Orientador : Christiane Pienna Soares / Banca: Raquel Alves dos Santos / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Banca: André Gonzaga dos Santos / Banca: Luis Octávio Regasini / Resumo: As atividades biológicas e farmacológicas dos biflavonoides são diversas incluindo suas propriedades imunossupressivas, anticancerígenas, antioxidantes, antiangiogênicas, antibacterianas, antivirais e antifúngicas. No presente estudo, avaliou-se a potencial capacidade do biflavonoide morelloflavona, isolada de Garcinia xanthochymus, em modular a expressão de HLA-G (Human Leukocyte Antigen- G), bem como seu potencial efeito quimiopreventivo. Inicialmente, foi avaliado o índice de morte celular causado pela morelloflavona por meio do ensaio de Anexina V - Iodeto de proídio em PBMC (Células mononucleares do sangue periférico), o qual apresentou índices de morte celular significantes. Através da citometria de fluxo observou-se um aumento da expressão de HLA-G vinculado à membrana celular em linhagens de melanoma (FON) (p < 0,001). Pôde-se observar a indução de HLA-G solúvel em linhagens de melanoma transfectada (M8-HLA-G1) (p < 0,001), sem alteração para os demais tipos celulares estudados, pelo ensaio imunoenzimático- ELISA. A expressão de RNAm de HLA-G também foi induzida pela morelloflavona, observada pela RT- PCR, em células de melanoma M8 que não expressam HLA-G constitutivamente. Ainda, foi avaliada a atividade quimiopreventiva da morelloflavona. Observou-se a duplicação da atividade da enzima quinona redutase na linhagem de hepatocarcinoma celular (Hepa1c1c7) por meio do ensaio quinona redutase. Pelo ensaio do cometa foi possível verificar a capacidade genotóxica e antigenotóxica. Em relação à antigenotoxicidade, a morelloflavona causou dano de DNA no pré-tratamento. No pós-tratamento foi observado que a morelloflavona pode ter a capacidade de reverter danos de DNA causados pelo peróxido de hidrogênio. Sendo assim, os dados demonstrados revelam que a morelloflavona induz a expressão de HLA-G e possui efeito quimiopreventivo. / Abstract: The biological and pharmacological activities of biflavonoids are diverse, including their immunosuppressive, anticancer, antioxidant, antiangiogenic, antibacterial, antiviral and antifungal properties. In the present study we assessed the potential ability of morelloflavone, a biflavonoid isolated from Garcinia xanthochymus in modulating the expression of HLA-G (Human Leukocyte Antigen-G), as well as their potential chemopreventive effect. First, we measured the rate of cell death by morelloflavone using Annexin V - Propidium iodide assay in PBMC (peripheral blood mononuclear cells), which showed significant levels of cell death. By flow cytometry was observed the increased expression of HLA-G membrane bound in melanoma cells line (FON) (p < 0.001). Also, was observed the induction of HLA-G soluble in transfected melanoma cells line (M8-HLA-G1) (p < 0.001), with no change to other cell types studied by Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA. The expression of HLA-G mRNA was also induced by morelloflavone, observed by RT-PCR, in melanoma cells (M8) that do not express HLA-G constitutively. Still, we evaluated the chemopreventive activity of morelloflavone. We observed a doubling of quinone reductase enzyme activity in hepatocellular carcinoma cells line (Hepa1c1c7) by quinone reductase assay. By comet assay we were able to verify the genotoxic and antigenotoxic capacity. Regarding antigenotoxicity, morelloflavone caused DNA damage pre treatment. In the posttreatment was observed that morelloflavone may be capable of reversing DNA damage caused by hydrogen peroxide. Thus, the data show that morelloflavone induces the expression of HLA-G and has chemopreventive effect. / Doutor

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A epidemia da aids é caracterizada por uma alta heterogeneidade no curso clínico da infecção pelo HIV-1. Enquanto alguns indivíduos progridem para aids em até três anos após a soroconversão, uma pequena parcela, chamada de progressores lentos, permanece assintomática e mantém seus níveis de T-CD4+ estáveis por mais de 10 anos. O papel das moléculas de HLA classe I, tais como HLA-A e HLA-B tem sido investigado para tentar explicar as diferenças observadas na progressão da infecção pelo HIV-1. Estudos recentes têm chamado a atenção para o papel dos genes de classe I não clássicos, como HLA-G, visto que esta molécula está envolvida na supressão da resposta do sistema imunológico durante as infecções virais. No presente estudo, noventa e oito pacientes com critérios bem definidos de progressão à aids foram selecionados, dos quais 48 foram classificados como progressores crônicos, 29 como progressores lentos e 21 como progressores rápidos. Nossos resultados suportam o papel do genótipo homozigoto para HLA na rápida progressão para a aids, assim como a o efeito protetor do alelo HLA-A*3 no tempo de progressão da infecção. Além disso, este é o primeiro trabalho que investiga a influência dos polimorfismos 14pb inserção/deleção e +3142 G/C do gene HLA-G na progressão para a aids e os resultados obtidos apontam para um importante papel desta molécula na progressão da doença. A ausência de marcadores genéticos classicamente envolvidos com a progressão rápida e lenta para a aids, neste grupo de pacientes HIV positivos, enfatiza a importância de estudos genéticos em diferentes populações. / The AIDS epidemic is characterized by an extreme heterogeneity in the clinical course of HIV-1 infection. Whereas some individuals progress to AIDS within three years after seroconversion, a small percentage, called long-term nonprogressors, remain asymptomatic and maintain stable T-CD4+ cell counts for more than 10 years. The role of HLA class I molecules, such as HLA-A and HLA-B, have been investigated to explain the differences observed on progression to AIDS. Recent studies have focused on the potential effect of non-classical HLA I genes, as HLA- G, since this molecule is involved in the suppression of immune responses against viral infections. In the present study, ninety-eight patients with well defined criteria of clinical progression to AIDS were selected, of which 48 subjects were classified as chronic progressors, 29 as long-term nonprogressors and 21 as rapid progressors. Our results support the role of HLA homozygous genotypes on rapid progression to AIDS as well as the protective effect of the HLA-A*3 allele in the progression of the infection. Furthermore, this is the first study that assessed the influence of the HLA-G polymorphisms 14bp insertion/deletion and +3142 G/C on AIDS progression and the results obtained indicate an important role of this molecule on AIDS progression. The absence of classical genetic markers related to rapid and long-term nonprogression to AIDS in this group of HIV-infected patients emphasizes the importance of study genetic diversity among different populations.

Made available in DSpace on 2016-05-11T12:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 jessica_silva_ioc_mest_2015.pdf: 2328113 bytes, checksum: b930ef473cd389fd3c0702a994f45595 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus dengue é caracterizado por quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1 a 4), apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas, em que o risco de desenvolvimento das formas graves está parcialmente relacionado com a resposta imune de reatividade cruzada a sorotipos heterólogos. Os alelos do antígeno leucocitário humano (HLA) de classe I e classe II têm sido correlacionados com a susceptibilidade à dengue grave em diferentes populações. Neste estudo, nosso objetivo foi associar a frequência dos alelos do HLA de classe I e II de pacientes com dengue, caracterizados pela infecção por diferentes sorotipos e apresentando diferentes manifestações clínicas, com as frequências de células T produtoras de IL-2, IFN-g e Granzima B, e também com o perfil de ativação destas células em resposta ao antígeno total de DENV-2 (DENV-2 Ag). Utilizamos uma coorte de 60 pacientes naturalmente infectados de diferentes epidemias com prevalência de DENV-1, 2 e 4. Entre os pacientes, 36 deles foram classificados como dengue (FD) e 24 deles como FD com sinais de alerta mais graves (FDSA/Graves) de acordo com a OMS, 2009. A tipagem de alelos de HLA de classe I e II foi realizada utilizando Luminex de múltiplas análises (One Lambda, CA). As células de pacientes foram cultivadas com DENV-2 Ag (isolado de um paciente brasileiro) para a realização dos ensaios de FluoroSpot de IFN-\03B3/IL-2/Granzima B. Em seguida, recuperamos gentilmente as células após a estimulação e realizamos a marcação extracelular com marcadores de ativação (CD45RO, CCR7 e CD62L) por citometria de fluxo. Para as análises estatísticas os testes T pareado, não paramétrico Mann Whitney U, Wilcoxon e as análises com o RATE foram utilizadas Desta forma, a frequência gênica dos HLA classe I mais frequentes em nossa coorte de pacientes DENV+ (>5%) inclui 6 alelos HLA-A (A*02, A*30, A*24, A*03, A*23 e A*01), 7 alelos HLA-B (B*51, B*35, B*44, B*15, B*07, B*58 e B*40), e 7 alelos HLA-C (C*07, C*04, C*03, C*06, C*15, C*08 e C*05). Para o HLA de classe II, 4 alelos HLA-DQA1 (*01, *05, *03 e *02), 5 alelos HLA-DQB1 (*03, *02, *06, *05 e *04) and 8 alelos HLA-DRB1 (*13, *04, *03, *07, *11, *01, *15 e *16). Destes, 2 alelos foram associados com aumento da susceptibilidade (alelo HLA-A*03, p=0.024) ou resistência (alelo HLA-B*15, p=0.034) ao desenvolvimento de FDSA/Grave. Além disso, 6 alelos foram associados com contagem de plaquetas abaixo de 150 mil/mm3 (alelo HLA-B*35, p=0.02, HLA-C*04, p=0.04 e supertipo A03, p=0.003) ou acima de 150 mil/mm3 (HLA-DQA1*02, p=0.033, HLA-DRB1*07, p=0.022 e supertipo A24, p=0.03). Nós demonstramos um aumento de células T produtoras de IFN-\03B3 específicas ao DENV-2 Ag em pacientes FD, mas não em pacientes FDSA/Grave, em comparação com a condição de estímulo basal. No entanto, nenhuma reposta restrita a alelos de HLA foi associada com células produtoras de IFN-\03B3, mas o alelo HLA-C*03 foi associado com células T produtoras de Granzima B após estimulação com DENV-2 Ag. Por fim, também avaliamos a frequencia de subpopulações de linfócitos T A maior parte da resposta de linfócitos T CD4+ após estímulo com DENV-2 Ag foi da subpopulação de linfócitos T CD4 CD45ROposCCR7negCD62Lneg, caracterizado por linfócitos T de memória efetora/efetor. A ausência desta resposta foi associada ao alelo HLA-B*58. Portanto, corroborando estudos anteriores, a expressão de certas moléculas de HLA contribuem com a susceptibilidade ou proteção ao desenvolvimento de formas graves da doença. Além disso, dois dos alelos mais frequentes em nossa coorte de pacientes parecem estar relacionados com uma resposta imune de alta magnitude, e, portanto, uma possível resposta imunoprotetora / The dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV-1 to 4), characterized by a broad spectrum of clinical manifestations, in which the risk of developing the severe forms is partially related to the cross-reactive immune responses with heterologous serotypes. Human leukocyte antigen (HLA) class I and class II alleles have been correlated with susceptibility to severe dengue in different populations. In this study, our goal is to associate the HLA class I and II allele frequency from dengue patients, characterized by different serotypes infection and clinical outcomes, with the frequencies of the IL-2, IFN-g and Granzyme B-producing T-cells and also with the profile of activation of these cells in response to DENV-2 antigen. We proceeded in a cohort of 60 naturally infected patients from different epidemics with prevalence of DENV-1, 2 and 4. Among patients, 36 of them classified as dengue fever (DF) and 24 of them as DF with warning signs plus severe (DFWS/S) according to WHO 2009. The profile of HLA class I and II alleles were typed using a Luminex Multi-analyte profiling system (One Lambda, CA). Cells from patients were cultured with DENV-2 Antigen (DENV-2 Ag isolated from a Brazilian patient) for realizing IFN-\03B3/IL-2/Granzyme-B FluoroSpot assays. Then, we gently recovered these cells after stimulation and submitted them to the activation markers (CD45RO, CCR7 and CD62L) extracellular staining by flow cytometry assay The paired t test, nonparametric t test Mann Witney U, Wilcoxon and RATE analysis were used. Briefly, the genotypic frequency of the highly prevalent HLA class I found in our DENV-patients (>5%) included six HLA-A alleles (A*02, A*30, A*24, A*03, A*23 and A*01), seven HLA-B alleles (B*51, B*35, B*44, B*15, B*07, B*58 and B*40), and seven HLA-C alleles (C*07, C*04, C*03, C*06, C*15, C*08 and C*05). For HLA class II, four HLA-DQA1 alleles (*01, *05, *03 and *02), five HLA-DQB1 alleles (*03, *02, *06, *05 and *04) and eight HLA-DRB1 alleles (*13, *04, *03, *07, *11, *01, *15 and *16). These two alleles were associated with increased susceptibility (HLA-A*03 allele, p=0.024) or resistance (HLA-B*15 allele, p=0.034) to DFWS/Severe DENV clinical outcomes. Besides, six alleles were associated with platelets count bellow 150 mil/mm3 (HLA-B*35 allele, p=0.02, HLA-C*04, p=0.04 and supertype A03, p=0.003) or up 150 mil/mm3 (HLA-DQA1*02, p=0.033, HLA-DRB1*07, p=0.022 and supertype A24, p=0.03). We demonstrated an increased DENV Ag-specific IFN-\03B3-producing T cells in DF patients, but not in DFWS/Severe patients, in relation to unstimulated conditions. However, no HLA allele restricted responses were associated with the IFN-g-producing T cells, but HLA-C*03 allele was associated with the granzyme B-producing T cells following DENV-2 Ag stimulation. In the same series of experiment, we also tested the frequency T cells subsets The majority of the CD4+ T-cell responses after DENV-2 Ag stimulation were CD45ROposCCR7negCD62Lneg CD4 T-cells subsets, characterized by effector/effector memory T-cells. This response was mostly associated with HLA-B*58 allele. Therefore, confirming previous studies the expression of certain HLA molecules contribute with susceptibility to or protection from severe clinical outcome. Moreover, two of the most frequent alleles seen in our patients appear to be involved in a higher magnitude of immune response and therefore a more immunoprotective response

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Orientadora : Profª Drª Maria da Graça Bicalho / Co-orientador : Prof. Dr. Sandro Carvalho Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 25/03/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Genética / Resumo: O papel de HLA-G em meio a mecanismos de imunotolerância vem sendo cada vez mais elucidado. A sua atuação na imunomodulação se extende desde a interface materno-fetal, a condições patológicas, assim como em transplantes de coração, rim, fígado e pâncreas. O HLA-G apresenta isoformas que podem ser expressas tanto ligadas a membrana celular, como solúveis (sHLA-G), podendo ser esta a forma detectada circulante no plasma. A secreção das moléculas HLA-G ocorre por meio de células que estão envolvidas nos mecanismos específicos de inibição da resposta imune. Polimorfismos genéticos também são observados no gene HLA-G influenciando a sua função biológica através da alteração dos níveis de transcrição gênica ou até alterando a afinidade de HLA-G com seus ligantes. Neste estudo foi investigado a influência de HLA-G no perfil imunológico de pacientes transplantados renais. No total 100 pacientes pertencentes ao HUEC (Hospital Univesitário Evangélico de Curitiba) foram genotipados para HLA-G e, dentre estes, 36 pacientes foram monitorados do pré ao pós-transplante com relação aos níveis de sHLA-G no plasma. A genotipagem foi realizada utilizando o kit para HLA-G da SBTcomercial (GenDx) e a quantificação utilizando o kit ELISA (Exbio, Praga, República Checa) para as isoformas mais abundantes: o sHLA-G1 e - G5. As freqüências alélicas observadas foram de acordo com o relatado previamente para as populações brasileiras, com exceção de seis alelos (G*01:01:15 , G*01:01:17 , G*01:01:20 , G*01:04:03, G*01:04:05 e G*01:08), que não tinham sido descritos anteriormente. Ainda, foram identificados dois novos alelos HLA-G, cada um compondo o genótipo heterozigoto de dois pascientes transplantados renais. Os níveis de sHLA-G quantificados apresentaram variação expressiva do pré ao pós-transplante entre os indivíduos transplantados sensibilizados comparados àqueles indivíduos dessensibilizados (tratados via protocolo de indução com ATG). Com os resultados deste estudo, esperamos melhor explicar o papel do HLA-G em relação ao aumento da sobrevida de aloenxertos, assim como auxiliar na exploração desta molécula como uma potencial biomarcadora positiva da resposta imune dos pacientes transplantados em relação aos protocolos de imunossupressão à que são submetidos. Palavras-chaves: Transplante renal. HLA-G. Imunotolerância. / Abstract: The role of HLA-G through the immune tolerance mechanisms has been increasingly elucidated. Its performance in immunomodulation extends from the maternal-fetal interface, in pathological conditions, as well as in heart, kidney, liver and pancreas transplants. HLA-G has isoforms that can be expressed and stays membrane bound or as a soluble (sHLA-G) isoform, which can be detected in the plasma of patients. The secretion of sHLA-G occurs through immune cells involved in the specific inhibition mechanisms of immune response. There are also genetic polymorphisms observed in HLA-G gene, which can influence its biological function by altering transcription levels of this gene or even altering the affinity of HLA-G with ligants. In this study we investigated the influence of HLA-G in immune profile from kidney transplant patients. In total of 100 patients belonging to HUEC were genotyped and, among these, 36 transplant patients were monitored from pre to post-transplant with respect to sHLA-G levels in plasma. Genotyping was performed using the commercial SBT kit for HLA-G (GenDx) and quantified using the ELISA kit (Exbio , Prague , Czech Republic) for the most abundant isoforms: sHLA-G1 and -G5. The allele frequencies were in accordance with previously studies reported for Brazilian populations, with the exception of six alleles (G*01:01:15 , G*01:01:17 , G*01:01:20 , G*01:04:03, G*01:04:05 e G*01:08), which had not been previously described. Furthermore, two new HLA-G alleles have been identified, each one composing the heterozygous genotype of two kidney transplant patients. The quantified levels of sHLA-G have had significant variations in the pre to post-transplant from sensitized individuals when compared with desensitized individuals (treated by an induction protocol using ATG). Thus with the results of this study, we hope to better explain the role of HLA-G in relation to the increased survival of allografts, as well as support in the exploration of this molecule as a positive potential marker of the transplant patients response to immunosuppression protocols. Key-words: Kidney transplant. HLA-G. Immunotolerance.

Genome-wide association (GWA) studies confirmed that the HLA genes were strongly associated with schizophrenia but the HLA variants identified by GWA studies had a lower frequency in patients with schizophrenia than control subjects. The HLA molecules have function of presenting peptide antigens to T lymphocytes in order to initiate an immune response. Environmental factors such as infection and dietary proteins have been found to be associated with schizophrenia. This PhD program has thus focused on the following objectives: (1) identification of genetic variants for schizophrenia in the HLA region and (2) investigation of circulating antibodies to linear peptide antigens derived from wheat gluten in schizophrenia. The major findings from this work are as follows: 1. The HLA-DQ2.5 variants were strongly associated with schizophrenia; this finding is consistent with that from GWA study. 2. The NOTCH4 association was replicated in our study samples, in which a CNV in exon 19 of the gene may be associated with risk of schizophrenia. 3. There was no HLA-II variant identified to be associated with a high risk of schizophrenia but a CNV present in the HLA-DQ/DR region might confer risk of the disease. 4. The levels of circulating antibodies to linear peptide antigens derived from wheat gluten were significantly lower in schizophrenia patients than controls. This finding is inconsistent with previous studies that showed elevated levels of circulating antibodies in schizophrenia across subpopulations. In conclusion, it is likely that not one but many HLA variants lead to risk of schizophrenia development. From this research it is likely that anti-gluten antibodies are not an environmental trigger for this disease. Further investigation is needed to clarify the role of the HLA region in bridging the gap between genetic make-up and environmental factors in developing schizophrenia.

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A epidemia da aids é caracterizada por uma alta heterogeneidade no curso clínico da infecção pelo HIV-1. Enquanto alguns indivíduos progridem para aids em até três anos após a soroconversão, uma pequena parcela, chamada de progressores lentos, permanece assintomática e mantém seus níveis de T-CD4+ estáveis por mais de 10 anos. O papel das moléculas de HLA classe I, tais como HLA-A e HLA-B tem sido investigado para tentar explicar as diferenças observadas na progressão da infecção pelo HIV-1. Estudos recentes têm chamado a atenção para o papel dos genes de classe I não clássicos, como HLA-G, visto que esta molécula está envolvida na supressão da resposta do sistema imunológico durante as infecções virais. No presente estudo, noventa e oito pacientes com critérios bem definidos de progressão à aids foram selecionados, dos quais 48 foram classificados como progressores crônicos, 29 como progressores lentos e 21 como progressores rápidos. Nossos resultados suportam o papel do genótipo homozigoto para HLA na rápida progressão para a aids, assim como a o efeito protetor do alelo HLA-A*3 no tempo de progressão da infecção. Além disso, este é o primeiro trabalho que investiga a influência dos polimorfismos 14pb inserção/deleção e +3142 G/C do gene HLA-G na progressão para a aids e os resultados obtidos apontam para um importante papel desta molécula na progressão da doença. A ausência de marcadores genéticos classicamente envolvidos com a progressão rápida e lenta para a aids, neste grupo de pacientes HIV positivos, enfatiza a importância de estudos genéticos em diferentes populações. / The AIDS epidemic is characterized by an extreme heterogeneity in the clinical course of HIV-1 infection. Whereas some individuals progress to AIDS within three years after seroconversion, a small percentage, called long-term nonprogressors, remain asymptomatic and maintain stable T-CD4+ cell counts for more than 10 years. The role of HLA class I molecules, such as HLA-A and HLA-B, have been investigated to explain the differences observed on progression to AIDS. Recent studies have focused on the potential effect of non-classical HLA I genes, as HLA- G, since this molecule is involved in the suppression of immune responses against viral infections. In the present study, ninety-eight patients with well defined criteria of clinical progression to AIDS were selected, of which 48 subjects were classified as chronic progressors, 29 as long-term nonprogressors and 21 as rapid progressors. Our results support the role of HLA homozygous genotypes on rapid progression to AIDS as well as the protective effect of the HLA-A*3 allele in the progression of the infection. Furthermore, this is the first study that assessed the influence of the HLA-G polymorphisms 14bp insertion/deletion and +3142 G/C on AIDS progression and the results obtained indicate an important role of this molecule on AIDS progression. The absence of classical genetic markers related to rapid and long-term nonprogression to AIDS in this group of HIV-infected patients emphasizes the importance of study genetic diversity among different populations.

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