O eixo hipotálamo-pituitária-adrenal é o principal sistema neuroendócrino envolvido na regulação e adaptação da resposta ao estresse e, o principal hormônio secretado é o cortisol. O cortisol exerce seus efeitos por meio dos receptores mineralocorticoide (MR) e glicocorticoide (GR). Variações nos genes desses receptores têm sido associadas à sensibilidade aos glicocorticoides e mudanças no perfil metabólico. O objetivo geral desse trabalho foi compreender a variabilidade existente em relação às respostas fisiológicas de bovinos por meio da identificação de polimorfismos genéticos em genes envolvidos na resposta ao estresse e, verificar as consequências dessa variação genética em características de qualidade da carne. Dessa forma, três abordagens foram propostas: (1) avaliar a incidência de carne DFD (dark, firm and dry) e seu impacto no perfil metabólico, endócrino e características de qualidade da carne bovina, uma vez que o estresse é um dos principais fatores que levam a essa condição desfavorável; (2) avaliar a contribuição de fatores genéticos, por meio da identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), no gene do MR e GR, e suas associações com as características mensuradas; (3) avaliar os efeitos desses polimorfismos sobre o perfil proteico do músculo bovino. Foram utilizados 241 bovinos da raça Nelore. Os resultados evidenciaram implicações direta do pH 24 horas post-mortem nos atributos de cor e perdas por cozimento da carne. A incidência de carnes DFD (pH>=5,8) foi de 18,7%. Os polimorfismos identificados mostraram influenciar em algumas características mensuradas. Os SNPs NR3C2_1 e NR3C2_2 no gene do MR foram associados ao conteúdo de glicogênio muscular e nível plasmático do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) post-mortem, e o SNP NR3C1_1 no gene do GR foi associado aos níveis plasmático de cortisol post-mortem. As análises proteômicas demonstraram que a maioria das proteínas reguladas por esses SNPs estão envolvidas na contração muscular, metabolismo e defesa celular. Portanto, é possível inferir que o pH tem impacto nas características de qualidade da carne e que polimorfismos em MR e o GR levam a mudanças na atividade do eixo HPA, no perfil metabólico do organismo e no perfil proteico do músculo, sugerindo que esses genes estão envolvidos em uma complexidade de funções e podendo ser alvos de estudos em sistemas de produção que visam melhorar a produtividade. / The hypothalamic-pituitary-adrenal axis is the main neuroendocrine system involved in the regulation and adaptation in stress response and the primary hormone secreted is cortisol. Cortisol exerts its effects through the mineralocorticoid (MR) and glucocorticoid (GR) receptors. Variations in the genes of these receptors have been associated with sensitivity to glucocorticoids and changes in the metabolic profile. The general objective of this work was to understand the variability in relation to physiological responses of cattle through identification of genetic polymorphisms in genes involved in stress response and, checking the consequences of this genetic variation in meat quality traits. Thus, three approaches have been proposed: (1) evaluate the incidence of DFD meat (dark, firm and dry) and its impact on metabolics, endocrines profiles and meat quality traits, since stress is the major factor that lead to this unfavorable condition; (2) evaluate the contribution of genetic factors through identification single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the MR and GR gene and its association with the measured traits; (3) evaluate the effects of these polymorphisms on the protein profile of bovine muscle. A total of 241 Nellore cattle were used. The results evidenced direct implications of 24 hours pH post-mortem in color attributes and cooking losses. The incidence of DFD meat (pH >= 5.8) was 18.7%. The polymorphisms identified demonstrated to influence some on measured characteristics. The NR3C2_1 and NR3C2_2 SNPs in MR gene were associated with muscle glycogen content and post-mortem adrenocorticotropic hormone (ACTH) plasma levels and, the NR3C1_1 SNP in GR was associated with post-mortem cortisol plasma levels. The proteomic analysis demonstrated that most proteins regulated by these SNPs are involved in muscle contraction, metabolism and cellular defense. Therefore, it is possible to infer that pH has impact on meat quality traits and MR and GR polymorphisms lead to changes in the HPA axis activity, metabolic profile and protein muscle profile, suggesting that these genes are involved in a complexity of functions and may be targets for studies on production systems to improve productivity.

Primeiramente, investigamos as respostas defensivas de animais lesionados da parte dorsal da PAG rostral durante o confronto predatório. Estes animais permaneciam com as respostas de avaliação de risco (AR) porem perdem as respostas de freezing. Em um segundo estudo, analisamos as respostas defensivas frente ao predador em animais lesionados da parte ventrolateral da PAG caudal. Estes animais perdem as respostas de freezing e aumentam as respostas de AR. Será que as respostas de AR dependem da integridade da parte dorsal rostral e ventrolateral caudal da PAG ? Por último, investigamos as respostas defensivas em animais com lesão combinada destas áreas. Observamos uma diminuição drástica das AR e um aumento das respostas exploratórias. Provavelmente, as respostas de AR estão sendo moduladas pela parte dorsal rostral e ventrolateral caudal da PAG através de seus alvos ascendentes hipotalâmicos, e estes com o septo lateral. As respostas de freezing parecem ser moduladas por projeções descendentes da PAG para a medula espinal. / First, we investigated the defensive responses of injured animals of the dorsal part of the rostral PAG during predatory confrontation. These animals remained with the risk assessment responses (AR) however lose the freezing of response. In a second study, we analyzed the defensive responses front predator injured animals in the ventrolateral part of the caudal PAG. These animals lose the responses of freezing and increase AR responses. Does the AR responses depend on the integrity of dorsal part rostral and caudal ventrolateral PAG? Finally, we investigated the defensive responses in animals with combined injury of these areas. We observed a dramatic decrease of AR and an increase in exploratory response. Probably AR responses are modulated by the dorsal part of the rostral and caudal ventrolateral PAG through its hypothalamic ascendant targets, and these with the lateral septum. Freezing responses appear to be modulated by descending projections from the PAG to the spinal cord.

Introdução: A Depressão é uma condição relativamente comum, de curso crónico, recorrente, estando frequentemente associada com incapacitação funcional e comprometimento da saúde física. Entre os fatores associados, encontram-se situações de abuso e negligência, entre outros. O eixo Hipotálamo-Pituitária-Adrenal (HPA) desempenha um papel fundamental na resposta aos estímulos externos e internos, podendo desencadear episódios psiquiátricos em indivíduos predispostos. Além disso, estudos têm corroborado que alterações no funcionamento do eixo HPA estão associadas à gravidade de quadros depressivos e são indicativas de um prognóstico desfavorável. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar pacientes depressivos com presença ou ausência de estresse precoce, identificando as alterações no funcionamento do eixo HPA e a resposta terapêutica. Metodologia: A amostra foi composta por 30 sujeitos, sendo 20 pacientes depressivos em regime de semi-internação no Hospital Dia do Hospital das Clinicas da FMRP-USP e 10 controles saudáveis. Além disso, os sujeitos do estudo foram divididos em: um grupo de pacientes depressivos (n=20) e controles saudáveis (n=10); um subgrupo de pacientes respondedores (n=8) e não respondedores ao tratamento (n=8); um subgrupo de pacientes deprimidos com presença de Estresse Precoce (n=13), ausência de Estresse Precoce (n=7) e de controles saudáveis (n=10). Os pacientes foram avaliados por meio de Entrevista Clínica de acordo com os critérios diagnósticos do DSM-IV, para a confirmação do diagnóstico. Para avaliação da gravidade dos sintomas depressivos foi aplicada a Escala de Depressão de Hamilton (HAM-\'D IND. 21\'), sendo incluídos apenas pacientes com HAM-\'D IND. 21\', \'> OU =\'17. Utilizamos também a Escala de Avaliação de Depressão de Montgomery-Asberg (MADRS) para avaliação da resposta terapêutica, sendo considerados respondedores os pacientes que obtiveram uma redução da pontuação da MADRS \'> OU =\' 50% entre a admissão e 60 dias após. A presença de Estresse Precoce foi confirmada através da aplicação do Questionário Sobre Traumas na Infância (CTQ). Foram utilizados também, o Inventário de Depressão de Beck (BDI), o inventário de Ansiedade de Beck (BAI), a Escala de Ideação Suicida de Beck (BSI), a Escala de Desesperança de Beck (BHS), a Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão (HADS) e a Escala de Impulsividade de Barratt (BIS-11) para a avaliação dos sintomas psiquiátricos. A avaliação endócrina foi realizada através do cortisol salivar, sendo coletado às 22h, ao acordar, 30 e 60 minutos após acordar e às 8h30min na admissão e após 60 dias. Resultados: Nossos resultados demonstraram uma associação entre a gravidade dos quadros depressivos com o aumento das tentativas de suicídio, do uso abusivo de bebidas alcoólicas e da obesidade, bem como com o aumento dos sintomas de ansiedade, desesperança, impulsividade e da comorbidade com os Transtornos de Personalidade. Encontramos que além desses fatores, a resposta inadequada ao tratamento também pode ser influenciada pela história prévia de Estresse Precoce. Além disso, nossos achados indicaram que a maior gravidade dos pacientes depressivos da nossa amostra se correlacionaram com uma maior atividade do eixo HPA, e este aumento foi associado a níveis mais elevados de cortisol salivar tanto na admissão quanto 60 dias após o tratamento nos pacientes não respondedores. Evidenciamos também que este aumento da atividade do eixo HPA pode ser influenciado pelo Estresse Precoce, uma vez que os pacientes com presença EP apresentaram níveis maiores de cortisol salivar, mesmo após o tratamento. Conclusão: Com base nos resultados apresentados, nossos achados apontam para o papel etiológico do eixo HPA na depressão, estando este muitas vezes associado a situações deEP que acarretam em uma maior gravidade dos pacientes e piora da resposta terapêutica. Dessa forma, nossos dados sugarem que a avaliação do eixo HPA possa prever a recorrência da psicopatologia, servindo assim, como um potencial biomarcador na depressão destes pacientes. / Introduction: Depression is a common condition of chronic course, recurrent, and is often associated with functional disability and impaired physical health. Among the associated factors are situations of early life stress, as abuse and neglect. The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) axis plays a crucial role in response to external and internal stimuli, and may precipitate psychiatric episodes in predisposed individuals. Furthermore, studies have confirmed that changes in the functioning of the HPA axis are associated with the severity of depressive and are indicative of a poor prognosis. Objective: The aim of this study was to evaluate patients with depressive on presence or absence of early life stress, identifying changes in HPA axis functioning and treatment response. Methods: The sample of 30 subjects, 20 depressed patients in partial inpatient treatment in the Day Hospital of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirao Preto- University of Sao Paulo and 10 healthy controls. In addition, the study subjects were divided into a group of responders (n = 8) and nonresponders (n = 8), a group with presence Early Life Stress (n = 13) or absence of Early Life Stress (n = 7) and a group of healthy controls (n = 10). Patients were evaluated using Clinical Interview according to the diagnostic criteria of DSM-IV, to confirm the diagnosis. To evaluate the severity of depressive symptoms was applied to Hamilton Depression Scale (HAM-\'D IND. 21\') and included only patients with HAM-\'D IND.21\' \'> OR =\' 17. We also use the Rating Scale Montgomery-Asberg Depression (MADRS) to evaluate therapeutic response, patients were considered responders who achieved a reduction of MADRS score \'> OR =\' 50% between admission and 60 days after. The presence of Early Life Stress was confirmed by applying the Questionnaire about Childhood Trauma (CTQ). We also used the Beck Depression Inventory (BDI), the Beck Anxiety Inventory (BAI), the Scale for Suicidal Ideation Beck (BSI), the Beck Hopelessness Scale (BHS), the Hospital Anxiety Scale and Depression Scale (HADS) and the Scale Barratt Impulsiveness (BIS-11) for evaluation of psychiatric symptoms. The endocrine evaluation was performed using salivary cortisol, being collected at 22h, on awaking, 30 and 60 minutes after awaking up at 8:30 am and at baseline and after 60 days. Results: Our results demonstrated an association between the severity of depression with, attempt suicide, abuse of alcohol and obesity, as well as increased symptoms of anxiety, hopelessness, and impulsivity, personality disorders. We found that in addition to these factors, the poor response to treatment can also be influenced by the history of Early Life Stress. Moreover, our findings indicate that the greater severity of depressive patients were correlated with increased activity of the HPA axis, and this increase was associated with higher levels of salivary cortisol both at admission and 60 days after treatment in nonresponders. We evidenced also that the increased activity of the HPA axis can be influenced by Early Life Stress, since the patients with EP had higher levels of salivary cortisol, even after treatment. Conclusion: Therefore, based on the presented results, our findings suggest the etiological role of the HPA axis in depression, which itself is often associated with situations of EP that lead to greater severity of patients and worsening of therapeutic response. Thus, our data suggest that the assessment of the HPA axis can predict the recurrence of psychopathology, thereby serving as a potential biomarker for depression in these patients.

O mecanismo de controle da secreção de GnRH inclui diversas vias neuronais. Estudos em modelos animais identificaram genes que codificam fatores de transcrição, tais como TTF-1 (thyroid transcription factor 1) e EAP1 (enhanced at puberty), que atuam no controle transcricional de genes codificadores de fatores excitatórios (KiSS1 e GnRH) e inibitórios (preproencefalinas) regulando a secreção de GnRH. Em primatas, a expressão de EAP1 e TTF-1 aumenta, no início da puberdade, nas regiões hipotalâmicas envolvidas na secreção de GnRH. Nos modelos animais, a deleção pós-natal de TTF-1 e o silenciamento do EAP1 provocam atraso puberal e prejuízo na função reprodutiva. TTF-1 também está envolvido na morfogênese diencefálica, por meio da via de sinalização da família Sonic-Hedgehog. Anormalidades na secreção de GnRH resultam em distúrbios puberais, que variam de puberdade precoce central (PPC) a hipogonadismo hipogonadotrófico. Hipotetizamos que anormalidades genéticas no TTF-1 e EAP1 estejam envolvidas na patogênese dos distúrbios puberais centrais. A PPC pode ser idiopática ou devido a causas orgânicas, sendo o hamartoma hipotalâmico, uma malformação congênita não neoplásica, a mais conhecida. Os pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico podem cursar com alterações neurológicas e cognitivas. Nossos objetivos foram: estudar as regiões codificadora do TTF-1 e do EAP1 e a região promotora do TTF-1 em pacientes com distúrbios puberais centrais; estabelecer a prevalência, taxa de penetrância e modo de herança da forma familial de PPC e caracterizar as manifestações neurológicas e neurocognitivas de pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico. Foram selecionados 133 pacientes com distúrbios puberais centrais - PPC idiopática (n=71), PPC devido a hamartoma hipotalâmico (n=15) e hipogonadismo hipogonadotrópico isolado normósmico (HHIn) (n=47) - e controles (n=53). Os genes TTF-1 e EAP1 foram amplificados e submetidos a sequenciamento automático. Os tratos de poliglutamina e polialanina no EAP1 foram estudados por software de análise de tamanho de fragmento (GeneScan). A avaliação neurológica e neurocognitiva dos pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico consistiu de exame neurológico, eletroencefalograma, ressonância magnética de encéfalo e aplicação da escala de inteligência (WISC-III, WAIS-III, WPPSIR). Identificamos 25% de casos familiais de PPC, com modo de herança autossômica dominante e taxa de penetrância de 67,5%. Variantes alélicas no TTF-1 não foram identificadas nos pacientes estudados. No gene EAP1 foram identificadas quatro variantes alélicas sinônimas: p.E87E, p.A163A, p.Y415Y e uma nova variante alélica p.C758C, encontradas em pacientes com PPC e HHIn. A distribuição das frequências alélica e genotípica das variantes alélicas do EAP1 não diferiram entre pacientes com PPC, HHIn e controles (p >0,05). Nas regiões poliglutamina e polialanina 5 distal foi identificada variação similar no número de repetições glutamina e alanina em pacientes e controles. Não houve diferença significativa da frequência alélica em relação ao número de repetições glutamina e alanina entre os grupos PPC e HHIn (p >0,05). A avaliação neurológica dos pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico revelou epilepsia gelástica e crises focais com generalização em 3/15 (20%) pacientes. Não houve diferença significativa entre a mediana do maior diâmetro dos hamartomas dos pacientes com PPC com e sem epilepsia (13 e 10 mm, respectivamente). Quanto à forma, 10 hamartomas eram sésseis e 5 pedunculados, sendo que a forma pedunculada foi detectada exclusivamente em pacientes sem epilepsia. A avaliação neurocognitiva em 11 dos 15 pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico detectou 2 pacientes com epilepsia com QI significativamente menor que o grupo sem epilepsia (p <0,05). Em conclusão, (i) a considerável prevalência de casos familiais de PPC reforça a influência dos fatores genéticos na puberdade humana; (ii) mutações germinativas no TTF-1 e no EAP1 não estão envolvidas na patogênese dos distúrbios puberais centrais; (iii) a função neurocognitiva reduzida nos pacientes com hamartoma e epilepsia sugere um efeito deletério das crises convulsivas no sistema nervoso central / GnRH secretion control involves multiple neuronal pathways. Animal studies have identified genes which codifies transcription factors, such as TTF-1 (thyroid transcription factor 1) and EAP1 (enhanced at puberty), that act in the transcriptional control of genes that codifies excitatory (KiSS1 and GnRH) and inhibitory factors (preproenkephalines) regulating GnRH secretion. In nonhuman primates, expression of EAP1 and TTF-1 are increased at the hypothalamic regions involved in GnRH secretion, at the beginning of puberty. In animal models, post-natal TTF-1 deletion and silencing of EAP1 lead to pubertal delay and damage of reproductive function. TTF-1 is also involved in diencephalic morphogenesis, through signalization via Sonic-Hedgehog family. Abnormalities in GnRH secretion are responsible for pubertal disorders, varying from central precocious puberty (CPP) to hypogonadotropic hypogonadism. We hypothesized that genetic anomalies at TTF-1 and EAP1 are involved in the pathogenesis of central pubertal disorders. CPP may be idiopathic or due to organic alterations and hypothalamic hamartoma, a non-neoplasic congenital malformation, is the most frequent known organic cause. Patients with CPP due to hypothalamic hamartoma may have neurological and cognitive disfunctions. Our aims were: to evaluated the codifying region of TTF-1 and EAP1 and the promoter region of TTF-1 in patients with central pubertal disorders; to establish the prevalence, penetrance rate and inheritance mode of familial CPP and to characterize neurologic and neurocognitive aspects of patients with CPP due to hypothalamic hamartoma. We selected 133 patients with central pubertal disorders idiopathic CPP (n=71), CPP due to hypothalamic hamartoma (n=15) and normosmic isolated hypogonadropic hypogonadism (nIHH) (n=47) - and controls (n=53). TTF-1 and EAP1 genes were amplified and sequenced. Polyglutamine and polyalanine tracts of EAP1 were studied by a fragment size analyser software (GeneScan). Neurologic and neurocognitive evaluation of CPP patients due to hypothalamic hamartoma consisted of neurologic exam, electroencephalogram, brain magnetic resonance and application of intelligence scale (WISC-III, WAIS-III, WPPSI-R). We identified 25% of familial CPP cases with autosomal dominant mode of inheritance and penetrance rate of 67.5%. No TTF-1 allelic variants were identified in the patients analysed. At EAP1 gene, four synonimous allelic variants were identified: p.E87E, p.A163A, p.Y415Y and a new allelic variant p.C758C, found in CPP and nIHH patients. The allelic and genotypic distribution of theses variants of EAP1 did not differ among patients with CPP and nIHH, and controls (p >0.05). At polyglutamine and 5 distal polyalanine region, similar glutamine and alanine repeats variation was found. No significative difference of allelic frequency distribution regarding the number of glutamines and alanines repeats was found among the studied groups (p >0.05). Neurologic evaluation of CPP patients due to hypothalamic hamartoma revealed epilepsy and focal crisis with generalization in 3/15 (20%) of the patients. No significant difference between the median of the larger diameter of hypothalamic hamartoma of CPP patients with and without epilepsy was found (10 mm and 13 mm, respectively). Regarding the shape, 10 hamartomas were sessile and 5 pedunculated, and the pedunculated shape was found only in non epileptic patients. Neurocognitive evaluation performed in 11 of the 15 patients with CPP due to hypothalamic hamartoma detected 2 patients with epilepsy whose IQ were significantly lower than the IQ found in the group without epilepsy (p <0.05). In conclusion, (i) the considerable prevalence of familial CPP cases reinforce the influence of genetic factors in human puberty; (ii) germinative mutations in TTF-1 and EAP1 are not involved in the pathogenesis of central pubertal disorders; (iii) reduced neurocognitive function in patients with hypothalamic hamartoma and epilepsy suggests a deleterious effect of crisis at the central nervous system

Introdução: A Depressão é uma condição relativamente comum, de curso crónico, recorrente, estando frequentemente associada com incapacitação funcional e comprometimento da saúde física. Entre os fatores associados, encontram-se situações de abuso e negligência, entre outros. O eixo Hipotálamo-Pituitária-Adrenal (HPA) desempenha um papel fundamental na resposta aos estímulos externos e internos, podendo desencadear episódios psiquiátricos em indivíduos predispostos. Além disso, estudos têm corroborado que alterações no funcionamento do eixo HPA estão associadas à gravidade de quadros depressivos e são indicativas de um prognóstico desfavorável. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar pacientes depressivos com presença ou ausência de estresse precoce, identificando as alterações no funcionamento do eixo HPA e a resposta terapêutica. Metodologia: A amostra foi composta por 30 sujeitos, sendo 20 pacientes depressivos em regime de semi-internação no Hospital Dia do Hospital das Clinicas da FMRP-USP e 10 controles saudáveis. Além disso, os sujeitos do estudo foram divididos em: um grupo de pacientes depressivos (n=20) e controles saudáveis (n=10); um subgrupo de pacientes respondedores (n=8) e não respondedores ao tratamento (n=8); um subgrupo de pacientes deprimidos com presença de Estresse Precoce (n=13), ausência de Estresse Precoce (n=7) e de controles saudáveis (n=10). Os pacientes foram avaliados por meio de Entrevista Clínica de acordo com os critérios diagnósticos do DSM-IV, para a confirmação do diagnóstico. Para avaliação da gravidade dos sintomas depressivos foi aplicada a Escala de Depressão de Hamilton (HAM-\'D IND. 21\'), sendo incluídos apenas pacientes com HAM-\'D IND. 21\', \'> OU =\'17. Utilizamos também a Escala de Avaliação de Depressão de Montgomery-Asberg (MADRS) para avaliação da resposta terapêutica, sendo considerados respondedores os pacientes que obtiveram uma redução da pontuação da MADRS \'> OU =\' 50% entre a admissão e 60 dias após. A presença de Estresse Precoce foi confirmada através da aplicação do Questionário Sobre Traumas na Infância (CTQ). Foram utilizados também, o Inventário de Depressão de Beck (BDI), o inventário de Ansiedade de Beck (BAI), a Escala de Ideação Suicida de Beck (BSI), a Escala de Desesperança de Beck (BHS), a Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão (HADS) e a Escala de Impulsividade de Barratt (BIS-11) para a avaliação dos sintomas psiquiátricos. A avaliação endócrina foi realizada através do cortisol salivar, sendo coletado às 22h, ao acordar, 30 e 60 minutos após acordar e às 8h30min na admissão e após 60 dias. Resultados: Nossos resultados demonstraram uma associação entre a gravidade dos quadros depressivos com o aumento das tentativas de suicídio, do uso abusivo de bebidas alcoólicas e da obesidade, bem como com o aumento dos sintomas de ansiedade, desesperança, impulsividade e da comorbidade com os Transtornos de Personalidade. Encontramos que além desses fatores, a resposta inadequada ao tratamento também pode ser influenciada pela história prévia de Estresse Precoce. Além disso, nossos achados indicaram que a maior gravidade dos pacientes depressivos da nossa amostra se correlacionaram com uma maior atividade do eixo HPA, e este aumento foi associado a níveis mais elevados de cortisol salivar tanto na admissão quanto 60 dias após o tratamento nos pacientes não respondedores. Evidenciamos também que este aumento da atividade do eixo HPA pode ser influenciado pelo Estresse Precoce, uma vez que os pacientes com presença EP apresentaram níveis maiores de cortisol salivar, mesmo após o tratamento. Conclusão: Com base nos resultados apresentados, nossos achados apontam para o papel etiológico do eixo HPA na depressão, estando este muitas vezes associado a situações deEP que acarretam em uma maior gravidade dos pacientes e piora da resposta terapêutica. Dessa forma, nossos dados sugarem que a avaliação do eixo HPA possa prever a recorrência da psicopatologia, servindo assim, como um potencial biomarcador na depressão destes pacientes. / Introduction: Depression is a common condition of chronic course, recurrent, and is often associated with functional disability and impaired physical health. Among the associated factors are situations of early life stress, as abuse and neglect. The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) axis plays a crucial role in response to external and internal stimuli, and may precipitate psychiatric episodes in predisposed individuals. Furthermore, studies have confirmed that changes in the functioning of the HPA axis are associated with the severity of depressive and are indicative of a poor prognosis. Objective: The aim of this study was to evaluate patients with depressive on presence or absence of early life stress, identifying changes in HPA axis functioning and treatment response. Methods: The sample of 30 subjects, 20 depressed patients in partial inpatient treatment in the Day Hospital of the University Hospital of the School of Medicine of Ribeirao Preto- University of Sao Paulo and 10 healthy controls. In addition, the study subjects were divided into a group of responders (n = 8) and nonresponders (n = 8), a group with presence Early Life Stress (n = 13) or absence of Early Life Stress (n = 7) and a group of healthy controls (n = 10). Patients were evaluated using Clinical Interview according to the diagnostic criteria of DSM-IV, to confirm the diagnosis. To evaluate the severity of depressive symptoms was applied to Hamilton Depression Scale (HAM-\'D IND. 21\') and included only patients with HAM-\'D IND.21\' \'> OR =\' 17. We also use the Rating Scale Montgomery-Asberg Depression (MADRS) to evaluate therapeutic response, patients were considered responders who achieved a reduction of MADRS score \'> OR =\' 50% between admission and 60 days after. The presence of Early Life Stress was confirmed by applying the Questionnaire about Childhood Trauma (CTQ). We also used the Beck Depression Inventory (BDI), the Beck Anxiety Inventory (BAI), the Scale for Suicidal Ideation Beck (BSI), the Beck Hopelessness Scale (BHS), the Hospital Anxiety Scale and Depression Scale (HADS) and the Scale Barratt Impulsiveness (BIS-11) for evaluation of psychiatric symptoms. The endocrine evaluation was performed using salivary cortisol, being collected at 22h, on awaking, 30 and 60 minutes after awaking up at 8:30 am and at baseline and after 60 days. Results: Our results demonstrated an association between the severity of depression with, attempt suicide, abuse of alcohol and obesity, as well as increased symptoms of anxiety, hopelessness, and impulsivity, personality disorders. We found that in addition to these factors, the poor response to treatment can also be influenced by the history of Early Life Stress. Moreover, our findings indicate that the greater severity of depressive patients were correlated with increased activity of the HPA axis, and this increase was associated with higher levels of salivary cortisol both at admission and 60 days after treatment in nonresponders. We evidenced also that the increased activity of the HPA axis can be influenced by Early Life Stress, since the patients with EP had higher levels of salivary cortisol, even after treatment. Conclusion: Therefore, based on the presented results, our findings suggest the etiological role of the HPA axis in depression, which itself is often associated with situations of EP that lead to greater severity of patients and worsening of therapeutic response. Thus, our data suggest that the assessment of the HPA axis can predict the recurrence of psychopathology, thereby serving as a potential biomarker for depression in these patients.

Introdução: Crescentes evidências indicam que o abandono e o abuso infantis são fatores de risco para transtornos psiquiátricos. Estudos realizados tanto em animais como em humanos sugerem que o estresse nas fases iniciais de desenvolvimento pode induzir alterações persistentes na capacidade do eixo HPA em responder ao estresse na vida adulta e que esse mecanismo pode levar a uma maior suscetibilidade à depressão. Esta desregulação do eixo HPA parece estar relacionada às mudanças na capacidade dos glicocorticóides circulantes em exercer seu feedback negativo na secreção dos hormônios do eixo HPA por meio da ligação aos receptores de mineralocorticóides (MR) e glicocorticóides (GR) nos tecidos do eixo HPA. Objetivo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta do eixo HPA frente aos agonistas e antagonistas dos GR e MR em pacientes depressivos com e sem estresse precoce (EP) e controles. Metodologia: Selecionamos uma amostra total de 75 sujeitos composta por um grupo de pacientes com diagnóstico de episódio depressivo atual (n=47) e um grupo de controles saudáveis (n=28). Os pacientes foram divididos em 2 grupos de acordo com o estresse precoce: um grupo de pacientes depressivos com EP (n=33) e um grupo de pacientes depressivos sem estresse precoce (n=14). Os pacientes foram avaliados por meio da Mini Entrevista Neuropsiquiátrica Internacional (MINI-Plus), para a confirmação do diagnóstico. Para avaliação da gravidade dos sintomas depressivos foi aplicada a Escala de Depressão GRID de Hamilton (GRID-HAM-D21), sendo incluídos apenas pacientes com HAM-D21>=16. Para a avaliação do estresse precoce foi aplicado o Questionário Sobre Traumas na Infância (CTQ). Utilizamos também a Escala de Avaliação de Depressão de Montgomery-Asberg (MADRS), o Inventário de Depressão de Beck (BDI-II), o Inventário de Ansiedade de Beck (BAI), a Escala de Desesperança de Beck (BHS), a Escala de Ideação Suicida de Beck (BSI), a Escala de Impulsividade de Barratt (BIS-11) e o Questionário de Qualidade de Sono de Pittsburg (PSQI), para a avaliação dos sintomas psiquiátricos. A avaliação endócrina foi controlada por placebo, cego por parte dos controles e pacientes, não randomizada, onde os efeitos da fludrocortisona (0.5 mg), da prednisolona (5 mg), da dexametasona (0.5 mg) e da espironolactona (400mg) foram avaliados através do hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) plasmático, do cortisol plasmático e salivar, da prolactina plasmática e do sulfato de desidroepiandrosterona (DHEA-S) plasmático. A secreção de cortisol salivar e dos hormônios plasmáticos foi avaliada em todos os sujeitos, após terem tomado no dia anterior às 22h: uma cápsula de placebo, fludrocortisona, prednisolona, dexametasona e espironolactona. A secreção de cortisol salivar foi avaliada às 22h após a tomada da medicação ou do placebo, ao acordar, 30 e 60 min após acordar e às 9h (antes da coleta plasmática), para avaliação da resposta do cortisol ao acordar (CAR) e do ritmo circadiano do cortisol (RC). Foi realizado também uma coleta plasmática as 9h nos dias seguintes após os desafios para medir o cortisol plasmático, o ACTH, o DHEA-S e a prolactina. Resultados: Os pacientes depressivos apresentaram níveis basais menores de cortisol salivar, de prolactina e de DHEA-S e níveis maiores na relação cortisol/DHEA-S. Não foram encontradas diferenças entre os pacientes depressivos e os controles nos níveis basais de ACTH, de cortisol plasmático, na CAR e no RC. Os pacientes depressivos apresentaram níveis menores de ACTH e de DHEA-S após a dexametasona e a fludrocortisona e tenderam a apresentar níveis menores de cortisol salivar após a fludrocortisona. Após a espironolactona encontramos níveis menores de ACTH, de cortisol salivar e de DHEA-S e níveis maiores no índice cortisol/DHEA-S nos pacientes depressivos. Os pacientes depressivos apresentaram também níveis menores de DHEA-S após a prednisolona, porém não foram encontradas diferenças entre os grupos nos demais hormônios avaliados após a prednisolona. Não foram encontradas diferenças no cortisol plasmático e na prolactina após os desafios entre os pacientes depressivos e os controles. Com relação à avaliação do estresse precoce nas medidas hormonais, encontramos uma tendência dos pacientes com EP apresentarem níveis menores basais de prolactina e após a fludrocortisona, a prednisolona, a dexametasona e a espironolactona do que os pacientes sem EP. No entanto, não foram encontradas diferenças entre os grupos nas demais medidas hormonais basais e após os desafios avaliadas neste estudo. Conclusão: Nossos achados fornecem evidências de que existem diversas alterações nas medidas hormonais relacionadas ao funcionamento do eixo HPA e de seus receptores GR e MR nos pacientes depressivos, associado à hipocortisolemia e um aumento do feedback inibitório mediado pelos GR e MR. Sugerem também o envolvimento da prolactina no desenvolvimento de quadros depressivos com estresse precoce, porém mais estudos são necessários para elucidarmos melhor a importância dos demais hormônios do eixo HPA e dos seus receptores em quadros depressivos com estresse precoce / Introduction: There are evidences indicating that child neglect and abuse are risk factors for psychiatric disorders. Studies that had as subjects animals or human suggest that stress in early phases of development may induce persistent changes in HPA axis response to stress in adulthood, which can lead to a greater susceptibility of developing depression. These abnormalities appear to be related to changes in the ability of circulating glucocorticoids and negative feedback on the secretion of HPA hormones through binding to glucocorticoid (GR) and mineralocorticoid receptors (MR) in HPA tissue. Aim: The aim of the present study was to assess HPA response after ingestion of GR and MR agonists and antagonists by depressive patients with and without early life stress (ELS) and controls. Methods: The sample was composed by a group of patients in current depressive episode (n=47), and a healthy control group (n=28). The depressed patients were divided in 2 groups, according to the presence or absence of ELS - a group with ELS (n=33) and a group without ELS (n=14). For diagnostic assessment, MINI International Neuropsychiatric Interview (MINI-Plus) was used. To assess the intensity of depressive symptoms, GRID-Hamilton Depression Rating Scale (GRIDHAM-D21) was applied, and for being included in the patient\'s group, subjects had to score >=16 in GRID-HAM-D21. To assess ELS, Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) was applied. Other instruments were also used in the present study to assess psychiatric symptoms: Montgomery-Åsberg Depression Rating Scale (MADRS), Beck Depression Inventory II (BDI-II), Beck Anxiety Inventory, Beck Hopelessness Scale (BHS), Beck Scale for Suicide (BSI), Barratt Impulsiveness Scale (BIS-11), and Pittsburg Sleep Quality Index (PSQI). The neuroendocrine assessment was controlled using placebo, blind to subjects, and non-randomized. The effects of fludrocortisone (0.5 mg), prednisolone (5 mg), dexamethasone (0.5 mg), and spironolactone (400mg) were assessed by measuring plasmatic adrenocorticotropic hormone (ACTH), plasmatic and salivary cortisol, plasmatic prolactin, and plasmatic dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S). The secretion of all plasmatic hormones was assessed in all subjects in blood collection sample at 9AM, after they took a pill containg placebo or fludrocortisone or prednisolone or dexamethasone or spironolactone, the day before, at 10 PM. The secretion of salivary cortisol assessed the day before 10 PM (after the ingestion of the pill), upon awakening, 30 minutes and 60 minutes after awakening, and at 9AM (before plasmatic collection), for assessed the cortisol awakening response (CAR) and the cortisol circadian rhythm (CR). At 9 AM there was a blood sample collection to assess plasmatic cortisol, ACTH, DHEA-S and prolactin. Results: Depressive patients presented lower basal levels of salivar cortisol, plasmatic prolactin and DHEA-S, and higher levels in the ratio cortisol/DHEA-S. There were no differences between depressive patients and healthy controls in basal levels of ACTH, plasmatic cortisol, in CAR, and in CR. Depressive patients had lower levels of ACTH and DHEA-S after dexamethasone and fludrocortisone, and there was a tendency of having lower salivary cortisol levels after fludrocortisone. After spironolactone, lower levels of ACTH, salivary cortisol, DHEA-S were found, and higher levels in ratio cortisol/DHEA-S were found in depressive patients. These patients also presented lower levels of DHEA-S after prednisolone, although there were no differences between groups concerning the levels of other hormones assessed after prednisolone. There were no differences found in plasmatic cortisol and prolactin levels after all challenges between depressive patients and controls. Considering ELS and hormonal level assessment, there was a tendency of patients with ELS of presenting lower levels of prolactin after placebo, fludrocortisone, prednisolone, dexamethasone, and spironolactone than patients without ELS. Nevertheless, there were no differences between these groups concerning the other hormonal basal levels and after the pharmachological challenges. Conclusion: Our findings provide evidence that there are several changes in hormonal levels related to the functioning of the HPA axis and its receptors GR and MR in depressive patients associated to hypocortisolism and the increase of negative feedback MR- and GR- mediated. Our data also suggest the role of prolactin in the development of depressive disorder with ELS, however, more studies are needed to better highlight the importance of other hormones of HPA axis and its receptors in depressive disorders with ELS

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ final - ENTREGA.pdf: 2247856 bytes, checksum: 146d4be3628d74a867ddf4826f6f6e8a (MD5) Previous issue date: 2015-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Purpose: Herein we evaluated the expression of genes and protein involved with hepatic lipids pathway and investigate whether the improvement on glucose homeostasis is associated with modifications in the islets morphology in HyO rats submitted to duodenal-jejunal bypass (DJB). Methods: During the first 5 days of life, male newborn Wistar rats received a subcutaneous injection of monosodium glutamate [4 g/kg body weight (BW), hypothalamic obesity (HyO) group], or saline (CTL group). At 90 days of age, HyO rats were submitted to DJB or sham operations forming HyO DJB and HyO Sham group, respectively. Two months after DJB, serum parameters, expression of genes and protein in the liver and islets morphology were verified. Results: Although DJB operation normalized serum triglycerides (TG) and non-esterified fatty acids (NEFA) concentration compared to HyO Sham rats, HyO DJB rats did not alter TG liver content as well as, the expression of hepatic genes and protein involved with lipids metabolism. DJB operation normalized insulinemia and insulin resistance and restored &#946;-cell secretion in the presence of 8.3 mM glucose independently of weight loss. In addition, HyO DJB rats presented a reduction in total islets and &#946;-cell area (pancreas area percentage) and in islets cells proliferation (verified by the number of nucleus stained by Ki67 protein - a cellular marker for proliferation). Conclusions: Although DJB not affect liver lipids metabolism in HyO rats two months after surgery, the improvement on glucose homeostasis could be associated with modifications in islets morphology and proliferation. / Objetivo: Avaliar a expressão de genes e proteínas envolvidos com a via lipídica hepática e investigar se a melhoria na homeostase glicêmica está associada a alterações na morfologia das ilhotas em ratos MSG submetidos à derivação duodeno-jejunal (DDJ). Métodos: Durante os primeiros 5 dias de vida, ratos Wistar recém-nascidos receberam injeções subcutâneas de glutamato monossódico [4 g / kg de peso corporal (BW), grupo MSG], ou solução salina (grupo CTL). Aos 90 dias de idade, os animais MSG foram submetidos à DDJ ou a falsa operação, formando os grupos MSG-DDJ e MSG-FO, respectivamente. Dois após a cirurgia, foram avaliados os parâmetros séricos, a expressão de genes e proteínas do fígado e morfologia das ilhotas pancreáticas. Resultados: A cirurgia de DDJ normalizou as concentrações de triglicerídeos séricos (TG) e dos ácidos graxos não-esterificados em comparação aos animais MSG-FO, porém não alterou o conteúdo de TG no fígado, bem como, a expressão de genes e proteínas hepáticas envolvidas com o metabolismo lipídico. Além disso, a DDJ normalizou a insulinemia e a resistência à insulina, e restaurou a secreção de insulina pelas células-&#946; na presença de 8,3 mM de glicose, independentemente da perda de peso. Ainda, ratos MSG-DDJ apresentaram redução nas áreas totais da ilhota e de células &#946; (% área pâncreas) e na proliferação de células da ilhota (verificado pelo número de núcleos corados por Ki67). Conclusões: A cirurgia de DDJ não alterou o metabolismo lipídico no fígado, dois meses após a realização da cirurgia, sendo assim, a melhora na homeostase glicêmica nos animais pode estar associada a alterações na morfologia e proliferação das ilhotas pancreáticas

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GABRIELA_ MOREIRA SOARES.pdf: 1940590 bytes, checksum: 743251bbcf008feeceea6700678f7e3f (MD5) Previous issue date: 2016-01-30 / Fundação Araucária / Hypothalamic obesity (HyO) is a severe condition without any effective therapy. Bariatric operations appear as an alternative treatment, but the effects of this procedure are controversial. Here, we investigated the effects of duodenal-jejunal bypass (DJB) upon lipid profile and expression of main genes, protein and transcription factors involved in hepatic lipid metabolism pathways in HyO rats. During the first 5 days of life, male newborn Wistar rats received a subcutaneous injection of monosodium glutamate (MSG) [4 g/kg body weight (BW), HyO group]. Control (CTL) group received saline [1.25 g/kg BW]. At 90 days of age, HyO rats were randomly submitted to DJB or sham operations forming HyO DJB and HyO Sham group, respectively. Six months after DJB, obesity parameters, lipids levels, and expression of genes and protein in the liver were verified. HyO Sham rats displayed obesity, hyperinsulinemia, insulin resistance, hypertryglyceridemic and presented higher free fatty acids (FFA) levels and hepatic triglyceride (TG) content. Also, HyO Sham animals enhanced acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FASN) and stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD-1) mRNA levels and ACC and FASN protein in the liver. Carnitine palmitoyltransferase-1a (CPT-1a) and microsomal TG transfer protein (MTTP) were down-regulated in HyO Sham rats. DJB operation normalized serum insulin, TG and FFA levels and hepatic TG content, without changing obesity in these animals. In addition, DJB reduced mRNA levels of liver pyruvate kinase (LPK), ACC, SCD-1, acyl-CoA oxidase (ACO) and carbohydrate response elemento-binding protein (ChREBP). ACC and FASN protein expression were normalized in HyO DJB animals. DJB reduces de-novo lipogenesis and improves hepatic TG content in HyO DJB rats, indicating that this surgery is efficient in the resolution of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in HyO. / A obesidade hipotalâmica (OH) é uma condição severa que não apresenta nenhuma terapia eficaz. Cirurgias bariátricas têm surgido como uma alternativa de tratamento, porém, os efeitos deste procedimento são controversos. No presente trabalho, investigamos os efeitos da derivação duodeno-jejunal (DDJ) sobre o perfil lipídico e sobre a expressão gênica de proteínas e fatores de transcrição envolvidos em vias do metabolismo lipídico hepático em ratos com OH. Durante os cinco primeiros dias de vida, ratos Wistar neonatos receberam uma injeção subcutânea de glutamato monossódico (MSG) [4 g/kg de peso corporal, grupo OH]. O grupo controle (CTL) recebeu solução salina [1,25 g/kg de peso corporal]. Aos 90 dias de idade, os ratos OH foram aleatoriamente submetidos à pseudo-cirurgia (PC) ou à DDJ, formando os grupos OH PC e OH DDJ, respectivamente. Seis meses após a DDJ, foram verificados, os parâmetros de obesidade, concentração de lipídios e expressão gênica e proteica no fígado. Ratos OH PC apresentaram obesidade, hiperinsulinemia, resistência à insulina, hipertrigliceridemia, concentrações elevadas de ácidos graxos livres (AGL) e do conteúdo de triglicerídeo (TG) hepático. Também, os animais OH PC tiveram aumento na quantidade de mRNA da acetil-CoA carboxilase (ACC), ácido graxo sintetase (FASN) e estearoil-CoA desaturase-1 (SCD-1) e da expressão proteica da ACC e FASN no fígado. A expressão gênica da carnitina palmitoil-transferase-1a (CPT-1a) e da proteína de transferência de triglicerídeos microssomal (MTTP) foram menores no fígado do grupo OH PC. A cirurgia de DDJ normalizou a concentração de insulina, AGL e TG séricos e o conteúdo de TG hepático, sem alterar a obesidade nesses animais. Além disso, a DDJ reduziu a expressão do mRNA da piruvato quinase hepática (LPK), ACC, SCD-1, acil-CoA oxidase (ACO) e da proteína de ligação do elemento responsivo à carboidratos (ChREBP). A expressão proteica de ACC e FASN foi normalizada em animais OH DDJ. A DDJ reduz a lipogênese de novo e melhora o conteúdo de TG hepático em ratos OH DDJ, indicando que esta cirurgia é eficiente na resolução da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) na OH.

Resource availability follows seasonal cycles in environmental conditions. To align physiology and behavior with prevailing environmental conditions, seasonal animals integrate cues from the environment with their internal state. One of the systems animals use to integrate those cues is the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis and its primary effector, glucocorticoid hormones. The HPA axis has wide-ranging effects on physiology and behavior and, in the context of a glucocorticoid stress response, is known to mediate tradeoffs between immediate survival and future fitness. The HPA axis also plays an important role in facilitating predictable life-history events. Variation in HPA axis activity has been reported in all vertebrates, often coordinating seasonal reproduction and possibly also transitions between life-history stages. My dissertation research used red-sided garter snakes (Thamnophis sirtalis parietalis) to examine the role of the HPA axis in regulating seasonal life-history transitions, especially in females. In Chapter 2, I hypothesized that seasonal plasticity in stress responses is regulated, in part, by changes in the responsiveness of the adrenal glands to adrenocorticotropic hormone (ACTH). I found that glucocorticoid responses to ACTH challenge were smaller in males than in females during the spring, suggesting that reports of reduced stress responsiveness in males may reflect lower adrenal responsiveness to ACTH. The sex difference in mating season duration and consequently also in the timing of migration led me to hypothesize that sex differences in HPA axis activity could explain sex differences in the timing of migration. Furthermore, adrenal responsiveness to ACTH also varied seasonally in males, but not females, suggesting that female stress responses, which have not been studied, may not vary seasonally. In Chapter 3, I investigated potential seasonal variation in female stress responses, which have not previously been examined. In males, baseline glucocorticoids decrease over the course of the mating season resulting in significantly lower baseline levels in males that have begun to migrate. I hypothesized that a change in HPA axis activity occurs during spring and fall migration. Peak stress-induced glucocorticoid concentration occurred at an earlier sampling time in females during the spring compared to the fall. Peak stress-induced glucocorticoid concentrations also occurred at a later sampling time in migrating females than in pre-migratory females during the spring, suggesting that negative feedback regulation of the HPA axis changes as soon as females begin to migrate during the spring. Female red-sided garter snakes are biennial breeders that give birth approximately every other year implying that a female's recent reproductive history can influence whether or not she will reproduce in a given year. Body condition can be used as a proxy for recent reproductive history and can be related to baseline and stress-induced glucocorticoid concentrations. In Chapter 4, I hypothesized that hormonal and behavioral stress responses vary with body condition. Baseline glucocorticoids did not vary with body condition, but females in low body condition showed a significantly larger increase in plasma glucocorticoids in response to capture stress. Body condition, but not capture stress, influenced latency to copulate, suggesting that females are resistant to the behavioral effects of capture stress during the spring mating season. Only females in low body condition increased latency to copulate in response to injection of a physiological (15 µg) dose of exogenous CORT, while all females responded to a pharmacological (60 µg) dose, indicating that behavioral responses to exogenous glucocorticoids vary with female body condition. These data suggest that variation in body condition may be associated with differences in HPA axis sensitivity and/or glucocorticoid receptor (GR) density in the brain. I directly tested if there is a relationship among body condition, reproductive history and HPA axis activity in Chapter 5. I found that glucocorticoid stress responses and mating behavior did not vary with body condition, nor was body condition related to brain GR or reproductive condition (parturient vs post-parturient females). Only unreceptive females showed a significant stress-induced increase in glucocorticoids, suggesting that reduced stress responsiveness is associated with receptivity. Parturient females mated faster (were more proceptive) than post-parturient females. These data suggest that HPA axis activity influences reproductive "decisions" by modulating receptivity, while proceptivity is related primarily to recent reproductive history. Together, these chapters help characterize how HPA axis activity varies with season, sex, reproductive history and migration status. By systematically probing the HPA axis in a single, tractable system, I have gained insight into how changes in the HPA axis support and modulate transitions between life-history stages. These results highlight the HPA axis' important function in mediating the critical trade-offs all animals must navigate to be successful in a changing world.

[Truncated abstract] G-protein coupled receptors (GPCRs) form one of the largest superfamilies of cell-surface receptors and respond to a vast range of stimuli including light, hormones and neurotransmitters. Although structurally similar, GPCRs are regulated by many diverse proteins, which allow the specific functions of each receptor to be carried out. This thesis focussed on two well-documented GPCRs, the thyrotropin releasing hormone receptor (TRHR) and gonadotrophin-releasing hormone receptor (GnRHR), which control the thyroid and reproductive endocrine pathways respectively. Although each of these anterior pituitary receptors is responsible for distinct physiological responses, both are integral to normal development and homeostasis. This thesis focused on three areas of GPCR regulation: ?-arrestin recruitment, transcription factor regulation and receptor up-regulation. The role of the cytoplasmic protein, ?-arrestin, has perhaps been previously underestimated in GPCR regulation, but it is now increasingly apparent that ?-arrestins not only inhibit further G-protein activation and assist in GPCR internalisation but also act as complex scaffolding platforms to mediate and amplify downstream signalling networks for hours after initial GPCR activation. It is therefore becoming increasingly important to be able to monitor such complexes in live cells over longer time-frames. ... Members of the E2F transcription family have been previously identified by this laboratory as potential GnRHR interacting proteins, via a yeast-2-hybrid screen and BRET. This thesis further investigated the role of E2F family members and demonstrates that a range of GPCRs are able to activate E2F transcriptional activity when stimulated by agonist. However, despite GnRHR displaying robust E2F transcriptional activation upon agonist stimulation, this did not result in any conclusive evidence for functional regulation, although it is possible E2F may modulate and assist in GnRHR trafficking. Furthermore it is apparent that E2F family members are highly redundant, as small effects in GnRHR binding and cell growth were only observed when protein levels of both E2F4 and E2F5 were altered. During the course of the investigation into the effect of E2F transcription on GPCR function, it was evident that long-term agonist stimulation of GnRHR had a profound effect on its expression. As this was explored further, it became clear that this agonist-induced up-regulation was both dose- and time-dependent. Furthermore, altering levels of intracellular calcium and receptor recycling/synthesis could modulate GnRHR up-regulation. In addition, an extremely sensitive CCD camera has been used for the first time to visualise the luciferase activity attributed to GnRHR up-regulation. Overall, this thesis demonstrates the complex nature of GPCR regulation. For the first time, long-term BRET analysis on ?-arrestin interactions with both classes of GPCRs has been examined in a variety of cellular formats. This has given valuable insights into the roles of phosphorylation and internalisation on ?-arrestin interaction. Additionally, this thesis has revealed that prolonged agonist exposure increases receptor expression levels, which has major implications for drug therapy regimes in the treatment of endocrine-related disorders and tumours.