A cola de fibrina tem sido utilizada em diferentes procedimentos cirúrgicos como agente hemostático, selante e de suporte adesivo. No entanto, seu emprego na Veterinária ainda é limitado devido à falta de formulações não dependentes dos componentes de origem humana e de validação baseada em necessidades e condições cirúrgicas de animais. Objetivou-se avaliar a viabilidade da produção de cola de fibrina canina com fibrinogênio obtido por crioprecipitação (crio) e precipitação por protamina a partir de fontes plasmáticas mais disponíveis em bancos de sangue e centros hospitalares. Quatro categorias de plasma pobre em plaquetas foram utilizadas: plasma fresco (FR), congelado dentro de oito horas da colheita e processado em menos de uma semana após congelamento; plasma fresco congelado (FFP), com armazenamento inferior a um ano; plasma fresco congelado que ultrapassou um ano de armazenamento (eFFP), e plasma congelado com período entre colheita e congelamento maior que oito horas e de armazenamento superior a um ano (FP). No estudo in vitro de cada técnica, avaliou-se a concentração de fibrinogênio precipitado por meio do método de Clauss, as propriedades reológicas do gel por tromboelastografia (TEG) e as características estruturais do coágulo por microscopia eletrônica de varredura (SEM). O estudo in vivo consistiu da avaliação da praticidade de aplicação e das propriedades hemostáticas e adesivas das colas de fibrina resultantes em fígado e intestino de coelho (Oryctolagus cuniculus). Em avaliação prévia do protocolo de crio quanto ao uso de bolsas ou tubos, o aproveitamento do material inicial não diferiu, mas os tubos se mostraram mais simples, rápidos e homogêneos para o processamento, além de permitirem aumento da concentração final. O protocolo crio em comparação ao de protamina foi superior na precipitação de fibrinogênio coagulável nas avaliações de Clauss e TEG. Os coágulos formados se mostraram semelhantes entre os dois protocolos na SEM, no modelo de hemostasia hepática e na adesão à serosa intestinal. O uso de aprotinina com o protocolo de protamina não prejudicou a aplicação da cola sobre o intestino. Na crio, plasmas com maior tempo de armazenamento (eFFP, FP) se mostraram significativamente superiores aos mais frescos (FFP, FR) nas análises por Clauss e TEG. Não foi possível identificar diferenças estatísticas entre os tipos de plasma no protocolo protamina em nenhum dos parâmetros avaliados. Estudos adicionais e ajustes nos testes para avaliação de soluções concentradas são necessários para determinação do efeito dos protocolos e tempo de armazenamento do plasma congelado sobre o fibrinogênio precipitado e demais componentes plasmáticos na cola de fibrina. Adequações e pesquisas ainda são necessárias para aproveitamento da precipitação de fibrinogênio por protamina e a partir de plasma fresco com a finalidade de obtenção rápida de cola de fibrina. Bolsas de plasma menos requisitadas em bancos de sangue veterinários representam uma fonte importante de fibrinogênio para a produção de cola de fibrina canina em centros hospitalares apropriadamente equipados, viabilizando seu uso em diferentes aplicações cirúrgicas e pesquisas relacionadas. / Fibrin glue (FG) has been widely used in surgery for hemostatic, adhesive, sealant, and would healing support. In veterinary surgery, however, its use has been hindered by lack of specie-specific formulations and validation of its properties and biological characteristics. This study evaluated methods of fibrinogen precipitation from canine plasma envisioning autologous and allogeneic FG production for surgical use. The efficacy of cryo and protamine fibrinogen precipitation methods in producing canine FG was assessed by analysis on feasibility of each protocol with most available canine plasma sources, rheological and structural characteristics of the resultant FG clot and the hemostatic and adhesive properties of FG during in vivo application. The plasma categories studied included fresh plasma (FR), obtained and frozen within 8 hours from blood collection and processed within a week; fresh frozen plasma (FFP), frozen within 8 hours from blood collection and stored for up to a year; expired fresh frozen plasma (eFFP), plasma frozen within 8 hours from blood collection but stored for more than a year; and, frozen plasma (FP), which was frozen after 8 hours from collection and stored for more than a year. Comparison of cryoprecipitation among plasma types was previously performed in both 120-mL bags and 50-mL tubes and analyzed by Clauss. Total precipitation capacity did not differ significantly between bags and tubes. Nevertheless, the processing was more easily and homogeneously performed in tubes and allowed tailoring the final concentration. Cryoprecipitation generated better results in Clauss and TEG in comparison to protamine protocol. The resultant fibrin glue clots of cryo- and protamine-precipitation showed similar ultrastructure in scanning electron microscopy (SEM) and performance in the in vivo evaluations with the rabbit hepatic and intestinal incision models. The use of aprotinin in the protamine clot seemed beneficial in the intestinal evaluation. With cryoprecipitation, eFFP and FP were superior to FFP in the assessments performed by Clauss and TEG. Fresh plasma performed poorly with cryoprecipitation. Significant differences were not detected among plasma categories processed with protamine precipitation in any of the assays performed. While cryoprecipitation was more reliable regarding homogeneity and capacity to increase final fibrinogen concentration, protamine protocol was faster and simpler considering the equipment required. Although, older plasma units generated significantly more cryoprecipitated and/or clottable fibrinogen, further studies are needed to validate the assays with such high concentrated solutions and to elucidate the effect of freezing storage on precipitation and clottability of fibrinogen intended for FG production. Adjustments on protamine protocol and improvements on fibrinogen precipitation from fresher plasma sources would support the use of autologous or allogeneic plasma for on-site production of canine FG. Veterinary hospitals, blood banks, and patients can benefit from usage of surplus plasma units for FG production aiming surgical and scientific needs.

Les peptides lasso sont des peptides bioactifs bactériens issus de la voie de biosynthèse ribosomale et subissant des modifications post-traductionnelles, caractérisés par une structure entrelacée dite en lasso. Ils possèdent un cycle macrolactame en position N-terminale, traversé par la queue C-terminale. Cette topologie de type rotaxane, maintenue par piégeage de la queue C-terminale dans le cycle via des acides aminés encombrant et/ou des ponts disulfure, confère à ces peptides une structure compacte et stable. Les actinobactéries recèlent la plus grande diversité et gamme d'activités biologiques parmi les peptides lasso (antibactériens, anti-VIH, antagonistes de récepteurs..), et l'exploration de génomes suggère une diversité encore plus grande, puisque certains clusters portent des gènes codant des enzymes de modifications post-traductionnelles jamais observées auparavant. Cependant, l'expression de ces peptides semble être rigoureusement contrôlée, rendant leur production en laboratoire difficile à partir de la bactérie productrice. Le rôle écologique et les mécanismes de régulation des peptides lasso ne sont pas très documentés. Leur compréhension permettrait d'améliorer la production et de mieux exploiter les activités biologiques des peptides lasso. / Lasso peptides are ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides produced by bacteria, characterized by a remarkable mechanically-interlocked structure. The lasso topology, reminiscent to a rotaxane, consists in an N-terminal macrolactam ring threaded by a C-terminal tail. This compact and stable structure is stabilized by steric entrapping of the tail in the ring, through bulky amino acid(s) and/or disulphide bonds. Lasso peptides produced by Actinobacteria display the greatest chemical diversity and a range of biological activities (antibacterial, anti-HIV, receptor antagonist…), therefore are of high pharmaceutical interest. Genome mining revealed that Actinobacteria have enormous potential to biosynthesize novel lasso peptides, e.g. harbouring new post-translational modifications. However, the expression of these peptides is generally controlled by complex regulatory systems, making their production under laboratory conditions difficult. Understanding the ecological role and regulation mechanisms of lasso peptides would help to improve production and better exploit the biotechnological potential of these molecules. The first part of my work deals with the identification of new lasso peptides from Actinobacteria, using heterologous expression in Streptomyces hosts. The second part of my work deals with the regulation mechanism and ecological role of lasso peptides using sviceucin, a lasso peptide produced by Streptomyces sviceus, as the model for study.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-21Bitstream added on 2014-06-13T19:20:06Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_ts_dr_araca.pdf: 439179 bytes, checksum: 176184a10c13e6ef36390b6f5b61b9de (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Proposição: Avaliar a resposta tecidual ao enxerto xenógeno inorgânico de osso bovino, por meio de análise histomorfológica e histomorfométrica. Material e método: O enxerto foi obtido da costela de boi resfriada após 8 horas de sacrifício do animal e processado da seguinte maneira: imersão por 60 minutos em água oxigenada a temperatura ambiente, com trocas a cada 15 minutos; imersão em água oxigenada aquecida, a uma temperatura de 100ºC, por 30 segundos e resfriamento imediato com água destilada a uma temperatura variando de 6º a 8ºC; enxague em água destilada corrente por 6 horas; imersão em álcool 70º, 90º e 100º, respectivamente, sendo 15 minutos em cada álcool; esterilização em autoclave. Em seguida, 10 coelhos brancos (Nova Zelândia) foram utilizados, originando dois grupos: Grupo I – enxerto inserido no pavilhão auricular e Grupo II – enxerto inserido e fixado em tíbia. Decorridos 180 dias, foi realizado sacrifício dos animais por injeção excessiva de anestésico. Resultados: No Grupo I, o enxerto apresentou-se em íntimo contato com tecido subcutâneo. No Grupo II, o enxerto apresentou-se em justaposição com o leito ósseo receptor. E nos dois grupos havia espaços medulares preenchidos por medula óssea ativa e osso neoformado, além da ausência de osteócitos no osso bovino e presença destas células no osso neoformado, próximo aos espaços medulares. Conclusão: Em razão dos resultados obtidos o enxerto xenógeno inorgânico de osso bovino demonstrou biocompatibilidade, capacidade osteocondutora e discreta perda de volume, preenchendo requisitos importantes do material ideal para reconstrução óssea. / Objective: To evaluate tissue response to inorganic bovine bone xenograft by histomorphological and histomorphometrical analyses. Material and methods: The bone grafts was obtained from cooled bovine rib 8 hours after slaughtering and were processed as follows: 60-minute immersion in hydrogen peroxide at room temperature, with changes at 15-minute intervals; 30-second immersion in hydrogen peroxide at 100ºC; immediate cooling with distilled water at temperatures ranging from 6º to 8ºC; rinsing in running distilled water for 6 hours; immersion in alcohol grades of 70º, 90º and 100ºGL (15-minute in each solution); autoclaving. Thereafter, 10 white New Zealand rabbits were distributed into two groups: Group I – graft inserted in the ear pavilion and Group II – graft inserted and fixed in the tibia. After 180 days, the animals were sacrificed by anesthetic overdose. Results: In Group I, the graft was in intimate contact with the subcutaneous tissue, while in Group II the graft was juxtaposed to the recipient site. Both groups presented medullar spaces filled with active bone marrow and newly formed bone. In addition, osteocytes were absent in the bovine bone graft and present in the newly formed bone, close to the medullar spaces. Conclusion: From the obtained results, the inorganic bovine bone xenograft showed biocompatibility.

Submitted by LINO FERNANDO GOMES DE LIMA (linofernando@ibb.unesp.br) on 2017-10-12T13:07:03Z No. of bitstreams: 1 TESE_DOUTORADO_LINO_FINAL_CORREÇÕES_BANCA.pdf: 7596280 bytes, checksum: daa6099c657cb8875c1dc696f2b54217 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-10-18T16:34:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lima_lfg_dr_bot.pdf: 7596280 bytes, checksum: daa6099c657cb8875c1dc696f2b54217 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T16:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lima_lfg_dr_bot.pdf: 7596280 bytes, checksum: daa6099c657cb8875c1dc696f2b54217 (MD5) Previous issue date: 2017-08-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As fosfolipases A2-like (PLA2s-like) estão entre os principais componentes de peçonhas de serpentes envolvidas no processo de envenenamento, particularmente em serpentes do gênero Bothrops. Essas toxinas promovem efeitos miotóxicos que não são neutralizados pela soroterapia convencional e podem levar até a perda do membro afetado. Os estudos estruturais, em especial a técnica de cristalografia, são uma ferramenta poderosa na compreensão da relação estrutura-função de moléculas. O presente trabalho teve por objetivo estudar estruturalmente por diferentes técnicas biofísicas (dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, Espectroscopia de fluorescência, termoforese de microescala, cristalização, coleta de dados de difração de raios-X, elucidação e análise estrutural) uma Lys-49-PLA2 da peçonha de Bothrops pauloensis, denominada BnSP-7, em suas formas nativa e complexadas com o ácido cinâmico e seus derivados, ácido cafeico e ácido p-cumárico. Adicionalmente, a mesma proteína foi estudada em sua forma recombinante. A ORF referente à BnSP-7 foi inserida no vetor a partir dos sítios de restrição EcoRI (3’ DNA) e NotI (5’ DNA). Esse inserto foi inserido em um vetor pPicZA, transformado em Pichia pastoris e induzida a expressão. Após purificação da proteína expressa, foram realizados ensaios de cristalização. Nas estruturas da BnSP-7 obtida a partir do veneno de B. pauloensis, foram encontrados ligantes na região MDoS nos três complexos elucidados, bem como a análise dos túneis revelou diferenças nas cargas positivas da BnSP-7 em comparação com outras miotoxinas. Os experimentos de termoferese revelaram que os três ligantes se ligaram à BnSP-7 com afinidades variando de 20-300 µM, sendo que a maior afinidade foi observada para o ácido cafeico, seguido pelo ácido p-cumárico e pelo ácido cinâmico. Estes dados estão de acordo com o número de interações eletrostáticas observadas nas estruturas cristalográficas. Esses resultados reforçam a importância da região MDoS no mecanismo de ação miotóxica dessas proteínas, além de fornecer dados estruturais para o desenvolvimento de inibidores mais efetivos contra os efeitos locais do acidente ofídico, não eficientemente tratado pela soroterapia convencional. / Phospholipases A2-like (PLA2-like) toxins are among the main components of snake venoms involved in the envenomation process, particularly in snakes from Bothrops genus. These toxins promote myotoxic effects that aren't neutralized by conventional serum therapy and may lead to loss of the affected limb. Structural studies, especially the crystallography technique, are powerful tools for understanding of the structure-function relationship of molecules. The aim of this work was structurally study by different biophysical techniques (circular dichroism, dynamic light scattering, fluorescence spectroscopy, microscale thermophoresis, crystallization, X-ray diffraction data, elucidation and structural analysis) a Lys-49-PLA2 of Bothrops pauloensis venom, named BnSP-7, in native form and complexed to cinnamic acid and its derivatives caffeic acid and p-coumaric acid. BnSP-7 ORF was inserted into the vector EcoRI (3 'DNA) and NotI (5' DNA) restriction sites. This insert was inserted into pPicZA vector, transformed into Pichia pastoris and induced the expression. After purification of the expressed protein, crystallization assays were performed. BnSP-7 structures complexed to the ligands were performed using B. pauloensis venom which these molecules were found interacting to MDoS region for the three complexes. Furthermore, tunnel analyses revealed differences in the positive charges of BnSP-7 compared to other myotoxins which may be related to the specificity of this toxin. Thermophesis experiments revealed that all three ligands bound to BnSP-7 with affinities ranging from 20-300 μM, in which the highest affinity was observed for caffeic acid, followed by the p-coumaric acid and by cinnamic acid. These data are in agreement with the observed number of electrostatic interactions observed in crystallographic structures. These results consolidate the importance of the MDoS region as a mechanism of myotoxic action of these proteins, in addition to providing structural data for the more effective inhibitors development against the local effects of the snakebite, not efficiently neutralized by conventional serum therapy. / CNPq: 140501/2014-2

A cola de fibrina tem sido utilizada em diferentes procedimentos cirúrgicos como agente hemostático, selante e de suporte adesivo. No entanto, seu emprego na Veterinária ainda é limitado devido à falta de formulações não dependentes dos componentes de origem humana e de validação baseada em necessidades e condições cirúrgicas de animais. Objetivou-se avaliar a viabilidade da produção de cola de fibrina canina com fibrinogênio obtido por crioprecipitação (crio) e precipitação por protamina a partir de fontes plasmáticas mais disponíveis em bancos de sangue e centros hospitalares. Quatro categorias de plasma pobre em plaquetas foram utilizadas: plasma fresco (FR), congelado dentro de oito horas da colheita e processado em menos de uma semana após congelamento; plasma fresco congelado (FFP), com armazenamento inferior a um ano; plasma fresco congelado que ultrapassou um ano de armazenamento (eFFP), e plasma congelado com período entre colheita e congelamento maior que oito horas e de armazenamento superior a um ano (FP). No estudo in vitro de cada técnica, avaliou-se a concentração de fibrinogênio precipitado por meio do método de Clauss, as propriedades reológicas do gel por tromboelastografia (TEG) e as características estruturais do coágulo por microscopia eletrônica de varredura (SEM). O estudo in vivo consistiu da avaliação da praticidade de aplicação e das propriedades hemostáticas e adesivas das colas de fibrina resultantes em fígado e intestino de coelho (Oryctolagus cuniculus). Em avaliação prévia do protocolo de crio quanto ao uso de bolsas ou tubos, o aproveitamento do material inicial não diferiu, mas os tubos se mostraram mais simples, rápidos e homogêneos para o processamento, além de permitirem aumento da concentração final. O protocolo crio em comparação ao de protamina foi superior na precipitação de fibrinogênio coagulável nas avaliações de Clauss e TEG. Os coágulos formados se mostraram semelhantes entre os dois protocolos na SEM, no modelo de hemostasia hepática e na adesão à serosa intestinal. O uso de aprotinina com o protocolo de protamina não prejudicou a aplicação da cola sobre o intestino. Na crio, plasmas com maior tempo de armazenamento (eFFP, FP) se mostraram significativamente superiores aos mais frescos (FFP, FR) nas análises por Clauss e TEG. Não foi possível identificar diferenças estatísticas entre os tipos de plasma no protocolo protamina em nenhum dos parâmetros avaliados. Estudos adicionais e ajustes nos testes para avaliação de soluções concentradas são necessários para determinação do efeito dos protocolos e tempo de armazenamento do plasma congelado sobre o fibrinogênio precipitado e demais componentes plasmáticos na cola de fibrina. Adequações e pesquisas ainda são necessárias para aproveitamento da precipitação de fibrinogênio por protamina e a partir de plasma fresco com a finalidade de obtenção rápida de cola de fibrina. Bolsas de plasma menos requisitadas em bancos de sangue veterinários representam uma fonte importante de fibrinogênio para a produção de cola de fibrina canina em centros hospitalares apropriadamente equipados, viabilizando seu uso em diferentes aplicações cirúrgicas e pesquisas relacionadas. / Fibrin glue (FG) has been widely used in surgery for hemostatic, adhesive, sealant, and would healing support. In veterinary surgery, however, its use has been hindered by lack of specie-specific formulations and validation of its properties and biological characteristics. This study evaluated methods of fibrinogen precipitation from canine plasma envisioning autologous and allogeneic FG production for surgical use. The efficacy of cryo and protamine fibrinogen precipitation methods in producing canine FG was assessed by analysis on feasibility of each protocol with most available canine plasma sources, rheological and structural characteristics of the resultant FG clot and the hemostatic and adhesive properties of FG during in vivo application. The plasma categories studied included fresh plasma (FR), obtained and frozen within 8 hours from blood collection and processed within a week; fresh frozen plasma (FFP), frozen within 8 hours from blood collection and stored for up to a year; expired fresh frozen plasma (eFFP), plasma frozen within 8 hours from blood collection but stored for more than a year; and, frozen plasma (FP), which was frozen after 8 hours from collection and stored for more than a year. Comparison of cryoprecipitation among plasma types was previously performed in both 120-mL bags and 50-mL tubes and analyzed by Clauss. Total precipitation capacity did not differ significantly between bags and tubes. Nevertheless, the processing was more easily and homogeneously performed in tubes and allowed tailoring the final concentration. Cryoprecipitation generated better results in Clauss and TEG in comparison to protamine protocol. The resultant fibrin glue clots of cryo- and protamine-precipitation showed similar ultrastructure in scanning electron microscopy (SEM) and performance in the in vivo evaluations with the rabbit hepatic and intestinal incision models. The use of aprotinin in the protamine clot seemed beneficial in the intestinal evaluation. With cryoprecipitation, eFFP and FP were superior to FFP in the assessments performed by Clauss and TEG. Fresh plasma performed poorly with cryoprecipitation. Significant differences were not detected among plasma categories processed with protamine precipitation in any of the assays performed. While cryoprecipitation was more reliable regarding homogeneity and capacity to increase final fibrinogen concentration, protamine protocol was faster and simpler considering the equipment required. Although, older plasma units generated significantly more cryoprecipitated and/or clottable fibrinogen, further studies are needed to validate the assays with such high concentrated solutions and to elucidate the effect of freezing storage on precipitation and clottability of fibrinogen intended for FG production. Adjustments on protamine protocol and improvements on fibrinogen precipitation from fresher plasma sources would support the use of autologous or allogeneic plasma for on-site production of canine FG. Veterinary hospitals, blood banks, and patients can benefit from usage of surplus plasma units for FG production aiming surgical and scientific needs.

Proteínas Inativadoras de Ribossomos (RIPs) são rRNA N-glicosilases capazes de inibir a síntese protéica pela remoção de uma adenina específica do RNA ribossomal. São geralmente classificadas em tipo 1 e tipo 2, sendo as últimas divididas em altamente tóxicas e não tóxicas. A maior parte das RIPs tipo 2 identificadas pertence a espécies de dicotiledôneas, como é o caso da pulchellina. As cadeias tóxicas das RIPs possuem uma região C-terminal hidrofóbica conservada, a qual se atribui a capacidade de interação com a membrana do retículo endoplasmático (RE), durante o transporte retrógrado da toxina para o citosol. Neste trabalho duas abordagens diferentes foram aplicadas para o estudo das RIPs tipo 2: identificação e caracterização de novos integrantes desta família de proteínas, e investigação da interação da cadeia-A da pulchellina (PAC) com sistemas miméticos da membrana celular. Na primeira abordagem, uma busca in silico em bancos de dados genéticos públicos permitiu identificar quatro novas RIPs do tipo 2 de monocotiledôneas. A análise da estrutura primária das proteínas identificadas mostrou a ocorrência de mutações em alguns dos principais aminoácidos que formam o sítio ativo nas RIPs, indicando uma possível perda de função. O representante de Saccharum officinarum (cana-de-açúcar) foi então analisado em maior detalhe, sendo sua cadeia-A clonada (soRIPA), expressa em sistema heterólogo e caracterizada em termos de atividade e estrutura secundária. Os ensaios in vitro mostraram que a soRIPA não foi capaz de depurinar ribossomos eucariotos. Porém, os ensaios de inibição da síntese proteica mostraram uma possível atividade inibitória da soRIP, que precisa ainda ser confirmada. A presença dos transcritos no banco do SUCEST sugere que estes genes não sejam pseudogenes, embora não tenha sido possível purificar a proteína a partir de extratos de folhas. Isto indica que se a soRIP está sendo traduzida, deve sofrer um rápido turnover, tornando difícil a sua detecção e purificação ou, ainda, que a ausência de sítios de ligação à galactose funcionais na cadeia-B impediu sua purificação por cromatografia de afinidade à galactose. A outra abordagem no estudo das RIPs tipo 2 foi centrada na cadeia-A recombinante da pulchellina (rPAC), estudando sua interação com monocamadas de Langmuir. Foram construídos 3 mutantes da rPAC, cada um com diferentes deleções na região C-terminal visando determinar a região responsável pela interação com a membrana do RE. A cinética de adsorção e pressão superficial exercida pela rPAC sobre a monocamada, assim como o estudo com os mutantes demontraram que a proteína interage fortemente com a monocamada fosfolipídica e que esta interação in vitro é dependente da presença da região C-terminal. De forma geral, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram com novas informações sobre esta família de proteínas, identificando e analisando novos integrantes e, ainda, adicionando detalhes do mecanismo funcional do tráfego das toxinas RIPs. / Ribosome Inactivating Proteins (RIPs) are rRNA N-glycosilases which are able to inhibit the protein synthesis by removing a specific adenine from the ribosomal RNA. They are usually classified as type 1 and type 2, being the latter divided into highly toxic and nontoxic. The majority of type 2 RIPs currently identified are found in species of dicotyledons, as the pulchellin. The toxic chain of RIPs has a conserved hydrophobic C-terminal region, which is believed to be responsible for the interaction with the lipid membrane of the endoplasmic reticulum ER during the retrograde transport of the toxin to the cytosol. In this work, two different approaches were applied in the study of type 2 RIPs: identification and characterization of new members of this protein family, and investigation of the interaction of the pulchellin\'s A-chain (PAC) with systems that mimic the cellular membrane. In the first approach, an in silico search in public genetic databases was performed and allowed us to identify four new type 2 RIPs in monocots. The primary structure analysis of the identified proteins showed the presence of mutations in key amino acids that form the active site of RIPs, indicating a possible interference on its catalytic activity. The representative of Saccharum officinarum (sugar cane) was then analyzed in greater detail. Its A-chain clone (soRIPA) was expressed in a heterologous system and characterized in terms of activity and secondary structure. In vitro experiments showed that soRIPA was not able to perform the depurination of eukaryotic ribosomes. However, the inhibition of protein synthesis assays presented a possible low inhibitory activity of the soRIP, which still needs to be further investigated. The presence of transcripts on the bank of SUCEST indicates that these genes are not pseudogenes, although it was not possible to purify the protein from leaf extracts. If the soRIP is being translated, this may indicate that it undergoes a quick turnover, preventing its detection and purification. It is also possible that the absence of functional galactose binding sites in the B-chain has prevented its purification by galactose affinity chromatography. Our second approach to the study of type 2 RIPs was focused on the recombinant pulchellin A-chain (rPAC), by investigating its interaction with Langmuir monolayers. We have constructed three mutants of rPAC, each one with different deletions at the C-terminal to determine the region responsible for interaction with the membrane of the ER. The adsorption kinetic and surface pressure applied by rPAC on the monolayer, as well as the study of the mutants, have demonstrated that the protein has a strong interaction with the phospholipid monolayer and that this interaction in vitro is dependent on the presence of the C-terminal. The results of this work have provided new information about the type 2 RIP protein family, identifying and analyzing new members, and also bringing new details about the functional mechanism of the RIP\'s toxin traffic.

O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma das micoses sistêmicas humanas mais prevalentes na América Latina. Componentes da cadeia respiratória mitocondrial são potenciais alvos quimioterapêuticos. Nesse sentido, em nosso trabalho demonstramos diferenças entre a cadeia respiratória do fungo P. brasiliensis e do hospedeiro mamífero. A respiração, potencial de membrana e fosforilação oxidativa mitocondrial de esferoplastos de P. brasiliensis foram avaliados in situ, os quais demonstraram a presença de uma cadeia respiratória funcional. A adição de ADP induziu a transição da respiração do estado de repouso para o fosforilativo, em esferoplastos energizados com succinato, NADH, NAD+ e substratos ligados ao complex I. A presença de uma NADH-ubiquinona oxidoredutase foi demonstrada pela capacidade das células oxidarem NADH exógeno, assim como, pela respiração insensível a rotenona e sensível a flavona. Além disso, a respiração mantida por NAD+ foi sensível a rotenona e flavona, sugerindo que vias metabólicas citosolicas contribuem para a produção de NADH e substratos ligados ao complexo I. Foi demonstrado também que os níveis de expressão do complexo I e da NADH desidrogenase alternativa alternam-se durante a curva de crescimento de leveduras de P. brasiliensis. A respiração induzida por NADH ou succinato foi parcialmente inibida por KCN ou antimicina A e sensível à inibição por BHAM, indicando a presença de uma oxidase alternativa. A fim de se caracterizar esta enzima oxidase alternativa, o seu gene foi clonado e expressado em xii S. cerevisiae e E. coli, o qual conferiu uma respiração resistente a cianeto e sensível a BHAM. S. cerevisiae expressando oxidase alternativa mostraram uma menor taxa de multiplicação celular e diminuição na geração de EROs. Nós também observamos que inibidores da cadeia transportadora de elétrons retardaram a transição de micélio para levedura em culturas de P. brasiliensis. Além disso, estes inibidores e outras drogas geradoras de EROs aumentaram a expressão do gene da oxidase alternativa, assim como a produção de EROs em leveduras de P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis, a thermically dimorphic fungus, is the etiological agent of endemic paracoccidioidomycosis, one of the most prevalent human systemic mycosis in Latin America. Components of the respiratory chain constitute potential pharmacological targets, and here are reported differences between the respiratory chain of the mammalian host and the fungus P. brasiliensis. Respiration, membrane potential and oxidative phosphorylation of mitochondria from P. brasiliensis spheroplasts were evaluated in situ, which demonstrated the existence of a functional respiratory chain. Adenosine 5\'-diphosphate (ADP) induced a transition from resting to phosphorylating respiration in mitochondria energized by succinate, NADH, NAD+ and complex I linked substrates. The presence of an alternative NADH-ubiquinone oxidoreductase was indicated by: the ability of the fungus to oxidize exogenous NADH; the insensitivity substrate-supported respiration to rotenone and sensitivity of this respiration to flavone. In addition, the sensitivity of NAD+-supported respiration to rotenone and flavone suggest that citosolic pathways contribute to NADH and complex I linked substrates production. Moreover, it was demonstrated that expression levels of complex I and alternative NADH dehydrogenase change during P. brasiliensis growth curve. The partial sensitivity of NADH or succinate-supported respiration to antimycin A and cyanide, as well as the sensitivity to BHAM, indicates the presence of an alternative oxidase. Therefore, to characterize the alternative oxidase its gene was cloned and heterologously xii expressed in S. cerevisiae and E. coli, wich confered, a cyanide resistant respiration and BHAM sensitivity. Moreover, S. cerevisiae that expressed alternative oxidase showed slower growth rate and decreased ROS generation. We also observed that electron transport pathways inhibitors delayed the P. brasiliensis mycelium to yeast transition in cultures. Besides, these inhibitors and other ROS generated drugs increase the ROS production and altenative oxidase expression.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In the previous step to this work, a protein identified as osmotin (CpOsm) was purified from Calotropis procera latex which showed strong antifungal activity. The protein was expressed in prokaryotic and eukaryotic systems, but a suitable protocol for purification has not been achieved. In the present work, from inclusion bodies (IB) obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) proceeded to a survey by different solubilization protocols of proteins in an attempt to obtain the recombinant protein (rCpOsm) soluble, and then evaluates it as its activity and finally, exploring new methods for purification. The bacterial culture was induced at different conditions of temperature and time of induction. IB were subjected to chemical treatments with surfactants (CTAB; Cetrimide; ARG-12, a derivative surfactant Argenine) and a denaturing agent (guanidine hydrochloride); physical treatment by sonication and the enzymatic treatment with protease native C. procera latex. Electrophoresis assays suggested that two chemical surfactants were effective in solubilizing rCpOsm while not ARG-12. Although these cationic compounds solubilized rCpOsm more than other proteins of IB, while the sonication process samples produced with a greater variety of soluble proteins including rCpOsm. The enzymatic treatment showed that IB proteins are, in some range, digested while rCpOsm did not. All samples were evaluated for action on Colletotrichum gloeosporiodes after dialysis and lyophilization and showed inhibitory activity of spore germination and mycelial growth. However, it was shown that the activity could be related to the solubilising agents. Insoluble proteins obtained from E. coli containing the plasmid integrity, taken as a negative control showed no activity in these assays. The rCpOsm solubilized by CTAB was subjected to chromatography on Ni ++ column (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7.0; in hydrophobic media (FenilSepharose CL-4B) and ion exchange (Resource-S). None of the applied protocols resulted in the purification of rCpOsm and these data repeated what was observed previously for rCpOsm purified from Pichia pastoris. / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteÃna identificada como osmotina (CpOsm) foi purificada do lÃtex de Calotropis procera a qual apresentou forte atividade antifÃngica. A proteÃna foi expressa em sistemas procarionte e eucarionte, mas um protocolo adequado para sua purificaÃÃo nÃo foi alcanÃado. No presente trabalho, partindo de corpos de inclusÃo (CI), obtidos de E. coli BL21(DE3) procedeu-se uma prospecÃÃo por diferentes protocolos de solubilizaÃÃo de suas proteÃnas, na tentativa de obter a proteÃna recombinante (rCpOsm) solÃvel, para entÃo avaliÃ-la quanto a sua atividade e por fim, prospectar novos mÃtodos para sua purificaÃÃo. A cultura bacteriana foi induzida em diferentes condiÃÃes de temperatura e tempo de induÃÃo. ApÃs 3 horas de induÃÃo a 37 ÂC, 180 rpm, os CI foram lisados e submetidos a tratamentos quÃmicos com surfactantes (CTAB; Cetrimida; ARG-12: um surfactante derivado de argenina) e um agente desnaturante (Cloridrato de Guanidina); tratamento fÃsico por sonicaÃÃo (4 ciclos de 2,5 min. cada a 50% de potÃncia) e tratamento enzimÃtico com protease nativa do lÃtex de C. procera. Ensaios de eletroforese sugeriram que os dois surfactantes quÃmicos foram eficientes na solubilizaÃÃo de rCpOsm enquanto que ARG-12 nÃo. Ainda, estes compostos catiÃnicos solubilizaram rCpOsm mais do que as demais proteÃnas dos CI, enquanto que o processo de sonicaÃÃo produziu amostras com maior diversidade de proteÃnas solÃveis, incluindo rCpOsm. O tratamento enzimÃtico mostrou que proteÃnas de CI sÃo, em algum alcance, digeridas enquanto que rCpOsm nÃo. O efeito do tratamento dos CI com protease foi analisado por imagens de microscopia de forÃa atÃmica e as diferenÃas de estrutura entre os CI tratados e nÃo tratados documentados. Todas as amostras foram avaliadas quanto à aÃÃo sobre Colletotrichum gloeosporiodes apÃs diÃlise e liofilizaÃÃo. Os produtos dos tratamentos com surfactantes apresentaram atividade antifÃngica, demonstrando atividade inibitÃria de germinaÃÃo de esporos e crescimento micelial. Entretanto, foi demonstrado que a atividade poderia estar relacionada aos agentes solubilizantes. ProteÃnas insolÃveis obtidas de E. coli contendo o plasmÃdeo Ãntegro, tomadas como controle negativo, nÃo apresentaram atividade nestes ensaios. A rCpOsm solubilizada com CTAB foi submetida a cromatografia em coluna de Ni++ (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7,0; em meio hidrofÃbico (FenilSepharose CL-4B) e troca iÃnica (Resource-S). Nenhum dos protocolos aplicados resultou na purificaÃÃo de rCpOsm e estes dados repetem o que foi observado previamente para a rCpOsm purificada a partir de Pichia pastoris.

O desequilíbio no turnover ósseo decorrente dos efeitos do alcoolismo crônico está relacionado à apoptose dos osteócitos, diminuição da espessura do osso medular e cortical e pelas alterações na atividade e diferenciação de osteoblastos. Devido à necessidade de tratamentos regenerativos e reconstrutivos associado ao alcoolismo, os xenoenxertos tem providenciado uma possibilidade terapêutica como material de preenchimento de defeitos ósseos. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo analisar o comportamento do biomaterial Bonefill® em defeitos críticos realizados em calvária de ratos, comparar a interferência do alcoolismo experimental na neoformação óssea, além de avaliar a influência do tipo de dieta líquida sobre a massa corporal dos animais. Foram utilizados 40 ratos machos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar, com 60 dias de idade, separados aleatoriamente em Grupo Controle (GC) os animais receberam água como dieta líquida e Grupo Experimental (GE) os animais receberam etanol a 25%, cada grupo composto por 20 ratos. O GC foi sub-dividido em GAC (Grupo Água Coágulo) correspondente ao defeito direito na calota craniana do animal e GAB (Grupo Água Biomaterial), defeito do lado esquerdo do animal. O GE foi sub-dividido em GEC (Grupo Etanol Coágulo) correspondente ao defeito direito da calota craniana e GEB (Grupo Etanol Biomaterial) defeito do lado esquerdo do animal. Foi realizada uma osteotomia circular de 5 mm de diâmetro no osso parietal direito e esquerdo. Os defeitos GAC e GEC foram preenchidos com coágulo sanguíneo e os defeitos GAB e GEB com osso bovino cortical inorgânico. Cinco animais de cada grupo foram eutanasiados nos períodos de 10, 20, 40 e 60 dias pós-cirúrgico. Os resultados da análise histológica mostraram que no período de 10 dias, no GAB e GEB as partículas do enxerto ósseo estavam circundadas por tecido de granulação e células inflamatórias, apresentou uma pequena formação de osso imaturo principalmente nas margens do defeito. No período de 20 dias foi obsevado presença de vasos sanguíneos e no GAB e GEB algumas partículas parcialmente circundadas por tecido ósseo neoformado. Os períodos de 40 e 60 dias exibiram áreas de formação óssea nas margens e ao redor de algumas partículas. O osso neoformado encontrava-se em um estágio mais avançado de remodelação, porém sem preenchimento completo do defeito e sem sinais de reabsorção da superfície do biomaterial. Na análise histomofométrica o percentual de formação óssea entre o GAC versus GEC e GAB versus GEB, para cada período experimental, não apontou diferença estatisticamente significante. Com relação à massa corporal o GC, nos períodos de 20, 40 e 60 dias pós-cirurgia a massa corporal aumentou, 7,9%, 6,6% e 14,1%, respectivamente. No GE ocorreu uma perda de 9,2% da massa corporal após 10 dias da cirurgia, e aos 40 e 60 dias ocorreu ganho de massa corporal de respectivamente 5,9% e 6,4% nos animais. Conclui-se que o biomaterial Bonefill® não promoveu uma maior neoformação óssea em defeitos críticos; a dieta alcoólica não atingiu os seus efeitos nocivos na formação óssea, e a dieta líquida de etanol, quando comparada à de água, interferiu negativamente na massa corporal dos animais. / The imbalance in bone turnover resulting from the effects of chronic alcoholism is related to apoptosis of osteocytes, decrease of trabecular and cortical bone thickness and changes in activity and differentiation of osteoblasts. Due to the need for regenerative and reconstructive treatments associated with alcoholism, xenografts has provided a therapeutic possibility as a filling material of bone defects. Therefore, the aims of this study were to analyze the Bonefill® biomaterial behavior in critical defects created on the calvaria of rats; to compare the interference of experimental alcoholism in bone formation, as well as to evaluate the influence of 2 type of liquid diet on animal body weight. 40 male Wistar rats were used (Rattus norvegicus), with 60 days of age. The rats were randomly separated into Control Group (CG, nº = 20), which received water as liquid diet and Experimental Group (EG, nº = 20), these rats consumed ethanol 25%. CG was subdivided into WCG (Water Clot Group), corresponding to the right calvaria defect and WBG (Water Biomaterial Group), left side defect of the calvaria. EG was subdivided into ECG (Ethanol Clot Group), corresponding to the right calvaria defect and EBG (Ethanol Biomaterial Group), left side defect of the calvaria. A circle osteotomy of 5 mm in diameter was performed in the right and left parietal bone. The bone defects in WCG and ECG were filled with blood clot and the defects in WBG and EBG were filled with inorganic bovine bone. 5 animals from each group were euthanized at periods of 10, 20, 40 and 60 days after surgery. The histological analysis showed that at 10 days, WBG and EBG, the particles of bone graft were surrounded by granulation tissue and inflammatory cells, it also showed a small immature bone formation mainly at the margins of the defects. At 20 days it was observed blood vessels in WBG and EBG and some graft particles partially surrounded by new bone. At 40 and 60 days it was exhibited some areas of bone formation at the margins and around a few particles. The newly formed bone was in a more advanced stage of bone remodeling, however it did not showed neither complete filling nor signs of resorption of the biomaterial surface. Histomorphometric analysis on the percentage of bone formation between WCG versus ECG and WBG versus EBG, for each trial period, showed no statistical significant difference. Regarding the body mass CG, at 20, 40 and 60 days the body mass increased 7.9%, 6.6% and 14.1%, respectively. The EG had a loss of body weight of 9.2% after 10 days of surgery and at 40 and 60 days it showed a body mass gain of 5.9% and 6.4%, respectively. It can be concluded that Bonefill® did not promote an increase bone formation in critical defects; the alcohol diet did not achieve its adverse effects on bone formation, and the liquid diet containing ethanol, compared to the liquid water diet had a negative effect on animal body weight.

Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.