Systematic discontinuation of long-term treatment with nucleos(t)ide analogues (NAs) is one strategy to increase functional cure rates in patients with chronic hepatitis B e antigen (HBeAg)-negative hepatitis B. Currently, available study results are heterogeneous; however, long-term hepatitis B surface antigen (HBsAg) loss rates of up to 20% have been reported in prospective trials. This review proposes criteria that can be used when considering NA discontinuation in patients with chronic hepatitis B virus (HBV). Discontinuing NA treatment frequently results in a virologic and biochemical relapse that runs through different phases: the lag phase, reactivation phase, and consolidation phase. The HBV-DNA flares observed during the reactivation phase are often transient and most likely represent a trigger for inducing a long-term immune control by specific CD8+ T cells, and therefore do not need immediate interventions but close follow-up evaluation. Low HBsAg levels at the time of treatment cessation predict a positive long-term response to NA discontinuation associated with a higher likelihood of HBsAg clearance. Other host and viral biomarkers are currently under evaluation that may prove to be helpful to further characterize the population that may benefit most from the finite NA treatment concept. Potential harmful biochemical flares during the reactivation phase need to be identified early and can be effectively terminated by reintroducing NA treatment. Hepatic decompensation represents a risk to patients with cirrhosis undergoing NA discontinuation. Therefore, the finite NA approach should only be considered after excluding advanced fibrosis and cirrhosis and if a close follow-up of the patient and supervision by an experienced physician can be guaranteed. Conclusion: For selected patients, NA discontinuation has become a powerful tool to achieve control over HBeAg-negative HBV infections. Its significant effect represents a challenge to novel treatment approaches, but it may also serve as their enhancer.

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Una correcta inmunización de la población reclusa minimiza el riesgo de transmisión de enfermedades vacunables en las prisiones. El indudable beneficio de la vacunación como medida de salud pública en términos de eficacia y coste-efectividad tiene particular interés en el ambiente carcelario. La población reclusa reúne características que incrementan su vulnerabilidad para padecer enfermedades transmisibles, algunas de ellas prevenibles mediante inmunización. Su paso por la cárcel representa para este grupo de población una excelente oportunidad para entrar en contacto con el sistema de salud ya que es un colectivo difícilmente accesible en la comunidad. La importancia de la vacunación en las prisiones reporta un beneficio a la sociedad ya que su contacto con el exterior es frecuente. Ser una comunidad cerrada facilita la puesta en marcha de actividades de inmunización a cargo de los sanitarios de las instituciones penitenciarias. El objetivo de este estudio fue evaluar la cobertura vacunal en presos de larga duración del sistema penitenciario español, mediante un estudio longitudinal retrospectivo. Fueron seleccionados 1005 internos que permanecieron ingresados entre 2008 y 2018 en tres cárceles españolas. Se evaluó su nivel de inmunización frente a la hepatitis A, hepatitis B, tétanos, difteria, neumococo e influenza estacional. Se valoró también el estado vacunal de los presos con diagnóstico serológico de HBV, HCV y HIV positivos.

Der Nachweis einer chronischen Hepatitis-B Infektion hat in der Transfusionsmedizin aufgrund der potenziellen Übertragung durch Bluttransfusionen einen bedeutenden Stellenwert. Das etablierte Screening umfasst einen direkten HBV-DNA Nachweis sowie einen indirekten Virusnachweis über Anti-HBs- und Anti-HBc-Antikörper. Dieses Screening erfasst den Großteil aller Infektionen. Der Nachweis der okkulten Hepatitis B Infektion, einer Form der chronischen HBV-Infektion, stellt sich jedoch herausfordernd dar. Ursächlich dafür ist unter anderem, dass die HBV-DNA im Blut der okkult-Infizierten in sehr geringer Quantität vorliegt und die Anti-HBs-Antikörper im Laufe der Infektion nicht mehr nachweisbar sind. Eine Erfassung der antigenspezifischen Immunantwort in T-Lymphozyten stellt eine Alternative zu dem beschriebenen Verfahren dar. Etablierte immunologische Verfahren zur Erfassung der antigenspezifischen Immunantwort sind MHC-Tetramer-Messungen und die Detektion, der von T-Lymphozyten produzierten, intrazellulären Zytokine, wie z.B. INF-. In der vorliegenden Arbeit wurde pSTAT5 als neuer intrazellulärer Aktivierungsmarker untersucht, welcher als Teil des JAK-STAT-Signalweges eine prominente Rolle in der T-Zell-Aktivierung nach der Stimulation mit einem Antigen spielt. Es wurde untersucht, ob T-Lymphozyten aus Blutspenden und daraus hergestellten Buffy-Coats zur Analyse des Aktivierungsmarkers pSTAT5 isolierbar sind und ob dafür, alternativ zu der Dichtezentrifugation, eine auf Fab-Streptameren-basierende Immunaffinitätschromatografie genutzt werden kann. Darüber hinaus wurde überprüft, inwieweit sich die pSTAT5-Bestimmung eignete, um isolierte, mit Peptid stimulierte virusspezifische T-Zellen durchflusszytometrisch zu detektieren. Aufgrund der hohen Seroprävalenz wurde zunächst die T-Zell-Antwort auf Peptide des Zytomegalievirus untersucht. Abschließend erfolgte die Analyse der STAT5-Phosphorylierung an isolierten T-Zellen chronisch HBV-Infizierter. Die Untersuchungen zeigten, dass die Fab-Streptamer-basierte Immunaffinitätschromatografie die Selektion funktionsfähiger Zellen mit Hilfe von entsprechenden Fab-Fragmenten ermöglicht. In dieser Arbeit wurden CD4+ Zellen und CD81+ periphere mononukleäre Blutzellen isoliert. Um die Qualität und Ausbeute der hergestellten Zellisolate zu untersuchen, erfolgte in einem ersten Schritt die durchflusszytometrische Analyse selektionierter CD4-Zellisolate im Vergleich zum Ausgangsmaterial Buffy-Coat. Die Isolation der T-Lymphozyten erfolgte vergleichend mittels konventioneller Dichtezentrifugation und der Immunaffinitätschromatografie sowohl aus heparinisiertem Vollblut als auch aus Buffy-Coats. Als Positivkontrolle wurden die Zellen zunächst antigenunspezifisch mit PHA und anti-CD3/CD28-Antikörpern sowie in weiteren Versuchen mit CMV-Peptiden (pp65, IE1) sowie HBV-Peptiden (core, envelope, capsid) kurzzeit-kultiviert und durchflusszytometrisch auf die Expression von pSTAT5 untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Fab-Streptamer-Immunaffinitätschromatografie hochreine Präparate lieferte. Im CD4+ Zellisolat waren durchschnittlich 98,2 % CD4+ Zellen nachweisbar, dabei wurden B-Lymphozyten, NK-Zellen und CD8+ T Lymphozyten vollständig depletiert. Die vergleichende Stimulation der T-Zell-Isolate mit Hilfe beider Methoden nach antigenunspezifischer Stimulation führte zu einem signifikanten (p<0,01) Anstieg des pSTAT5 im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle. Der Anteil der STAT5+ Zellen lag in den dichtezentrifugierten Präparaten vor und nach Stimulation höher als in den mit Immunaffinitätschromatografie isolierten Proben. Es eigneten sich sowohl heparinisiertes Vollblut als auch Buffy-Coats aus Vollblutspenden zur Isolation der T-Zellen. Die Stimulation dieser Zellen von CMV+-Spendern mit CMV-Peptiden resultierte in einem signifikanten Anstieg (p<0,05) der Frequenz der pSTAT5+ CD4+ T-Lymphozyten in den dichtezentrifugierten Zellen von 9,3 % ± 3,6 % (unstimuliert) auf 21,6 % ± 6,9 %. Im Zellisolat stieg die Frequenz signifikant (p<0,01) von 0,6 % ± 0,7 % (unstimuliert) auf 7,2 % ± 9,8 %. Somit wiesen die dichtezentrifugierten Zellen einen dreifachen und das CD4+ Zellisolat einen siebenfachen Frequenzanstieg nach antigenspezifischer Stimulation gegenüber der Kontrolle auf. Die Stimulation von T-Zellen CMV–-Spender führte hingegen zu keinem nachweisbaren Anstieg der pSTAT5+ T-Zellen im Vergleich zur Kontrollpopulation. In den mit beiden Methoden isolierten T-Zellen chronisch HBV-Infizierter wurden prozentual mehr pSTAT5+ Zellen in den mit HBV-Peptiden stimulierten CD4+ T-Lymphozyten gemessen als in den Kontrollproben. In den dichtezentrifugierten Zellen stiegen die Phosphorylierungsraten signifikant (p<0,01) von 0,6 % ± 0,3 % auf 1,8 % ± 1,2 %, im CD81-Zellisolat signifikant (p<0,05) von 2,3 % ± 3,4 % auf 5,3 % ± 7,8 % an. In Summe zeigte sich, dass die Fab-Streptamer-Immunaffinitätschromatografie eine hohe Qualität und Standardisierbarkeit der Zellisolation aufweist. Sie könnte als eine Alternative zu der konventionellen Dichtezentrifugation eingesetzt werden. Die durchflusszytometrische Analyse des Aktivierungsmarkers pSTAT5 ermöglichte eine schnelle Erfassung der T-Zell-Aktivierung. In der vorliegenden Arbeit konnten STAT5-Phosphorylierungen sowohl nach antigenunspezifischer Stimulation als auch nach Stimulation mit CMV- und HBV-Peptiden detektiert werden. Dieser immunologische Test ist in der Transfusionsmedizin bisher nicht etabliert und könnte ergänzend zu herkömmlichen Screenings bei der Erfassung von okkult HBV-Infizierten Anwendung finden. Speziell könnte dieses Verfahren bei fraglichen Befunden ausgewählter Spender im Rahmen transfusionsmedizinischer Routine-Diagnostik ergänzend anwendbar sein. Die Eignung des Assays zur Erfassung von T-Zell-Antworten gegen weitere Antigene stellt einen Ausgangspunkt für zukünftige Untersuchungen dar.

Hepatitis B virus (HBV) represents one of the hot topics of current basic and pharmaceutical research. Although an effective vaccine against HBV exists since 1982, the world prevalence of chronic infection is still alarming. The infection can lead to significant liver damage, often resulting in hepatocellular carcinoma. Chronic HBV infection cannot be cured due to the fact that the viral genome persists in the infected hepatocyte hidden from the host immune response as well as from the antiviral treatment. One of the novel approaches aiming for HBV cure suggests that this cccDNA pool could be destroyed using gene editing tools such as CRISPR/Cas9 system. In order to shift this gene editing system to possible medicinal application, CRISPR/Cas9 has to be specifically delivered into the target cell in order to minimize its putative off-target activity. This thesis focuses at first on the design and efficacy testing of new sgRNAs targeting HBV cccDNA and secondly, it describes modular lipid nanoparticles developed specially for delivery of the CRISPR/Cas9 system in the form of RNA. Keywords: hepatitis B virus, CRISPR/Cas9, gene editing, lipid nanoparticles, mRNA delivery, targeted delivery

The study by Rehan et al. [1] was evaluated for support of the conclusion was by the data. The deviations from recommended practices were infrequent and not shown to be clinically significant. Although a strong study, the conclusion that world-wide education programs are needed is not warranted.

Objetivo: El personal sanitario es un colectivo profesional expuesto a riesgos ocupacionales. Los objetivos de esta tesis fueron analizar la ausencia de seroprotección frente al sarampión, la rubeola, la parotiditis, la varicela, la hepatitis A y la hepatitis B de los trabajadores sanitarios vinculados a dos Departamentos de Salud de la Comunidad Valenciana, considerando edad, sexo, categoría profesional, riesgo laboral y área de desempeño e identificar, visualizar y describir patrones de coocurrencia de la ausencia de seroprotección al sarampión, la rubeola, la parotiditis, la varicela, la hepatitis A y la hepatitis B, junto con el sexo, la edad, la categoría profesional, el riesgo en el puesto de trabajo y el área de desempeño profesional. Métodos: Estudio observacional transversal. Datos recogidos de informes de vigilancia de la salud, que incluyen resultados serológicos de 2674 trabajadores. Las variables sociodemográficas fueron: sexo, grupos de edad (18-34; 35-49; >50 años), clasificación del servicio (riesgo/no riesgo), categoría profesional, área de desempeño profesional (atención primaria/atención hospitalaria); la variable dependiente fue ausencia de inmunización frente a sarampión, rubeola y parotiditis, varicela, hepatitis A y hepatitis B identificada por ausencia de niveles serológicos. Se realizó un análisis de regresión logística. Para valorar la coocurrencia de sarampión, rubeola, parotiditis, varicela, hepatitis A y hepatitis B se consideró un análisis de redes. Resultados: La prevalencia de no inmunización fue del 7,8%, 3,7%, 16,1%, 2,7%, 54,4% y 13,1% para el sarampión, la rubeola, la parotiditis, la varicela, la hepatitis A y la hepatitis B respectivamente. El análisis ajustado mediante regresión logística mostró diferencias significativas en la prevalencia de no inmunización a sarampión en función de grupos de edad (ORa 11,8 y ORa 5,8) y área de desempeño (ORa 0,5), frente a parotiditis en función de grupos de edad (ORa 4,9 y ORa 3,6) y categoría profesional 1 (médicos, farmacéuticos, odontólogos y psicólogos) (ORa 0,6), frente a rubeola en función del sexo (ORa 4,6), frente a varicela en función de la clasificación del servicio (ORa 2,3), frente a hepatitis A en función de grupos de edad (ORa 1,9 y ORa 1,5) y sexo (ORa 1,2) y frente a hepatitis B en función de grupos de edad (ORa 0,3 y ORa 0,5), sexo (ORa 1,4), área de desempeño (ORa 0,3) y categorías profesionales 1 (médicos, farmacéuticos, odontólogos y psicólogos) (ORa 0,2), 2 (enfermería, fisioterapeutas, nutricionistas y optometristas) (ORa 0,2) y 3 (técnicos en cuidados auxiliares de enfermería y técnicos especialistas sanitarios) (ORa 0,3). Considerando el efecto del sexo, la edad, categoría profesional, servicio de riesgo y área de desempeño, se observó una asociación positiva entre sarampión-rubeola, sarampión-parotiditis y rubeola-parotiditis, y una asociación positiva débil entre hepatitis A-hepatitis B en la comparación de las categorías profesionales 2 (enfermería, fisioterapeutas, nutricionistas y optometristas) y 4 (otros grupos profesionales). Conclusiones: Es necesario potenciar la vacunación entre sanitarios, especialmente en aquellos que ejercen sus funciones en áreas de riesgo y entre el personal de menor edad. La vacunación debe promoverse dentro de políticas de seguridad laboral.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24841号 / 医博第5009号 / 新制||医||1068(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 朝長, 啓造, 教授 波多野, 悦朗, 教授 竹内, 理 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Hepatitis B virus (HBV) is a major etiologic agent of chronic liver disease (CLD) and hepatocellular carcinoma (HCC). The virally encoded X antigen, HBx, contributes importantly to the development of HCC through its trans-activating role in various signal transduction pathways. Pathways implicated in stem cell self-renewal also contribute to carcinogenesis. Thus, experiments were designed to test if HBx triggers malignant transformation by promoting properties that are characteristic of cancer stem cells (CSCs). To test this hypothesis, HBx expressing (HepG2X) and control (HepG2CAT) human cell lines were assayed for phenotypic and molecular characteristics of "stemness." Western blotting of protein extracts from HepG2X and HepG2CAT cells as well as immunohistochemical staining of HCC and adjacent liver tissue sections from HBV infected patients showed up-regulation of "stemness"-associated (EpCAM and beta-catenin) and "stemness" (Oct-4, Nanog, Klf-4) markers by HBx. Moreover, HBx stimulated cell migration and spheroid formation. HBx expression was also associated with depressed levels of E-cadherin and subsequent activation of beta-catenin and EpCAM. Results from ChIP-chip data performed previously in this lab suggest an associative link between HBx and the expression of epigenetic co-repressor, mSin3A, which is known to repress E-cadherin when complexed with histone deacetylases. Thus, experiments were also designed to test if HBx represses the E-cadherin gene (CDH1) through histone deacetylation by the mSin3A/HDAC complex. In HepG2X cells, decreased levels of E-cadherin and elevated levels of mSin3A were detected. Reciprocal immunoprecipitation with anti-HBx and anti-mSin3A demonstrated mutual binding. Further, HBx-mSin3A co-localization was showed by immunofluorescent staining. Chromatin immunoprecipitation revealed that HBx mediated the recruitment of the mSin3A/HDAC complex to the CDH1 promoter. HDAC inhibition by Trichostatin A treatment restored E-cadherin expression. Thus, HBx-associated epigenetic repression of E-cadherin and up-regulated expression of multiple "stemness" markers support the hypothesis that HBx contributes to hepatocarcinogenesis, at least in part, by promoting changes in gene expression that are characteristic of CSCs. This work is the first to propose that HBV promotes "stemness" in the pathogenesis of HCC. / Biology