L’interaction avec les cellules hôtes est une étape primordiale du cycle infectieux des Salmonella. Elle implique entre autres des fimbriae permettant l’attachement des Salmonella aux cellules et des invasines permettant leur internalisation. Généralement, l’expression de ces facteurs est réprimée et ils ne sont exprimés qu’in vivo en des sites bien spécifiques. Notre objectif a été d’étudier les mécanismes de répression de l’expression des fimbriae Pef et de l’invasine Rck. Nos résultats montrent que les nucléoprotéines H-NS, Hha et YdgT régulent négativement l’expression de ces deux facteurs de virulence. Le mécanisme de répression de la transcription de l’opéron pef a été caractérisé et montre un rôle prépondérant d’H-NS. De plus, la régulation de cet opéron par Hha et YdgT semble être dépendante ou indépendante de H-NS en fonction des conditions de culture de la bactérie. La répression de l’opéron pefI-srgC, portant l’ORF rck, semble, quant à elle, plus complexe. A l’heure actuelle, seule la région cible de la répression par Hha et YdgT a pu être identifiée. Ces résultats renforcent l’hypothèse de l’existence de régulations par Hha-YdgT indépendantes de H-NS. / The interaction with host cells is an essential step of Salmonella infection cycle. Among other virulence factors, fimbriae allow attachment of Salmonella to eukaryotic cells and invasins enable cell internalisation. Generally, the expression of these factors is suppressed and they are only expressed in vivo at very specific locations. Our objective was to study the mechanisms of Pef fimbriae and Rck invasin repression. Our results show that the nucleoproteins H-NS, Hha and YdgT negatively regulate the expression of these two virulence factors. The mechanism of pef operon transcription repression was characterized and shows a predominant role of H-NS. Moreover, the regulation of this operon by Hha and YdgT appears to bedependent or independent of H-NS depending on bacterial culture conditions. Repression of the pefI-srgC operon, carrying rck ORF, shows a higher degree of complexity. Currently, only the Hha and YdgT targeted region for the repression has been identified. These results reinforce the hypothesis that Hha-YdgT can act independently of H-NS.

En la adaptación de las bacterias ante cambios ambientales juegan un importante papel las proteínas asociadas al nucleoide. Estas proteínas presentan una doble función: la estructuración del nucleoide bacteriano y otros procesos relacionados con el ADN como es la regulación de la expresión génica. Una de las proteínas asociadas al nucleoide mejor caracterizada es la proteína H-NS, que se encuentra ampliamente distribuída en bacterias G(-). Una de las características de H-NS es su capacidad de formar dímeros con miembros de la familia de proteínas Hha/YmoA, formando de esta manera complejos represores que intervienen en la regulación de determinados operones, como es el caso del operón hly de E. coli. En este trabajo, y en colaboración con el grupo de RMN de biomoléculas dirigido por el doctor Miquel Pons, se han realizado una serie de trabajos con la intención de conocer mejor las características estructurales de la proteína Hha y su interacción con H-NS, en los que se ha puesto de manifiesto que, aún sin ser unos de los residuos aminoacídicos más afectados en la interacción de Hha con H-NS, la cisteína en posición 18 juega un importante papel en el equilibrio conformacional de Hha cuando interacciona con H-NS. La sustitución de esta cisteína por una isoleucina da lugar a una proteína Hha mutante incapaz de complementar la mutación hha y que provoca una reducción en la tasa de crecimiento de E. coli en condiciones de baja osmolaridad. Este efecto podría venir explicado por la mayor resistencia a la fuerza iónica del medio de la interacción de esta proteína Hha mutante con la proteína H-NS, lo que podría provocar la desregulación de algún gen/es esenciales en condiciones de baja osmolaridad. Una segunda parte de esta Tesis Doctoral está dedicada al gen hns de Y. enterocolitica. Estudios previos realizados en nuestro grupo de investigación pusieron de manifiesto la esencialidad del gen hns en esta bacteria, ya que únicamente es posible obtener mutantes hns en Y. enterocolitica en presencia de algún miembro funcional de la familia de proteínas H-NS. En esta Tesis, nos centramos en el sistema que permite obtener un mutante hns en presencia de la proteína StpA, paráloga a H-NS en E. coli. Los resultados obtenidos permitieron comprobar que la presencia de StpA en Y. enterocolitica provoca drásticas alteraciones en su patrón de expresión proteico, efecto no observado en otras bacterias entéricas, y pusieron de manifiesto la importancia de las proteínas H-NS e YmoA en esta bacteria. La proteína YmoA, que interviene en la termorregulación de la expresión de factores de virulencia en Y. enterocolitica, es homologa a la proteína Hha de E. coli, y también es capaz de interaccionar con H-NS. El análisis de estos resultados ha puesto de manifiesto, por un lado, que la presencia de StpA en Y. enterocolitica simula un incremento no fisiológico en los niveles de proteína H-NS, y por otro lado, la importancia no solo de la presencia de las proteínas H-NS e YmoA en Y. enterocolitica, sino también la importancia de sus niveles relativos, ya que un incremento en los niveles de H-NS o una disminución en los de YmoA provocan una drástica alteración en el patrón de expresión proteico de Y. enterocolitica. / "Hha and YmoA family of proteins: structural studies and regulatory role in Y. enterocolitica"TEXT:H-NS protein is a nucleoid-associated protein, widely dstribute in Gram - bacteria. It has a dual function: nucleoid structure protein and others processes related to DNA like gene expression regulation. This protein is able to both oligomerize and heterodimerize with other proteins. One of the partners of these heterodimers are members of Hha/YmoA family of proteins.In the current work, we carry out the production of both Hha and H-NS proteins in order to perform structural studies by RMN. These studies show that cysteine at position 18 in Hha protein is not one of the most affected aminoacids for Hha/H-NS interaction. However, its location between two α-helix domains suggested that it might be an important residue for Hha conformation during its interaction with H-NS. Our results demonstrated that cys 18 substitution by ile, which hypothetically gives rise to a more open structure, genetates a non-functional protein. In addition, we could observe a toxic effect under low osmolarity condition in E. coli. Finally, a higher stability in H-NS/Hha interaction could be observed.The second part of this work deals with Y. enterocolitica hns gene. hns mutants can only be obtained in this bacteria in presence of some functional members of this protein family. This fact is an evidence of the essenciality of hns in Y. enterocolitica. For instance, an hns mutant can be isolated in presence of stpa gene, which is an hns paralogous gene in E.coli, but not present in Y. enterocolitica. Our results demonstrate that drastic effects in the protein expression pattern of Y. enterocolitica are produced in presence of StpA. The analysis of the previous results gave evidence of the importance of YmoA and H-NS proteins in Y. enterocolitica. Not only the presence of the proteins but also their relative levels turned out to be important, since both an increase in H-NS levels and a decrease in YmoA levels gave rise to a dramatic change in Y. enterocolitica protein expression pattern.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MariceleNB.pdf: 3047192 bytes, checksum: 51cd549d89ea5cd776eac8dab93127fe (MD5) Previous issue date: 2009-07-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Parental care in mammals is influenced by somatosensory stimuli from infants, such as vocalization and sight and by changes in the hormone levels of caretakers. The aim of this study was to evaluate the behavioral and hormonal responses of twelve non reproductive adult male common marmosets (Callithrix jacchus) to infant cues, vocalization recordings, sight and physical contact with newborn. Six out of twelve males had previous experience in caretaking. In article 1, adult males were exposed to newborn vocalizations for 10 minutes. On control condition no sound was presented. In article 2, males were tested on two conditions: a) Control: an empty acrylic transparent box (test box) was placed in male s cage for 15 minutes, and b) Experimental: males were exposed to newborns into a closed text box for 15 minutes. The cage was kept closed to prevented from tactile, smell and acoustic stimulation by the infant on common marmoset males. In article 3, males were exposed to an open or closed text box, which allowed or not their access to and social interaction with the infants. After each observation sessions, blood samples were collected to evaluate the cortisol levels of males. In all studies, behavioral response of adult males was significantly modified by newborns sight, vocalization and physical contact. Males approached and spent more time near the sound source and showed an increase in locomotion during sound exposure. Furthermore, males approached, smelled and spent more time near the test box when the newborn was inside it. There was no difference in behavioral pattern between experienced and non-experienced males in articles 1 and 2. In article 3, behavioral pattern of males was influence by previous caretaking experience. Experienced males recovered quicker and carried the infants more than the inexperienced ones. However, inexperienced males showed a decrease in recovery latency and an increase in carrying time after successive exposure to infants. Cortisol levels changed after exposure to infant s vocalization, especially for experienced adult males. Male hormonal profile was not affected by the sight of infants neither by their previous experienced in caretaking. The occurrence of social interaction between the caretaker and infant did not modify the hormonal profile of common marmoset males; however, as much as experienced males carried the infants their cortisol levels decreased. Thus, members of a social group or potential caretakers common marmosets exposed to sensory cues from dependent infant such as vocalization, sight, smell and physical contact, changed their behavioral and hormonal responses that are physiological modulators of parental behavior in common marmoset / Em mam?feros, o cuidado parental ? influenciado por est?mulos sensoriais provenientes dos infantes, tais como, a vocaliza??o e a vis?o e por mudan?as hormonais que ocorrem nos cuidadores. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta comportamental e hormonal de 12 machos adultos n?o reprodutores de sag?i, Callithrix jacchus, a vocaliza??o, a vis?o e contato f?sico com filhotes rec?mnascidos. Seis dos doze machos utilizados tinham experi?ncia pr?via no cuidado ? prole. No primeiro artigo, analisamos os machos adultos quando expostos a vocaliza??o de filhotes por 10 minutos. Na condi??o controle a vocaliza??o n?o foi apresentada. No segundo artigo, os machos foram testados em 2 condi??es: a) Controle: uma caixa de acr?lico vazia (caixa teste) foi colocada nas gaiolas-viveiro dos animais por 15 minutos; e b) Experimental: machos foram expostos a filhotes colocados na caixa teste fechada, de modo evitar a influ?ncia de pistas sonoras, olfativas e t?teis do filhote nos machos de sag?i. No terceiro artigo, apresentamos os resultados de machos que foram expostos a caixa teste com filhote aberta ou fechada, permitindo ou n?o o acesso e intera??o f?sica do macho com o infante. Ap?s todas as observa??es comportamentais, amostras de sangue foram coletadas para avalia??o dos n?veis de cortisol dos machos. Nos tr?s artigos, a resposta comportamental dos machos adultos foi significativamente influenciada pela vocaliza??o, vis?o e contato f?sico com o infante. Os machos se aproximaram e passaram mais tempo pr?ximos da fonte sonora e se deslocaram mais durante exposi??o ? vocaliza??o. Al?m disso, machos se aproximaram, cheiraram e passaram mais tempo pr?ximo da caixa teste quando o infante estava presente. Nos dois primeiros artigos n?o foi encontrada diferen?a no padr?o comportamental dos animais com rela??o ? experi?ncia pr?via no cuidado. No terceiro artigo, a experi?ncia pr?via no cuidado influenciou significativamente o padr?o comportamental dos machos. Machos experientes recuperaram mais rapidamente e carregaram mais os filhotes que os inexperientes. Todavia, a lat?ncia de recupera??o diminui e o tempo de carregar aumentou nos inexperientes ap?s exposi??o sucessiva aos filhotes. Os n?veis plasm?ticos de cortisol variaram ap?s a exposi??o ? vocaliza??o de infantes, sendo significativamente mais elevados nos machos experientes. Quanto ao efeito da vis?o do filhote, os n?veis de cortisol n?o variaram ap?s a exposi??o, nem foram modificados pela experi?ncia pr?via do cuidador. A ocorr?ncia de intera??o social entre o cuidador e o filhote n?o modificou o perfil hormonal dos machos de sag?i; contudo, enquanto maior a dura??o os epis?dios de carregar pelos machos experientes menores os seus n?veis de cortisol. Assim, membros do grupo social ou cuidadores em potencial de sag?i expostos a pistas sensoriais de filhotes dependentes, como a vocaliza??o, vis?o, cheiro e contato f?sico, apresentam mudan?a em suas respostas comportamental e hormonal que s?o moduladores fisiol?gicos do comportamento de cuidado ? prole em sag?i. GEST?O DA INFORMA??O PARA O EMPREENDEDORISMO

Una de las características de las células bacterianas es la capacidad de adaptarse rápidamente a los frecuentes cambios en las condiciones ambientales del entorno donde se encuentran. En los procariotas la regulación de la expresión génica constituye una herramienta fundamental para dicha adaptación a las condiciones ambientales, posibilitando que tales cambios se vean reflejados en los patrones de expresión génica. La capacidad de modificar el patrón de expresión génica en función de parámetros ambientales es un aspecto crucial en la supervivencia tanto de bacterias que se encuentran en el medio ambiente externo como de bacterias patógenas localizadas en el interior de un organismo hospedador. En este trabajo el primer objetivo fue establecer un modelo de regulación del gen hilA de Salmonella por las proteínas asociadas a cromatina H-NS y Hha, para intentar posteriormente extrapolar este modelo a los reguladores de tipo HilA de la cepa de E. coli 042. Posteriormente, nos planteamos caracterizar el fenotipo resultante de la mutación hha en la cepa de E. coli 042. Los resultados obtenidos revelaron que el gen hilA se induce en fase estacionaria en cultivos crecidos en medio LB a 37ºC. Las proteínas asociadas a cromatina H-NS y Hha reprimen la expresión de hilA bajo un conjunto de condiciones ambientales. En condiciones de baja temperatura, es decir a 25ºC, H-NS posee los papeles mayoritarios en la represión de hilA. Bajo condiciones las cuales simularían la presencia de un hospedador, es decir 37ºC, H-NS deja de actuar y si tiene lugar la inducción de hilA en fase estacionaria. Además de los factores temperatura y osmolaridad que interfieren con la represión de hilA por H-NS se caracterizó la acción antagonista de la proteína IHF sobre la represión mediada por H-NS en el gen hilA utilizando ensayos de transcripción in vitro. En atención a las proteínas tipo HilA encontradas en la cepa de E. coli 042, se pudo caracterizar que ambas proteínas EilA e YgeH son capaces de complementar en trans la mutación hilA en la cepa de Salmonella SV5015. La activación de proteínas efectoras por parte de las proteínas EilA e YgeH en Salmonella parece tener lugar de la misma manera que HilA, a través de la activación del gen invF. Los resultados de regulación transcripcional de los genes eilA e ygeH revelaron una represión por parte de la proteína H-NS, y los ensayos de EMSA apoyan estos resultados. Existe una regulación cruzada entre las islas de patogenicidad ETT2 y eip de la cepa 042. La proteína EilA parece poder activar la expresión de EivF en ausencia de la proteína YgeH. El fenotipo encontrado en el mutante hha de la cepa de E. coli 042 se resume en un aumento de la agregación celular y una deficiencia en la formación de biofilms a 37ºC. El fenotipo es dependiente de temperatura, solamente se observa a 37ºC. Dados de proteómica obtenidos con la construcción AggR::3XFLAG revelaron una sobreexpresión del regulador transcripcional AggR en el mutante hha de la cepa de E. coli 042. Finalmente, la secuenciación masiva de ARN del mutante hha de la cepa de E. coli 042 apoyan estos resultados y revelaron que la transcripción del gen hha envuelve dos patrones diferentes en función de la temperatura. Mientras que a 37ºC la transcripción tiene lugar en la cadena codificante a 25ºC se produce también una importante transcripción en la cadena antisentido, lo que podría interpretarse como que, a baja temperatura se expresa menos el gen hha. / In this work our first goal was to understand and clarify the regulatory role of the nucleoid-associated proteins H-NS and Hha in the regulation of the master regulator of Salmonella pathogenicity island 1 (SPI1), the hilA gene. Due to the presence of HilA orthologous proteins of E. coli 042 strain (EilA and YgeH), we extrapolated the regulation patterns of hilA gene to eilA and ygeH genes. Subsequently, we characterized the phenotype of the hha mutant in the E. coli 042 strain. The results obtained on hilA regulation showed a high induction in the stationary phase of growth when cells were grown in LB medium at 37ºC. The H-NS and Hha proteins repressed the hilA expression under determinate environmental conditions. At low temperature (25ºC) H-NS repressed the hilA gene and Hha enhanced the repression. At high temperature (37ºC) H-NS no longer repressed hilA and the induction of hilA gene took place. Besides temperature and osmolarity factors that interfere with the repression of H-NS in the hilA gene, we characterized an antagonist effect of IHF protein in the H-NS-mediated repression of hilA gene using in vitro transcription assays. In relation to the HilA type proteins found in the strain of E. coli 042, YgeH and EilA, both proteins were able to complement in trans the hilA mutation in Salmonella strain SV5015. The activation of effector proteins by EilA and YgeH proteins in Salmonella seemed to work in the same way than HilA, through invF gene activation. The EMSA assays and the results of transcriptional regulation of genes and ygeH and eilA suggested a repression by H-NS. We also observed a cross-regulation pathway between pathogenicity islands eip and ETT2 in the E. coli 042 strain. EilA protein activated EivF expression in the absence of YgeH proteins. The phenotype found in the hha mutant in the strain of E. coli 042 was both an increase in cell aggregation and a deficiency in biofilm formation. The phenotype was temperature dependent, and it was only observed at 37°C. Proteomics results of the AggR::3xFLAG construction obtained, revealed an overexpression of the transcriptional regulator AggR in the mutant strain hha. Finally, the whole transcriptome shotgun sequencing of the hha mutant of the E. coli 042 supported these findings and revealed that hha gene transcription involved two different patterns depending on the temperature. The transcriptional data suggested that at 37°C the transcription occurred in the coding strand, while at 25°C the transcription occurred in the antisense strand.

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Tesis por compendio / La exposición crónica a sustancias de abuso lleva a cambios adaptativos en el cerebro que implican alteraciones en la expresión génica. Se ha propuesto que los factores de transcripción CREB y deltaFosB serían dianas moleculares para la regulación de la plasticidad, la cual lleva a la adicción.En este trabajo hemos estudiado los cambios en la activación de CREB, en PVN y NTS, y las quinasas que mediarían su activación durante la dependencia y síndrome de abstinencia a morfina, así como la respuesta del eje HHA durante dicho síndrome. También se investigó la posibilidad de que la activación de CREB y su coactivador transcripcional TORC1 dependan de la activación de receptores adrenérgicos. Además se evaluaron las posibles modificaciones en la expresión de FosB/deltaFosB en diferentes áreas cerebrales implicadas en la adicción, así como los cambios neuroendocrinos/neuroquímicos responsables de las alteraciones metabólicas observadas durante el tratamiento crónico con morfina. / Chronic exposure to opioids and other abused drugs results in adaptive changes in the brain involving alterations in gene expression. It is proposed that the transcription factors CREB and deltaFosB be molecular targets for the regulation of plasticity, which leads to addiction.In this work we studied changes in activation of the cAMP-response element binding protein (CREB) in PVN and NTS and the kinases that may mediate this activation during dependence and morphine withdrawal and the HPA axis response after naloxone-induced morphine withdrawal. We also investigated the possibility that the activation of CREB and the transcriptional coactivator of CREB, TORC1, arises from the activation of adrenergic receptors. We also evaluated the possible modifications in FosB/deltaFosB expression in several brain areas involved in addiction and neuroendocrine/neurochemical changes that are responsible for the metabolic alterations seen during chronic morphine treatment.

Les proteïnes bacterianes associades al nucleoide (NAPs) juguen un paper clau en l’organització, la replicació, la segregació, la reparació i l’expressió del cromosoma. L’estudi de nous membres de les famílies de NAPs, així com de proteïnes paràlogues a les ja conegudes, és important per entendre millor el seu paper biològic. Aquest projecte d’investigació té com a objectiu avançar en l’estudi de paràlegs a Escherichia coli de la proteïna Hha. Les proteïnes objecte d’estudi han estat YdgT, la subunitat θ de l’ADN polimerasa III (també anomenada en aquest treball HolE) i la proteïna YmgB. Pel que fa referència a YdgT, proteïna considerada fins al moment paràloga d’Hha, s’ha dut a terme una anàlisi transcriptòmica de mutants hha i ydgT per tal de comparar els corresponents patrons d’expressió gènica. Els mutants senzills hha i ydgT mostren un patró d’expressió gènica més diferent del que s’esperaria. De fet, el patró del mutant hha conté molts gens induïts mentre que en el mutant ydgT la majoria estan reprimits. Per tant, en general Hha té una funció repressora mentre que YdgT actuaria principalment com un activador. Dins del capítol dedicat a l’anàlisi de mutants hha i ydgT i durant l’estudi del fenotip del doble mutant hha ydgT, es van obtenir uns resultats prou rellevants com per ser considerats un nou apartat dins del present treball. Es tracta de la detecció i anàlisi de l’origen de clons no hemolítics que apareixen en mutants hha ydgT portadors del plasmidi hemolític pANN202-312R en plaques d’agar sang que contenen l’antibiòtic kanamicina. La presència de kanamicina (marcador de la mutació hha) és la causant de l’aparició de colònies sense halo d’hemòlisi. En el present estudi s’han identificat les regions per on es produeix l’escissió i s’ha observat que pertanyen a seqüències d'inserció IS91 parcials. Aquest procés s’ha estudiat també en una soca salvatge amb un plasmidi parental de baix número de còpies (pHly152) en presència de concentracions subinhibitòries de kanamicina i d’ampicil•lina. Pel que fa a la subunitat θ del nucli de l’ADN polimerasa III, s’ha detectat una similitud estructural amb la proteïna associada al nucleoide Hha. En aquest cas, també s’ha realitzat l’anàlisi transcriptòmica del mutant en aquesta subunitat (holE). Això ha permès comprovar que el conjunt de gens alterats en un mutant holE és molt més similar al del mutant ydgT que al del mutant hha. Una part significativa dels gens comuns alterats en els mutants holE i ydgT pertanyen a operons de motilitat, seqüències intergèniques i ARN petits. Aquests resultats i la recent publicació dels estudis que relacionen la sobreexpressió d’ydgT amb la complementació del fenotip de recuperació de la polaritat transcripcional en mutants rho, han permès atribuir també a la subunitat θ de l’ADN polimerasa III un paper en processos de terminació prematura de la transcripció. En el cas de la proteïna YmgB, els estudis duts a terme en aquest treball estableixen noves relacions entre aquesta proteïna i les proteïnes associades al nucleoide H-NS/Hha. Els resultats més interessants que aporta aquest treball s’han obtingut sobreexpressant ymgB. L’anàlisi de l’efecte de la sobreexpressió d’ymgB sobre el patró d’expressió de proteïnes ha permès evidenciar la regulació d’enzims relacionats amb la resistència a l’àcid (lisina descarboxilasa i glutamat descarboxilasa) i de la proteïna ribosomal L2, la qual sembla jugar un paper en la traducció. A més, la sobreexpressió d’ymgB té efectes sobre l’expressió de les proteïnes associades al nucleoide H-NS i Hha, així com sobre l’expressió de gens regulats per aquestes (bgl, proU i hly). / The bacterial nucleoid-associated proteins (NAPs) play a key role in the organization, replication, segregation, repair and expression of the chromosome. The study of new members of NAP families, as well as paralogue proteins of the ones which are already known, is important in order to understand their biological roles better. This research project aims to advance the study of paralogues of protein Hha in Escherichia coli. The proteins which were studied were YdgT, the θ subunit of DNA polymerase III and the protein YmgB. With regard to YdgT, a protein considered until now a paralogue of Hha, we carried out a transcriptomic analysis of hha and ydgT mutants and we compared the corresponding patterns of gene expression. We found out that in general Hha has a repressor function, while YdgT acts mainly as an activator. In the chapter which is dedicated to the analysis of hha and ydgT mutants and during the study of the phenotype of the double mutant hha ydgT, we obtained results relevant enough to be considered as a new section in the present work. This is the detection and analysis of the origin of non-hemolytic clones appearing in hha ydgT mutants carrying the hemolytic plasmid pANN202 312R in blood agar plates containing the antibiotic Kanamycin. Looking at the θ subunit of DNA polymerase III, initially we could detect a structural similarity to the Hha protein. In this case, we also performed a transcriptomic analysis of the mutant in this subunit (holE). This has revealed that the set of genes altered in a holE mutant is much more similar to the set of the ydgT mutant than the one of the hha mutant. A significant proportion of common genes altered in the holE and ydgT mutants belongs to motility operons, intergenic sequences and small RNA. These results and the recent publication of studies that link overexpression of ydgT to the complementation of the phenotype of recovery of transcriptional polarity in rho mutants, have allowed us to attribute to HolE a role in the process of premature transcription termination. Finally and regarding the protein YmgB, research conducted in this study establishes new relationships between this protein and nucleoid-associated proteins H-NS/Hha. The most interesting results provided by this study were obtained by overexpressing ymgB.

Morphine withdrawal increases the HPA axis activity, which is dependent on a hyperactivity of noradrenergic pathways (NTS-A2) innervating the PVN. In this Thesis we found that morphine withdrawal resulted in an increase in ACTH and corticosterone secretion and a neuronal activation in the PVN. Additionally, we found robust increases in CRF and AVP hnRNAs in the PVN, concomitantly with an increase in c-Fos expression. Morphine withdrawal activated ERK1/2 in PVN and NTS, which could be involved in the c-Fos expression. Morphine withdrawal induced an increase in TH mRNA levels in the NTS-A2, total TH protein in the NTS and TH phosphorylation at Ser31 in PVN and NTS-A2, which resulted in an augmentation of TH activity in the PVN. The enhancement in TH phosphorylated at Ser31 was blocked by SL327 in both nuclei. Finally, we have found that adrenalectomy eliminated the hyperactivity of noradrenergic pathways innervating the PVN during morphine withdrawal. / La abstinencia a morfina aumenta la actividad del eje HHA, que depende de la hiperactivación de las vías noradrenérgicas (NTS-A2) que inervan al PVN. En esta Tesis encontramos que la abstinencia a morfina induce la liberación de ACTH y corticosterona y la activación neuronal del PVN. Además, observamos un aumento en los niveles de hnRNA para CRF y AVP en el PVN, concomitantemente con un incremento en la expresión de c-Fos. El síndrome de abstinencia a morfina activó a ERK1/2 en PVN y NTS. También indujo un incremento en el mRNA para TH en el NTS-A2, proteína TH total y fosforilación de TH en su Ser31 en PVN y NTS-A2, que se tradujo en un aumento en su actividad enzimática. El aumento de TH fosforilada en Ser31 fue bloqueado por SL327. Finalmente, la adrenalectomía eliminó la hiperactividad de las vías noradrenérgicas que inervan al PVN durante la abstinencia a morfina.

This study focuses on the discretionary inter vivos trust. It specifically investigates what the discretion of a trustee comprises and in which circumstances (if any) the court may amend the trustee‟s discretion as stipulated in the deed of trust. In order to make any meaningful conclusions, the different types of trusts, and more specific the way in which trusts are classified, needs to be researched. An inter vivos trust is classified as a contract for the sake of a third. Consequently contract law rules are applied in the interpretation and amendment of an inter vivos trust. The source, goal and tenor of a trustee‟s discretion, as well as the circumstances wherein this discretion may be amended, are investigated. The general rule is that courts have no discretion to amend a trust, but there is an exception to the rule. In accordance with article 13 of the Trust Property Control Act 57 of 1988 courts do have the power to amend or cancel the deed of trust in certain circumstances. In Potgieter and Another v Potgieter NO and Others 2012 (1) SA 637 (HHA) the court ruled that the power granted by article 13 does not enable judges to create law by amendment of the deed of trust according to their subjective interpretation of what is fair and just. The facts of the Potgieter case serve as problem statement for this study by focusing on the problems and unjust consequences of the strict application of contract law rules on a trust when the court does not take the changing circumstances of the trust founder into account. / LLM (Estate Law), North-West University, Potchefstroom Campus, 2014

This study focuses on the discretionary inter vivos trust. It specifically investigates what the discretion of a trustee comprises and in which circumstances (if any) the court may amend the trustee‟s discretion as stipulated in the deed of trust. In order to make any meaningful conclusions, the different types of trusts, and more specific the way in which trusts are classified, needs to be researched. An inter vivos trust is classified as a contract for the sake of a third. Consequently contract law rules are applied in the interpretation and amendment of an inter vivos trust. The source, goal and tenor of a trustee‟s discretion, as well as the circumstances wherein this discretion may be amended, are investigated. The general rule is that courts have no discretion to amend a trust, but there is an exception to the rule. In accordance with article 13 of the Trust Property Control Act 57 of 1988 courts do have the power to amend or cancel the deed of trust in certain circumstances. In Potgieter and Another v Potgieter NO and Others 2012 (1) SA 637 (HHA) the court ruled that the power granted by article 13 does not enable judges to create law by amendment of the deed of trust according to their subjective interpretation of what is fair and just. The facts of the Potgieter case serve as problem statement for this study by focusing on the problems and unjust consequences of the strict application of contract law rules on a trust when the court does not take the changing circumstances of the trust founder into account. / LLM (Estate Law), North-West University, Potchefstroom Campus, 2014