) capsid protein. The functional and structural studies of these two proteins and the understanding of the molecular mechanisms required for their functions will pave the way to the conception of new antiretroviral therapeutic strategies.Despite several expression and purification assays, no structural studies could be performed for the HLTV Tax protein. However, this study allowed the resolution of the first structure for the full-length FIV capsid protein by X-ray crystallography. Although the FIV capsid protein displays a standard a-helical topology like other retroviral CAs, it also harbors original features whose functional consequences will be discussed

Le virus de l’hépatite C (VHC) dépend de facteurs cellulaires pour accomplir son cycle viral et persister dans l’hôte. L’une des stratégies de notre laboratoire consiste à étudier de manière approfondie le réseau d’interactions virus-hôte, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques cellulaires et de développer des antiviraux plus efficaces pour vaincre la résistance virale. Durant ma thèse j’ai étudié deux facteurs cellulaires importants pour le VHC. Le premier est la protéine ribosomale RACK1. Nous avons montré que cette protéine est spécifiquement requise pour la traduction IRES-dépendante du VHC, et non pour la traduction coiffe-dépendante. Le deuxième facteur est une protéine de surface des gouttelettes lipidiques appelée TIP47. Nous avons montré que cette protéine est importante à la fois pour l’assemblage et pour l’export des particules virales. L’ensemble de ces travaux montre que de nouvelles cibles thérapeutiques pourraient être envisagées pour lutter contre le VHC. / The hepatitis C virus (HCV) relies on cellular factors to complete its life cycle and persist in its host. One of the strategies employed by our laboratory is the in-depth study of the network of virus-host interactions to identify new therapeutic cellular targets and develop more effective antivirals to overcome viral resistance.During my PhD, I studied two cellular factors involved in the HCV life cycle. The first factor is the ribosomal protein RACK1. We have shown that this protein is specifically required for the HCV IRES-mediated translation but not for the cap-mediated translation. The second factor is the lipid droplets binding protein TIP47. We have shown that this protein is important for both assembly and export of viral particles. This work shows that new therapeutic targets could be considered in the fight against HCV.