Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2005. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 3 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Göteborg : Univ., 2009. / Härtill 4 uppsatser.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2-like (PLA2s-like) estão entre os principais componentes de peçonhas de serpentes envolvidas no processo de envenenamento, particularmente em serpentes do gênero Bothrops. Essas toxinas promovem efeitos miotóxicos que não são neutralizados pela soroterapia convencional e podem levar até a perda do membro afetado. Os estudos estruturais, em especial a técnica de cristalografia, são uma ferramenta poderosa na compreensão da relação estrutura-função de moléculas. O presente trabalho teve por objetivo estudar estruturalmente por diferentes técnicas biofísicas (dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, Espectroscopia de fluorescência, termoforese de microescala, cristalização, coleta de dados de difração de raios-X, elucidação e análise estrutural) uma Lys-49-PLA2 da peçonha de Bothrops pauloensis, denominada BnSP-7, em suas formas nativa e complexadas com o ácido cinâmico e seus derivados, ácido cafeico e ácido p-cumárico. Adicionalmente, a mesma proteína foi estudada em sua forma recombinante. A ORF referente à BnSP-7 foi inserida no vetor a partir dos sítios de restrição EcoRI (3’ DNA) e NotI (5’ DNA). Esse inserto foi inserido em um vetor pPicZA, transformado em Pichia pastoris e induzida a expressão. Após purificação da proteína expressa, foram realizados ensaios de cristalização. Nas estruturas da BnSP-7 obtida a partir do veneno de B. pauloensis, foram encontrados ligantes na região MDoS nos três complexos elucidados, bem como a análise dos túnei... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

MEDEIROS, Suelen Carneiro de. Expressão heteróloga de uma glicosil hidrolase da Família 18 (cv2736) de Chromobacterium violaceum em Pichia pastoris com potencial antibacteriano. 2012. 122 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-11T13:31:54Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:21:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:21:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) Previous issue date: 2012 / Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a polysaccharide composed of units of N-acetyl-D- glucosamine, which is abundant in nature. The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472 has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism of medical importance. To this purpose, the full ORF (encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736 PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41. 3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiff’s reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed higher chitinase activity than that found for th e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium of induced cells, was active after heat treatment at 50 °C and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl -β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8 barrel (also known as TIM barrel), which is typical of the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition of this microorganism in the assay. These results suggest that rCV2736 should be further studied as a new anti-bacterial agent. / Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarídeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que é extremamente abundante na natureza. Após o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteínas com potencial biotecnológico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteína CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em células de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importância médica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteína truncada, sem um possível peptídeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressão pPICZαA, para expressão em P. pastoris KM71H. A proteína completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fração proteica, contendo as proteínas secretadas para o meio de cultura, por células de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressão recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogênea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo três bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoácidos. Após coloração com reagente de Schiff para revelação de glicoproteínas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. Além disso, rCV2736PS+ teve seus peptídeos identificados por espectrometria de massas, na fração F0/95 do meio de cultura livre de células. A proteína recombinante produzida sem os 22 aminoácidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinásica maior que a encontrada para a fração contendo rCV2736PS+, apesar de não ter sido detectada por SDS-PAGE. A fração F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestável até 50°C e com pico de atividade quitinolítica em pH 3,0. A mesma fração apresentou maior atividade endoquitinásica e ativa contra os substratos sintéticos 4-nitrofenil N,N’–diacetil-β-D-quitobiosídeo e 4-nitrofenil N,N’,N’’–triacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), típico das proteínas da família GH18. Do mesmo modo, a fração F0/95 foi testada contra seis espécies de bactérias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fração foi testada contra a levedura Candida albicans, mas não foi detectada inibição do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteína recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molécula com potencial antibacteriano. Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; Expressão heteróloga.

CORREIA, Tuana Oliveira. Quitinase de Classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata): Estudo preliminar da expressão do gene, clonagem, expressão e purificação em Escherichia coli BL21(λ)DE3 e determinação da estrutura através da modelagem por homologia. 2007. 90 f.Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T14:28:51Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) Previous issue date: 2007 / In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three­ dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RT­PCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81D­1053 (resistant) e TE97­419­07F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CE­31(resistant) e TE97­411­1F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RT­PCR with IT81D­1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDS­PAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijão­ de­ corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future. / No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressão de um gene de quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressão desse gene em células de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinação via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteína. A expressão do gene da quitinase de classe I de feijão-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. Nessas reações, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estágios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetível). A expressão foi avaliada também em folhas, raízes, epicótilo e hipocótilo de dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo nematóide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetível). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genômico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqüenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressão da proteína recombinante foi induzida na presença de IPTG 1mM. A proteína recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada através de um SDS-PAGE. A proteína purificada através de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com Níquel imobilizado não apresentou atividade quitinásica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios ativos das moléculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijão-de-corda parece apresentar expressão constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutações pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína, o que ainda deve ser elucidado no futuro.

NASCIMENTO, Camila Tauane Monteiro do. Expressão heteróloga de uma osmotina laticífera e desenvolvimento de protocolos para extração da proteína recombinante a partir de corpos de inclusão. 2016. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T15:11:48Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) Previous issue date: 2016 / In the previous step to this work, a protein identified as osmotin (CpOsm) was purified from Calotropis procera latex which showed strong antifungal activity. The protein was expressed in prokaryotic and eukaryotic systems, but a suitable protocol for purification has not been achieved. In the present work, from inclusion bodies (IB) obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) proceeded to a survey by different solubilization protocols of proteins in an attempt to obtain the recombinant protein (rCpOsm) soluble, and then evaluates it as its activity and finally, exploring new methods for purification. The bacterial culture was induced at different conditions of temperature and time of induction. IB were subjected to chemical treatments with surfactants (CTAB; Cetrimide; ARG-12, a derivative surfactant Argenine) and a denaturing agent (guanidine hydrochloride); physical treatment by sonication and the enzymatic treatment with protease native C. procera latex. Electrophoresis assays suggested that two chemical surfactants were effective in solubilizing rCpOsm while not ARG-12. Although these cationic compounds solubilized rCpOsm more than other proteins of IB, while the sonication process samples produced with a greater variety of soluble proteins including rCpOsm. The enzymatic treatment showed that IB proteins are, in some range, digested while rCpOsm did not. All samples were evaluated for action on Colletotrichum gloeosporiodes after dialysis and lyophilization and showed inhibitory activity of spore germination and mycelial growth. However, it was shown that the activity could be related to the solubilising agents. Insoluble proteins obtained from E. coli containing the plasmid integrity, taken as a negative control showed no activity in these assays. The rCpOsm solubilized by CTAB was subjected to chromatography on Ni ++ column (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7.0; in hydrophobic media (FenilSepharose CL-4B) and ion exchange (Resource-S). None of the applied protocols resulted in the purification of rCpOsm and these data repeated what was observed previously for rCpOsm purified from Pichia pastoris. / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteína identificada como osmotina (CpOsm) foi purificada do látex de Calotropis procera a qual apresentou forte atividade antifúngica. A proteína foi expressa em sistemas procarionte e eucarionte, mas um protocolo adequado para sua purificação não foi alcançado. No presente trabalho, partindo de corpos de inclusão (CI), obtidos de E. coli BL21(DE3) procedeu-se uma prospecção por diferentes protocolos de solubilização de suas proteínas, na tentativa de obter a proteína recombinante (rCpOsm) solúvel, para então avaliá-la quanto a sua atividade e por fim, prospectar novos métodos para sua purificação. A cultura bacteriana foi induzida em diferentes condições de temperatura e tempo de indução. Após 3 horas de indução a 37 °C, 180 rpm, os CI foram lisados e submetidos a tratamentos químicos com surfactantes (CTAB; Cetrimida; ARG-12: um surfactante derivado de argenina) e um agente desnaturante (Cloridrato de Guanidina); tratamento físico por sonicação (4 ciclos de 2,5 min. cada a 50% de potência) e tratamento enzimático com protease nativa do látex de C. procera. Ensaios de eletroforese sugeriram que os dois surfactantes químicos foram eficientes na solubilização de rCpOsm enquanto que ARG-12 não. Ainda, estes compostos catiônicos solubilizaram rCpOsm mais do que as demais proteínas dos CI, enquanto que o processo de sonicação produziu amostras com maior diversidade de proteínas solúveis, incluindo rCpOsm. O tratamento enzimático mostrou que proteínas de CI são, em algum alcance, digeridas enquanto que rCpOsm não. O efeito do tratamento dos CI com protease foi analisado por imagens de microscopia de força atômica e as diferenças de estrutura entre os CI tratados e não tratados documentados. Todas as amostras foram avaliadas quanto à ação sobre Colletotrichum gloeosporiodes após diálise e liofilização. Os produtos dos tratamentos com surfactantes apresentaram atividade antifúngica, demonstrando atividade inibitória de germinação de esporos e crescimento micelial. Entretanto, foi demonstrado que a atividade poderia estar relacionada aos agentes solubilizantes. Proteínas insolúveis obtidas de E. coli contendo o plasmídeo íntegro, tomadas como controle negativo, não apresentaram atividade nestes ensaios. A rCpOsm solubilizada com CTAB foi submetida a cromatografia em coluna de Ni++ (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7,0; em meio hidrofóbico (FenilSepharose CL-4B) e troca iônica (Resource-S). Nenhum dos protocolos aplicados resultou na purificação de rCpOsm e estes dados repetem o que foi observado previamente para a rCpOsm purificada a partir de Pichia pastoris.