O gás composto monóxido de carbono (CO), está envolvido na modulação de diferentes funções orgânicas, tais como a regulação cardiovascular, a temperatura corporal e a nocicepção. A participação do CO nos processos fisiológicos ocorre por meio da atividade da enzima heme-oxigenase (HO), e seu produto CO, o qual por sua vez aumenta a produção de guanosina monofosfato ciclíco intracelular (GMPc). De particular interesse, o locus coeruleus possui elevada expressão da enzima HO-2 sugerindo o envolvimento do gasotransmissor CO na modulação das funções executadas por esta estrutura encefálica. O objetivo deste trabalho foi avaliar o envolvimento da via HO-CO do LC na modulação da ansiedade, avaliada pelo teste de labirinto em cruz elevado e teste claro-escuro; nocicepção aguda, avaliada pelo teste de retirada de cauda e a nocicepção inflamatória, avaliada pelo teste de formalina em ratos. Para atingir estes objetivos, ratos (± 250grs; Wistar) foram anestesiados (ketamina 75 mg/kg e xilasina 10 mg/kg i.m.) e submetidos à cirurgia estereotáxica para implante unilateral de cânulas-guias direcionadas para o LC, e para o ventrículo lateral. Após o período de recuperação, os ratos foram divididos em distintos grupos experimentais para administração intra-LC do ZnDPBG (inibidor inespecífico da enzima HO, nas doses 5,50 ou 200 nmol/0,1 µl) ou seu veículo, Na2CO3 (50 mmol/0,1 µl); do Heme-lisinato (150, 300 ou 600 nmol/0,1 µl) ou seu veículo, L-lisina (14,2 µmol/0,1 µl); do ODQ i.c.v. (inibidor específico da enzima guanilase ciclase solúvel, 1,3 nmol/1,0 µl) ou seu veículo (DMSO 1%, 1,0 µl) e após 15 min o Heme-lisinato (600 nmol/0,1 µl) ou seu veículo (L-lisina, 14,2 µmol/0,1 µl), intra-LC. Após o tempo de 15 min, os ratos foram avaliados no teste de LCE ou no TCE por 5 minutos, no teste de retirada de cauda por 120 minutos e no teste de formalina intra-podal por 45 minutos. Os resultados obtidos mostram que o aumento da produção do neuromodulador gasoso CO no LC, pela ativação da via HO-CO-GMPc com Heme-lisinato, promove efeito ansiolítico avaliado no teste do LCE e no TCE, evidenciado pelo aumento do tempo de permanência e pelo aumento do número de entradas nos braços abertos do LCE, e pelo aumento tempo de permanência no compartimento claro do TCE. Este efeito ansiolítico é dependente da atividade de GMPc intracelular, desde que o tratamento i.c.v. com inibidor específico da enzima GCs bloqueou os efeitos do Heme-lisinato no LCE e no TCE. Ainda, a ativação da via HO-CO-GMPc por meio da administração intra-LC do Heme-lisinato promoveu efeito antinociceptivo frente estímulo térmico agudo (teste de retirada de cauda em ratos), sendo este efeito dependente da atividade do GMPc, desde que o pré-tratamento com o inibidor da enzima guanilase ciclase solúvel, ODQ, bloqueou o aumento do IARC. O bloqueio da via HO-CO promove efeito hipernociceptivo em modelo de dor inflamatória, desde que o tratamento intra-LC com inibidor inespecífico da HO, ZnDPBG aumenta o número de sacudidas no teste de formalina intra-podal. Assim, este estudo é pioneiro em demonstrar que o neuromodulador CO do LC modula a ansiedade e a nocicepção aguda térmica e inflamatória. / The gas composed carbon monoxide (CO) is involved in the modulation of various physiological functions such as cardiovascular regulation, nociception and body temperature. CO participation in physiological processes occurs through the activity of the enzyme heme oxygenase (HO), and its product CO, which in turn increases the production of intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP). In particular interest, the locus coeruleus (LC) has a high HO-2 enzyme expression suggesting the involvement of CO in the modulation of the functions performed by this brain structure. The aim of this study was to evaluate the involvement of HO-CO pathway of LC in modulating anxiety, assessed by elevated plus maze test and light-dark box test. Additionally, acute nociception, as assessed by the tail flick test and inflammatory nociception, as assessed by formalin test in rats were analyzed after HO-CO pathway activation. Rats (±250 grs; Wistar) were anesthetized (ketamine 75 mg/kg and xylazine 10 mg/kg im) and underwent stereotactic surgery for cannulas guides unilateral implantation directed to the LC, and to the lateral ventricle. After the recovery period, rats were divided into distinct experimental groups for intra-LC ZnDPBG (nonspecific enzyme inhibitor HO doses 5, 50 or 200 nmol/0.l µl) or its vehicle, Na2CO3 (50 mmol/0.l µl); Heme-lysinate (150, 300 or 600 nmol/0.l µl) or its vehicle, L-lysine (14.2 nmol/0.1 µl), the ODQ i.c.v. (specific inhibitor of the enzyme guanilase soluble cyclase, 1.3 nmol/1.0 µl) or its vehicle (1% DMSO, 1.0 µl) and after 15 min the Heme-lysinate (600 nmol/0.1 µl), or its vehicle (L-lysine, 14.2 mmol/0.1 µl), intra-LC. After time 15 min, rats were evaluated in the EPM test or LDB for 5 minutes and in the tail flick test for 120 minutes and in the formalin test for 45 minutes. The results show that CO increased production in LC, by HO-CO-cGMP pathway activation, promotes anxiolytic effect evaluated in the EPM test and LDB. The anxiolytic effect is dependent on the activity of intracellular cGMP, since treatment i.c.v. with enzyme sGC inhibitor blocked the effects of Heme-lysinate. Moreover, the activation of the HO-CO-cGMP pathway into the LC promoted antinociceptive effect in the tail flick test, this effect being dependent on the activity of cGMP, since pre-treatment with the guanilase cyclase soluble inhibitor, ODQ, blocked the increase in analgesic index. Furthermore, the block of the HO-CO pathway intra-LC promoted hypernociception in a model of inflammatory pain, since treatment with nonspecific inhibitor HO, ZnDPBG, increases the nociceptive behavior in the formalin test. Thus, this study is the first to demonstrate that the CO neuromodulator into LC modulates anxiety and acute thermal and inflammatory nociception.

A Lesão Renal Aguda (LRA) tóxica se caracteriza por insulto tubular direto liberando espécies reativas de oxigênio (EROs) e estimulando processos pró-inflamatórios. Neste estudo foram investigadas a toxicidade do Sulfato de Polimixina B (PmxB), antibiótico catiônico usado para o tratamento de infecções por germes gram-negativos e a participação da enzima Heme Oxigenase-1 (HO-1), que tem efeito anti-apoptótico, antiinflamatório e outros. Foram utilizados ratos Wistar, adultos, machos, pesando entre 250-300g. Os animais foram distribuídos nos grupos: Salina (controle, animais que receberam 3ml/Kg de NaCl 0,9% intraperitoneal (i.p.), uma vez ao dia, 5 dias); PmxB (animais que receberam PmxB 40.000U/kg/dia, i.p., uma vez ao dia, 5 dias); Hemin (indutor da HO-1, 1mg/100g, i.p., uma vez ao dia, 5 dias); Protoporfirina de Zinco (ZnPP) (inibidor da HO-1, 50 umol/Kg, i.p., uma vez ao dia, 5ºdia); PmxB+Hemin; PmxB+ZnPP; PmxB+Hemin+ZnPP. Foram avaliados a função renal (FR) (clearance de creatinina, método de Jaffé), a excreção de peróxidos urinários (PU, FOX-2); TBARS urinários; tióis no tecido renal, atividade da catalase (AC) e foi realizada análise histológica no tecido renal. Os resultados mostraram que a PmxB induziu redução da FR com elevação de PU e TBARS, acompanhados por redução de AC e tióis: O tratamento com indutor da HO-1 reverteu a lesão pela PmxB, com melhora da FR e dos parâmetros de peroxidação. A associação do PmxB com o inibidor ZnPP demonstrou aumento da área intersticial relativa (AIR) no tecido renal com achatamento das células tubulares e pontos de necrose no córtex renal. Os resultados diferenciados de FR e peroxidação lipídica, nas técnicas de mensuração utilizadas, confirmaram a participação da heme oxigenase como antioxidante desse modelo de toxicidade renal / Toxic Acute Kidney Injury (AKI) consists on direct injury in the renal tubules liberating reactive oxygen species (ROS) and estimulating inflamatory processes. In this experimental study it was investigated the toxicity of Polymyxin B Sulfate (PmxB), which is a cationic antibiotic used to treat gram-negative infections and the role of the heme oxygenase enzyme (HO-1), with anti-apoptotic and anti-inflamatory effects, in this injury. Adult male Wistar rats, weighing 250-300g were used. The animals were divided into the following groups: Saline (control, animals that received 3ml/Kg of NaCl 0,9% intraperitoneal (i.p.), once a day, 5 days); PmxB (animals that received PmxB 40.000U/kg/dia , i.p., once a day, 5 days); Hemin (HO-1 inducer , 1mg/100g, i.p., once a day, 5 days); Zinc protoporphyrin (ZnPP) (HO-1 inhibitor, 50 umol/Kg, i.p., once a day, 5ºday); PmxB+Hemin; PmxB+ZnPP; PmxB+Hemin+ZnPP. Renal Function (RF) (creatinine clearance, Jaffé method), urinary peroxides (UP, FOX-2), urinary TBARS, thiols in the renal tissue, activity of catalase enzyme (CA) and histology of renal tissue were performed. The results showed that PmxB reduced RF with increment in the UP and TBARS associated to the reduction in the CA and thiols. The HO-1 ameliorated these paramethers. The association PmxB with ZnPP increased relative intersticial area (RIA) of renal tissue with acute tubule necrosis in the renal cortex. The obtained data on RF and lipid peroxidation, with the methods used in the study, confirmed the antioxidant role of the heme oxygenase in this model of renal injury

Heme oxigenase (HEOX) é uma enzima que converte o anel heme em biliverdina, monóxido de carbono (CO) e Fe3+. O CO ativa a guanilil ciclase, com resultante produção de 3?,5?-monofosfato de guanosina cíclico(cGMP) provocando relaxamento da musculatura lisa vascular. Nós verificamos o efeito da inibição aguda da heme oxigenase com zinco protoporfirina (ZnPP IX) sobre a pressão arterial de ratos Wistar machos recebendo dieta hipossódica (0,15% de NaCl), normossódica (1,3% de NaCl) ou hipersódica (8% de NaCl) desde o desmame, com 21 dias de vida. Para isto a pressão arterial caudal (grupo A - 3 e B - 6 meses de idade) e carotídea (grupo C) foram medidas antes e após a administração do inibidor da HEOX ou de veículo (Na2CO3). Em resposta ao ZnPP IX, os animais do grupo A submetidos à sobrecarga salina apresentaram uma significativa diminuição dos níveis pressóricos enquanto que os animais que recebiam dieta hipo e normossódica, apresentaram aumento dos níveis pressóricos. No grupo B e C, após inibição da enzima, não houve modificação dos níveis pressóricos dos ratos em nenhuma das três dietas. Observamos nos três grupos (A, B e C) uma correlação negativa entre a pressão arterial basal (antes da administração de ZnPP) e a área debaixo da curva da variação percentual das pressões arteriais após inibição de HEOX (grupo A: r = 0,66 - P < 0,0001?; grupo B: r = 0,59 - P = 0,006;?; grupo C: r = 0,59 - P < 0,0005?). Nos animais que receberam veículo, esta correlação não ocorreu, exceto para PAS no grupo C. Podemos concluir que a resposta pressórica à inibição da HEOX é modulada pela pressão arterial basal. / The heme ring is hydrolyzed by an enzyme called heme oxygenase (HEOX). The products of that reaction are biliverdin, carbon monoxide (CO) and Fe3+. CO produces vascular smooth muscle cell relaxation due to activation of guanylyl ciclase with the resultant production of 3?,5?-ciclic guanosine monophosphate (cGMP). In the present study the effect on blood pressure due to acute inhibition of HEOX by zinc protoporphyrin IX (ZnPP IX) was observed. Male Wistar rats were fed low (LSD ? 0.15% NaCl), normal (NSD ? 1.3%) or high salt diet (HSD - 8% NaCl) from weaning (21 days-old animals). Tail-cuff blood pressure was measured in group A and B and continuous intra-arterial pressure was evaluated in group C before and after ZnPP IX or vehicle (Na2CO3) administration. In group A, blood pressure decreased in rats on HSD, and increased in the animals on NSD and LSD after ZnPP IX administration. A similar response to ZnPP IX was observed in group B. In group C no change in blood pressure was observed in the rats on the three diets. A negative correlation was obtained between blood pressure measured before ZnPP IX and the area under the curve of the percentual blood pressure change induced by ZnPP IX [(group A: r=0.66 - P<0.0001), (group B: r=0.59 - P=0.006), and (group C: r=0.59 - P<0.0005)]. In the animals that received vehicle, this correlation was not observed. In conclusion, in Wistar rats, the effect of HEOX inhibition by ZnPP IX is modulated by the basal blood pressure levels.

Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:41:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bifaroni_RenataManoScatamburlo_M.pdf: 12304500 bytes, checksum: a5c3c67724b7ea654b79231b9f69925a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A heme oxigenase (HO) é uma enzima envolvida na degradação de grupos heme, levando à formação de biliverdina IX, ferro e monóxido de carbono. Em baixas concentrações, esses produtos exercem diversos efeitos protetores, inclusive antiapoptóticos, antiinflamatórios, antiproliferativos e antitrombóticos, enquanto, em concentrações elevadas, podem resultar em hipóxia, comprometimento neurológico, disfunções mitocondriais e hiperbilirrubinemia. Neste estudo, investigamos o envolvimento da HO no aumento da permeabilidade vascular, na hemorragia e na mionecrose causadas pela peçonha de Bothrops jararacussu. A peçonha de B. jararacussu (0,3-3 µg/sítio) aumentou a permeabilidade vascular no dorso de pele de camundongos. Este aumento foi inibido pelo zinco deuteroporfirina 2,4-bis-glicol (ZnDPBG), um inibidor não seletivo da HO, quando administrado i.p. (45 e 90 µmol/kg), mas não quando i.d. (25-200 nmol/sítio). O co-tratamento com o inibidor do óxido nítrico sintase, N?-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 100 nmol/sítio), não potencializou a inibição por ZnDPBG. ZnDPBG (45 ou 90 µmol/kg, i.p.) não reduziu a hemorragia na pele (3 e 10 µg de peçonha/sítio), mas aumentou esta resposta na dose maior. A peçonha (25 µg e 75 µg) aumentou a atividade da HO em músculo gastrocnêmio de camundongos em dois momentos - um precoce (nas primeiras horas após o envenenamento - fase de lesão aguda) e um tardio (alguns dias após a injeção de peçonha, fase de regeneração muscular). Na dose de 75 µg da peçonha, ocorreu aumento da expressão gênica da HO-1, entre 3 e 12 horas após o envenenamento, com pouca alteração na expressão da HO-2. As alterações histológicas causadas pela peçonha (25 µg e 75 µg) consistiram de três fases: fase 1 (até 6 h ou 12 h pós-peçonha - p.p.), caracterizada por hemorragia e mionecrose, fase 2 (de 12 h a 72 h p.p.), caracterizada por um extenso infiltrado inflamatório e fase 3 (7-28 dias p.p.), caracterizada por células regenerativas e maior deposição de colágeno ao redor destas células. O tratamento com ZnDPBG (90 µmol/kg, i.p.), 15 minutos após a injeção da peçonha (75 µg), inibiu parcialmente a mionecrose, diminuindo também os níveis de CK nas primeiras horas (1-3 h) pós-peçonha. Estes resultados indicam um envolvimento da HO no edema e na mionecrose causadas pela peçonha de B. jararacussu, e mostram que a inibição desta atividade com ZnDPBG pode proporcionar alguma proteção contra esses efeitos locais / Abstract: Heme-oxygenase (HO) is an enzyme involved in the degradation of heme groups that results in the formation of biliverdin IX, iron and carbon monoxide. At low concentrations, these reaction products have anti-apoptotic, anti-inflammatory, anti-proliferative, and anti-thrombotic activities, whereas at high concentrations they can cause hypoxia, neurological damage, mitochondrial dysfunction and hiperbilirrubinemia. In this study, we investigated the involvement of HO in the increase in vascular permeability, hemorrhage and myonecrosis caused by Bothrops jararacussu snake venom. Bothrops jararacussu venom (0.3-3 µg/site) increased the vascular permeability in mouse dorsal skin. This increase was inhibited by zinc deuteroporphyrin 2,4-bis-glycol (ZnDPBG), a non-selective HO inhibitor, when administered i.p. (45 and 90 µmol/kg). In contrast, ZnDPBG given i.d. (25-200 µmol/site) did not affect the increase in vascular permeability. Co-treatment with the nitric oxide synthase inhibitor N?-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 100 nmol/site) did not potentiate the inhibition by ZnDPBG. ZnDPBG (45 or 90 µmol/kg, i.p.) did not reduce the dorsal skin hemorrhage (3 and 10 µg of venom/site), but rather, increased this response at the highest dose. Venom (25 and 75µg) increased the HO activity of mouse gastrocnemius muscle. The increase in activity was biphasic and included early (first few hours after envenoming, corresponding to acute damage) and late (7-18 days after envenoming - muscle regeneration) phases. Enhanced gene expression of HO-1 was seen 3-12 h after envenomation (75 µg), with little change in HO-2 expression. Histological analysis showed that the muscle damage consisted of three phases: phase 1 (up to 6-12 h post-venom), characterized mostly by hemorrhage and myonecrosis, phase 2 (12-72 h post-venom), characterized by an extensive inflammatory infiltrate, and phase 3 (7-28 days post-venom), characterized mainly by regenerative cells and an increase in collagen deposition around these cells. Treatment with ZnDPBG (90 µmol/kg, i.p.) 15 min after venom (75 µg) injection partially attenuated the myonecrosis and also decreased the creatine kinase (CK) levels after 1 and 3 h. Together, these results indicate that HO activity is involved in the edema and myonecrosis caused by B. jararacussu venom, and that the inhibition of this activity with ZnDPBG provides some protection against these local effects / Mestrado / Mestre em Farmacologia

A malária é uma doença causada pelo parasita do gênero Plasmodium e que foi responsável por cerca de 440.000 mortes em 2015. A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma das principais complicações clínicas da malária. O modelo murino DBA/2 reproduz os sinais clínicos da SDRA observados em humanos, quando infectado com o Plasmodium berghei ANKA. Além disso, altos níveis da enzima heme oxigenase 1 (HO-1) foram observados em casos de malária cerebral e em SDRA em humanos. Os nossos dados indicam que os níveis da HO-1 estão aumentados em camundongos que desenvolvem SDRA associada à malária (SDRA-AM). Adicionalmente, a droga indutora de HO-1 (hemina) aumentou a sobrevivência e preveniu a SDRA-AM. Verificou-se também uma redução na permeabilidade pulmonar e nos níveis de VEGF, além de uma melhoria nos parâmetros respiratórios em animais tratados com hemina. Assim sendo, a indução da HO-1 antes do desenvolvimento da SDRA-AM é protetora e assim, a HO-1 pode ser um alvo de novos fármacos, como forma de prevenir o desenvolvimento da SDRA-AM em humanos. / Malaria is a serious disease, caused by the parasite of the genus Plasmodium, which was responsible to 440,000 deaths in 2015. Acute lung injury/ acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS) is one of the main clinical complications in severe malaria. The murine model DBA/2 reproduces the clinical signs of ALI/ARDS observed in humans, when infected with Plasmodium berghei ANKA. Additionally, high levels heme oxygenase 1 (HO-1) were reported in cases of cerebral malaria and in ALI/ARDS in humans. Our data have indicated that the HO-1 levels are increased in mice that develop malaria associated ALI/ARDS (MA-ALI/ARDS). Additionally, a HO-1 inducing drug (hemin) increased the survival rate and prevented mice from developing MA-ALI/ARDS in treated mice. Also, there was a decrease in the lung permeability and in lung VEGF levels, and an amelioration of respiratory parameters. Therefore, the induction of HO-1 before the development of MA-ALI/ARDS is protective, making this enzyme a possible target of new drugs to prevent the development of MA-ALI/ARDS in humans.

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O gás monóxido de carbono (CO) possui diversas funções no sistema nervoso central (SNC) funcionando como neuromodulador, como por exemplo da regulação da temperatura corporal, da nocicepção e mais recentemente, do comportamento emocional. Este neuromodulador gasoso é produzido pela ação da enzima heme oxigenase (HO), a qual é encontrada em diferentes áreas do SNC. Com destaque, esta enzima tem alta expressão no locus coeruleus (LC), o que sugere o envolvimento do CO na modulação de funções desempenhadas por esta estrutura. O LC localiza-se na ponte, sendo a maior origem da inervação noradrenérgica do SNC. Esta estrutura tem participação ativa na modulação das respostas relacionadas ao estresse, em particular, na modulação do comportamento emocional, desde que integra o Sistema de Inibição Comportamental (SIC), o qual inclui ainda o sistema septo-hipocampal e os núcleos da rafe. O SIC é responsável por comandar respostas defensivas de avaliação de risco, alerta e atenção, as quais podem ser eliciadas pela ansiedade. Dentro desta perspectiva, o presente estudo teve como objetivo avaliar se a ativação sistêmica da via HO-CO pode modular o comportamento emocional de ratos, e se há participação do LC. Assim, este trabalho avaliou se o tratamento sistêmico via intraperitoneal (i.p.) agudo (3 h antes) ou crônico (10 dias/2 vezes ao dia) com um liberador de monóxido de carbono (CORM-2), ou com indutor da enzima HO (CoPP), altera as respostas comportamentais no teste do labirinto em cruz elevado (LCE) e no teste claro-escuro (TCE) em ratos, bem como a expressão da enzima HO no LC. Em uma segunda etapa foi avaliado se a administração aguda de CORM-2 ou CoPP altera o comportamento avaliado no LCE e no TCE de ratos submetidos ao estresse crônico variado (ECV) por 10 dias. Os resultados mostraram que o CO induzido pela administração aguda ou crônica de CORM-2 ou CoPP possui efeito ansiolítico. Ainda, o tratamento com CORM-2 ou CoPP aumentou a expressão da enzima HO-1 em células localizadas no LC, sem alterar a imunorreatividade à enzima HO-2. Considerando os grupos submetidos ao estresse ECV, nem a ativação da via HO-CO ou o ECV apresentaram efeitos significativos nos comportamentos avaliados nos testes LCE e TCE. Os resultados do presente estudo sugerem que o tratamento sistêmico com drogas que modulam a liberação de CO possui claro efeito ansiolítico. Assim, é possível que o CO possa ser uma droga com potencial terapêutico para o tratamento de desordens neuropsiquiátricas. / The carbon monoxide gas (CO) has several functions in the central nervous system acting as a neuromodulator, such as in the body temperature regulation, nociception and more recently, in the emotional behavior modulation. This gas is produced by the action of the heme oxigenase enzyme (HO), which is found in different areas of the central nervous system (CNS). It is important to note that this enzyme has high expression in the locus coeruleus (LC), suggesting the involvement of CO in the modulation functions performed by this midbrain structure. LC is located in the pons, being the source of majority of the noradrenergic innervation of the CNS. This structure is intimately involved in the stress modulation responses, particularly in the emotional behavior regulation, since it integrates the Behavioral Inhibition System (BIS), which also includes septum-hippocampal system and raphe nucleus. The BIS is responsible for defensive responses like the risk assessment and alertness trigged by anxiety. Within this perspective, the present study was designed to evaluate whether the systemic HO-CO pathway can modulate emotional behavior of rats, and if the HO enzyme of the neurons located into LC is involved in this response. Thus, this study evaluated whether the acute systemic i.p. treatment (3 hours before) or chronic (10 days / 2 times a day) with a carbon monoxide releaser (CORM-2) or inducer of heme enzyme oxygenase (CoPP), is able to alter the behavioral responses in the elevated plus maze (EPM) and in the light-dark box test (LDB) in rats, and the HO enzyme expression in the LC. Furthermore, the effect of the acute administration of CORM-2 or CoPP was evaluated in the emotional behavior assessed in the EPM and LDB by rats submitted to unpredictable chronic stress (during 10 days). The results showed that the CO induced by acute or chronic administration of CORM-2 or CoPP has an anxiolytic-like effect. Furthermore, treatment with CORM-2 or CoPP promoted an increase of HO-1 enzyme expression in cells located in the LC without altering the immunoreactivity of HO-2 enzyme. Still, considering the rats subjected to stress UCS neither the activation of HO-CO pathway nor the UCS protocol altered the emotional behavior evaluated in the EPM and LDB tests. The results of this study suggest that systemic treatment with drugs that modulate the CO release has anxiolytic effect. Thus, it is possible that CO can be a potential drug therapeutic target for neuropsychiatric disorders.

Der nach Leberoperation und -transplantation auftretende Ischämie-/ Reperfusionsschaden (I/R) und die konsekutive Inflammation des Lebergewebes stellen ein bedeutendes klinisches Problem dar. In der vorliegenden Arbeit wurden Einflüsse der warmen und kalten Ischämie (100% N2 bei 37°C bzw. 4°C) sowie der Exposition inflammatorischer Zytokine und Endotoxin (IL-1beta, 10 U/ml; IFN-gamma, 100 U/ml; TNF-alpha, 500 U/ml; LPS, 5 µg/ml) auf die Expression der Hämoxygenase-1 (HO- 1) mRNA und seines Proteins, einem Vertreter der Hitze-Schock-Proteine mit potentiell antioxidativer Wirkung, in humanen Hepatozytenprimärkulturen untersucht. Warme und kalte Ischämie stimulierten die HO-1 mRNA Expression in humanen Hepatozyten nach 0,5 bis 1h. Das HO-1 Protein wurde über 0,5-6h maximal exprimiert. Der Zellschaden, gemessen an der AST und LDH Freisetzung unter ischämischen Bedingungen wurde insbesondere nach 24 h beobachtet. Nach Zytokinexposition wurde die höchste Expressionsrate der mRNA durch IFN-gamma hervorgerufen, gefolgt von TNF-alpha, LPS und IL-1beta. Jedes einzelne Zytokin stimulierte die HO-1 mRNA Expression nach 0,5 h, erreichte ein Maximum nach 3 h und fiel nach 6 h ab. Nach Stimulation mit einem Zytokinmix (CM; IFN-gamma, TNF-alpha, IL-1beta, LPS) trat ein Maximum der HO-1 mRNA Expression erst nach 6 h ein, wobei ein signifikanter Zellschaden nach 12 h beobachtet wurde. Die HO-1 mRNA und Proteinexpression war nach Exposition von 6 h des Sauerstoffperoxides (H2O2, 200- 1000 µM) erhöht. Die HO-1 mRNA und Proteinexpression war nach S- nitrosoacetylpenicillamin (0.5 mM) Exposition, einem NO Donator, für 3-12 h verstärkt. Nach Cobalt-protoporphyrin (CoPP, 1µM) Exposition, einem potenten HO-1 Induktor, wurde eine erhöhte mRNA- und Proteinexpression beobachtet. Dass CoPP die HO-1 mRNA- und Proteinneusynthese induziert, konnte durch die selektive Blockade mit Actinomycin D und Cycloheximide bewiesen werden. Die Neusynthese konnte ebenfalls unter warmer und kalter Ischämie gezeigt werden. Hemin (10 µM), ein weiterer Induktor der HO-1, induzierte die HO-1 mRNA nach 3 h und das Protein nach 6 h. Die HO-1 Enzymaktivität wurde mittels Bilirubinbildung und Messung des Fe2+ Gehalts der Zellen bestimmt. Bei der Bilirubinbildung wurde die höchste Aktivität nach warmer Ischämie gemessen, gefolgt von kalter Ischämie, CM und der Kontrollgruppe. Die intrazelluläre Fe2+ Messung ergab ebenfalls die höchste Enzymaktivität nach warmer Ischämie. Die Vorbehandlung humaner Hepatozyten mit CoPP (1-50 µM) für 8 h, schützte die Zellen teilweise vor einer warmen und kalten Ischämie. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die pharmakologische Induktion der HO-1 somit bei großen allgemeinchirurgischen Eingriffen, wie der Leberteilresektion oder der Transplantation, einen protektiven Effekt entfalten könnte. / Hepatic injury induced by ischemia/ reperfusion (I/R) and inflammation following surgeries or transplantations creates important clinical problems. In this study, the effect of inflammatory conditions such as cytokine/ endotoxin exposure (IL-1beta, IFN-gamma, TNF-alpha, LPS), warm and cold ischemia on HO-1 mRNA and protein, a member of heat shock proteins, was investigated. It was observed that IFN-gamma caused the highest HO-1 mRNA expression, followed by TNF-alpha, LPS and IL- 1beta. Each stimuli increased HO-1 mRNA expression after 0.5 h, peaked at 3 h and decreased after 6 h. Highest HO-1 protein expression was observed after 0.5 to 1 h of stimulation with IFN-gamma, which was followed by LPS, TNF-alpha and IL-1beta. The peak of HO-1 expression using all four stimuli (CM) was after 6 h. CM caused a significant increase in LDH and AST after 12 h. Warm and cold ischemia stimulated HO-1 mRNA expression in human hepatocytes at 0.5-1 h. HO-1 protein expression had its maximum between 0.5-6 h. Cellular damage measured as the release of LDH and AST was significant after 24 h. Mimicking oxydative stress, hepatocytes were exposed to 200-1000 µM H2O2 for 6 h which also showed an increased HO-1 mRNA and protein expression. HO-1 mRNA and protein expression revealed an increase after SNAP exposure at 3-12 h. Results with CoPP (10 µM), a potent inducer of HO- 1, displayed an increase in HO-1 mRNA and protein expression. It was proved, that CoPP induced new synthesis of mRNA and protein by its blocking agents such as actinomycin D and cycloheximide, respectively. Hemin (10 µM), another inducer of HO-1, triggered HO-1 mRNA expression after 3 h and protein expression after 6 h. The HO-1 enzyme activity was measured by bilirubin production after exposure to CM, as well as warm and cold ischemia. The highest enzyme activity was found after warm ischemia, followed by cold ischemia, CM and then by the control group. Fe2+ content of the cells, used as another method to judge HO-1 activity, confirmed our findings. Pre-treatment of human hepatocytes with different concentrations of CoPP (1-50 µM) protect cells against warm or cold ischemia. Therefore, we conclude that pharmacological induction of HO-1 may have therapeutic potential under inflammatory conditions such as seen during liver resection or liver transplantation.

Hämoxygenasen (HO) katalysieren unter der Aufnahme von molekularen Sauerstoff und der Freisetzung von Kohlenmonoxid (CO) und Eisen (Fe2+) die Oxidation von Häm zu Biliverdin. HO-1, eine induzierbare Isoform der HO, wird durch ihre Aktivität mit zellschützenden, antiinflammatorischen und antiapoptotischen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Dabei gilt insbesondere das CO als Mediator dieser Eigenschaften. Die molekularen Wechselwirkungen und genregulatorischen Funktionen von CO sind allerdings noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurden mittels cDNA Microarray-Technologie Gene identifiziert, die in der murinen Leber nach Inhalation von CO oder nach pharmakologischer Induktion von mHO-1 eine differentielle Expression der mRNA aufwiesen. Diese Gene konnten in einen Zusammenhang mit der circadianen Uhr gebracht werden und führten zu der Hypothese, dass CO einen direkten Einfluss auf den molekularen Oszillator der Inneren Uhr hat. Dies konnte in primären Hepatozyten durch eine veränderte circadiane Expression der essentiellen Uhrgene mPer2 und mRev-erba nach CO-Behandlung bestätigt werden. Weiterhin wurde für mHo-1 eine, bisher unbekannte, circadian regulierte Genexpression in primären Hepatozyten und der murinen Leber gezeigt. Es konnte die Funktionalität einer speziesübergreifend, konservierten E-Box im Promotor von mHo-1 nachgewiesen werden, die diese Regulation initiieren kann. Bezüglich der circadianen Oszillation von essentiellen Komponenten der circadianen Uhr zeigten mHo-1 Knockout-Fibroblasten eine veränderte Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren eine enge Kopplung des Häm-Metabolismus mit der circadianen Uhr. HO-1 scheint dabei in diesem regulativen Netzwerk eine funktionale Rolle zu spielen. Einerseits könnte diese Verbindung eine weitere Kommunikation der circadianen Uhr mit metabolischen Prozessen darstellen und bietet andererseits eine neue Sichtweise bezüglich der Aufklärung der zellschützenden Eigenschaften von HO-1. / Heme oxygenases (HO) catalyze the oxidation of heme and generate the bile pigment biliverdin, ferric iron and carbon monoxide (CO). Endogenous produced CO, especially due to the activity of the inducible isoform HO-1, has been associated with cytoprotective, anti-inflammatory and –apoptotic functions. CO is a signalling molecule, but the molecular interactions and gene regulatory functions are still unknown. In the present thesis a cDNA microarray identified genes in murine liver which were expressed differentially after inhalation of CO and pharmacological induction of HO-1. Interestingly, the expression of the candidate genes is directly controlled by the molecular circadian clockwork, and led to the hypothesis that CO has an influence on the molecular oscillator of the circadian clock. It was shown, that CO influences the gene expression of essential clock genes in primary hepatocytes. Furthermore, it was demonstrated that the gene expression and activity of mHO-1 is circadian regulated in primary hepatocytes and liver, and is reasonably based on a functional E-box in the promoter of the mHO-1 gene. The deficiency of HO-1 in HO-1 knockout mice displayed differential gene expression profiles in magnitude and amplitude of the circadian oscillations of essential clock and output genes. In this work it was shown, that the heme metabolism is coupled very close to the molecular circadian oscillator. HO-1 plays a functional role in the regulation of this regulatory network, which could provide insights into the understanding of cytoprotective properties of HO-1.

A exposição de animais a situações ameaçadoras de natureza inata ou aprendida resulta em exibição de um repertório de comportamentos defensivos espécie-específicos, alterações autonômicas e em inibição da dor, sendo esse conjunto de reações de alta relevância para a sobrevivência de uma espécie. Considerando este contexto, um importante componente da resposta do organismo a situações de emergência é a redução da capacidade de perceber a dor. O processamento de estímulos nociceptivos pode ser modulado no prosencéfalo, na medula espinal, no tronco encefálico e no diencéfalo, por mecanismos envolvendo diferentes neurotransmissores e neuromoduladores. Nos últimos anos, evidências têm demonstrado que o monóxido de carbono (CO), produzido a partir da enzima heme-oxigenase estimula a formação de guanosina 3, 5- monofosfato cíclico (GMPc), participando como neuromodulador de vários processos fisiológicos. Dentro deste contexto, mostrou-se que a via HO-CO-GMPc está envolvida na modulação periférica e espinal da dor inflamatória, bem como na modulação do estresse, porém não há conhecimento da participação desta via na modulação de estímulo doloroso agudo, bem como da antinocicepção induzida pelo estresse. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o envolvimento da via HO-CO-GMPc na nocicepção e na antinocicepção induzida pelo estresse agudo em ratos, avaliada pelo índice de analgesia no teste de retirada da cauda (IARC). Nossos resultados demonstraram que a ativação da via HO-CO-GMPc por meio da administração ICV de heme-lisinato (substrato) tem efeito antinociceptivo, sendo este efeito dependente da atividade GMPc, desde que o pré-tratamento com inibidor da guanilase ciclase solúvel (GCs), ODQ, bloqueou o aumento do IARC. Ainda, esta modulação ocorre de maneira fásica e não tônica, pois o tratamento isolado ICV com o inibidor da HO, ZnDBPG ou com o inibidor da GCs, ODQ, não alterou o IARC. A antinocicepção induzida pelo estresse agudo (restrição física por 120 min) não é dependente da via HO-CO-GMPc, desde que o tratamento com o ZnDBPG, nem com o heme-lisinato alteraram o IARC. No entanto, esta antinocicepção é dependente da atividade do GMPc, pois o pré-tratamento com ODQ bloqueou o aumento do IARC. / The exposure of animals to threatening situations of innate or learned nature results in exhibition of a repertoire of species-specific defensive behaviors, autonomic alterations and pain inhibition. This group of reactions has high relevance for the survival of species. In this context, an important component of the response of the organism in the emergency situations is the reduction of the capacity to perceive pain. The processing of nociceptive stimulus can be modulated in forebrain, in spinal, and in midbrain, for mechanisms involving different neurotransmitters and neuromodulators. Recently, evidence has demonstrated that carbon monoxide gas (CO), produced from the enzyme heme oxygenase (HO), stimulate the formation of 3\', 5\' - cyclic guanosine monophosphate (cGMP), and this molecule has participated as neuromodulator in some physiological processes. In this way, it has shown that the HO-CO-cGMP pathway is involved in the peripheral and spinal modulation of inflammatory pain, as well as in the modulation of the stress. However, the involvement of this pathway in the modulation of acute painful stimulus, as well as in the antinociception induced by stress isn´t clarified. Thus, this study evaluated the involvement of the HO-CO-cGMP pathway in nociception and in antinociception induced by acute stress in rats, by means the of analgesia index in the tail flick test (AITF). Our results demonstrated that the activation of the HO-CO-cGMP pathway by means of heme-lysinate ICV administration has antinociceptive effect. Again, the increase of the AITF was dependent of the cGMP activity, since that the pretreatment with inhibitor of soluble guanylase cyclase (sGC), ODQ, blocked the antinociceptive effect. This modulation occurs in fasic and not tonic manner, because per se ICV treatment with inhibitor of the HO, ZnDBPG or with inhibitor of the sGC, ODQ did not modify the AITF. The antinociception induced by acute stress (physical restriction during 120 min) is not dependent of the HO-CO-cGMP pathway, since that neither the treatment with the ZnDBPG, nor with the heme-lysinate had modified the AITF. However, this antinociception is dependent of the activity of the cGMP, because the pretreatment with ODQ blocked the increase of the AITF induced by acute stress.