Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) is a naturally occurring oomycete pathogen on Arabidopsis thaliana. It is related to downy mildews of economically important crops such as cabbage, kale and broccoli, belonging to the Brassicaceae family. Downy mildew pathogens are obligate biotrophs that extract nutrients exclusively from living plant cells. As a part of its obligate biotrophy lifestyle, Hpa has lost the ability to assimilate inorganic nitrogen and sulfur. It thus has to acquire these nutrients from the host in an organic form; possibly amino acids. Using a reverse genetic approach, I was able to identify two host amino acid transporters that are up-regulated during Hpa infection: AAP3 and AAP6. Both of these transporters are localized in the vasculature of the plant, AAP3 mostly in the root, and AAP6 in the roots and shoots. Using transgenic lines of Arabidopsis containing transcriptional and translational reporter fusion constructs for these genes, I found that AAP3 displays increased mRNA accumulation which is attributable to an increased promoter activity in regions of shoot tissue colonized by Hpa. On the other hand, AAP6 displays a mild increase in mRNA accumulation under Hpa infection, but the induction becomes more prominent at the protein level as seen by fluorescence from GFP fused to AAP6. Surprisingly, null mutants of AAP3 did not impact Hpa growth whereas null mutants of AAP6 made the plant more susceptible to Hpa. Furthermore, aap6 mutants accumulate fewer free amino acids in the phloem compared to wild-type plants when infected with Hpa. Together, these results suggest that AAP6 acts a nutritional starvation gene for the pathogen and hence aids the plant during infection. While we now know more about AAP3's regulation during infection, its function remains to be elucidated. To successfully colonize a plant, a pathogen must be able to achieve both suppression of plant immunity and acquisition of nutrients from the plant host. While the former has been well studied, research on the latter is sparse. This work was a step in the direction to increase our understanding of potential players in nutrient acquisition by pathogens. / Doctor of Philosophy / A key aspect of achieving and maintaining food security is sustainable agricultural production. This is endangered by plant diseases that lead to large losses in crop production. All plant pathogens have to acquire food and nutrients from the plants they infect. Understanding how they acquire nutrients from the plant at a molecular level can give us insight into potential methods to prevent this and hence reduce the impact of plant diseases. One such nutrient is nitrogen. Nitrogen is essential to all of an organism’s cellular and metabolic processes. Organisms utilize nitrogen by converting it from inorganic forms such as nitrates to organic forms such as amino acids. Some plant pathogens, such as Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa), which causes downy mildew disease on the model plant Arabidopsis, complete their entire life cycle on a living plant. They are also unable to convert the inorganic nitrogen to organic forms and hence depend on acquiring organic forms of nitrogen from the plant. Thus, it is important to understand how they acquire amino acids from the plant. Plants use amino acid transporters that serve as a siphon or a pump in moving amino acids from one region of the plant to another. It is possible that pathogens manipulate plant’s amino acid transporters to move amino acids towards the infection site while, at the same time, plants might use another set of transporters to move amino acids away from the pathogen. This work was an attempt at understanding this potential role of plant amino acid transporters in plant-pathogen interactions using the model system of Hpa and Arabidopsis.

Thesis (MSc)--University of Stellenbosch, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: Hen egg white lysozyme (HEWL; muramidase; EC 3:2:1:17) is an enzyme present in high concentrations in chicken (Gallus gallus) egg whites. It hydrolyses the link between N-acetylmuramic acid and N-acetylglucosamine in Gram positive bacterial cell walls, resulting in cell death. It is thus active against lactic acid bacteria (LAB), which may be present in grape juices and musts. These bacteria are responsible for malolactic fermentation of wines although many species, particularly of the genera Lactobacillus and Pediococcus, are considered spoilage organisms. The growth of LAB is therefore closely monitored and controlled during winemaking. The most common means of control is growth inhibition by chemical treatment (usually with SO2). Lysozyme is a commonly used wine processing aid, complementing the antimicrobial activity of SO2 . It allows for lower doses of SO2 to be used, thus improving the wholesomeness of wine. The OIV (Organisation Internationale de la Vigne et du Vin) approved its use in quantities up to 500 mg per liter of wine in 1997. This study evaluated the effect of different secretion signals on the secretion of lysozyme by the haploid auxotroph Saccharomyces cerevisiae strain FY23. Secretion by an industrial strain (VIN13) transformed with a single copy of the HEWL gene with the MF-a secretion signal under the control of the PGK1 (phosphoglycerate kinase 1) prompter and terminator was also evaluated. In the case of FY23 four secretion signals were used, namely the native lysozyme signal and the S. cerevisiae mating factor-a signal as well as mutants of these signals. These mutants incorporated two additional arginines at the N-terminus of the signals immediately downstream of the terminal methionine. The effect of these mutations was to increase the positive charge of the secretion signal N-terminals. The secretion signal-lysozyme fusions were placed under the regulation of the S. cerevisae PGK1 gene’s promoter and terminator. The resulting expression cassettes were cloned into integrating vectors YIpLac211 and pDMPOF1b and episomal vector pHVX2. These were used to transform FY23 and VIN13. FY23 as well as VIN13 transformants were evaluated in an artificial medium designed to reflect the nutrient content of grape juice, with particular attention being paid to assiminable nitrogen. Three hexose concentrations were tested in order to determine the effect thereof on lysozyme secretion titer. Lysozyme secreted under all tested growth conditions was found to be too low for detection by either enzymatic assay or HPLC-FLD. For this reason secreted lysozyme was isolated and concentrated 10x by means of cation-exchange. Subsequently, lysozyme concentrations in the concentrates was determined by means of the aforementioned techniques. SDS-PAGE analysis of lysozyme concentrates was also performed. No significant differences were found between native or MF-a secretion signals and their mutated counterparts in terms of secretion titer or proteolytic maturation. Lysozyme secreted with the MF-a signal was found to be misprocessed in all cases, with both an authentically processed and a larger form, in which the secretion signal was not completely removed, being present. Lysozyme secreted with the native signal appeared to be correctly processed in all cases. Secretion titer from high copy number episomal FY23 tranformants was similar to that of integrants containing a single copy of the gene. Sugar concentration affected lysozyme production, with higher quantities of the enzyme being secreted when higher initial sugar concentrations were used. Lysozyme titers were extremely low (< 0:25 mg/L) with all expression cassettes under all the tested conditions with both FY23 and VIN13. In the case of the VIN13’s a lower final biomass was found for the secretor strain tested in comparrison to the VIN13 wild-type. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Hoendereierwitlisosiem (HEWL; muramidase, EG 3:2:1:17) is ´n ensiem teenwoordig in hoë konsentrasies in hoender (Gallus gallus) eierwitte. Dit hidroliseer die binding tussen N-asetielmuramiensuur en N-asetielglukosamien in Gram positiewe bakteriese selwande, wat tot seldood lei. Dit is dus aktief teen melksuurbakterieë (MSB), wat in druiwesap en mos teenwoordig kan wees. Hierdie bakterieë is verantwoordelik vir appelmelksuurgisting van wyne, hoewel baie spesies, veral van die genera Lactobacillus en Pediococcus, ook as bederforganismes beskou word. Die groei van MSB word dus noukeurig tydens wynbereiding gemoniteer en beheer. Die algemeenste wyse van beheer is groei-inhibisie deur chemiese behandeling (gewoonlik SO2). Lisosiem is ´n algemeen gebruikte wyntoevoegingsmiddel en vul die antimikrobiese aktiwiteit van SO2 aan. Met lisosiem kan ´n laer dosis van SO2 gebruik word, wat lei tot ´n verbetering van die heilsaamheid van die wyn. Die OIV (Organisasie Internationale de la Vigne et du Vin) het die gebruik daarvan goedgekeur tot en met 500 mg per liter wyn vanaf 1997. Hierdie studie het die effek van verskillende sekresieseine op die uitskeiding van lisosiem deur die haploïede ouksotrofe Saccharomyces cerevisiae stam, FY23, geëvalueer. Uitskeiding deur ´n industriële stam (VIN13), wat getransformeer is met ´n enkelkopie van die HEWL-gene met die MF-a sekresiesein onder die beheer van die PGK1 (Fosfogliseraat kinase 1) promotor en termineerder, is ook geëvalueer. In die geval van FY23 is vier sekresieseine gebruik, naamlik die inheemse lisosiemsein, S. cerevisiae MF- a sein, asook mutante van hierdie seine. Hierdie mutante het twee bykomende arginienresidu’s by die N-terminus van die seine direk stroom-af van die terminale metionien. Die effek van hierdie mutasies was om die positiewe lading van die uitskeidingsein N-terminale te verhoog. Die gevolglike uitdrukkingskassette is in die integrasievektor YIpLac211 en pDMPOF1b, en die episomale vektor pHVX2, gekloneer. Dit is gebruik om VIN13 en FY23 te transformeer. FY23, sowel as VIN13-transformante, is geëvalueer in ´n kunsmatige medium wat ontwerp is om die voedingsinhoud van druiwesap te weerspieël, met besondere aandag aan assimileerbare stikstof. Drie heksose konsentrasies is getoets om te bepaal wat die uitwerking daarvan op die lisosiemsekresietiter is. Onder alle groeitoestande was die isosiem wat uitgeskei is, te laag om deur ensimatiese toetse of HPLC-FLD bepaal te word. Om hierdie rede is uitgeskeide lisosiem geïsoleer en 10x gekonsentreer deur middel van katioon-uitruiling. Daarna is lisosiemkonsentrasies bepaal deur middel van bogenoemde tegnieke. SDS-PAGE-ontleding van lisosiemkonsentraat is ook uitgevoer. In terme van sekresietiter of proteolitiese maturasie, is geen beduidende verskille gevind tussen inheemse of MF-a sekresieseine en hul gemuteerde eweknieë nie. Lisosiem wat deur die MF-a sein uitgeskei is, is in alle gevalle foutief geprosesseer, met ´n teenwoordigheid van beide die regte produk en ´n groter produk, waarin die uitskeidingsein nie heeltemal verwyder word nie. Lisosiem wat met die inheemse sein uitgeskei is, blyk in alle gevalle korrek verwerk te wees. Sekresietiter van ´n aantal hoë-kopie episomale FY23-transformante was soortgelyk aan dié van integrante met ´n enkelkopie van die geen. Suikerkonsentrasie beïnvloed lisosiemproduksie, met ´n hoër hoeveelheid van die ensiem wat uitgeskei word wanneer die aanvanklike suiker in hoër konsentrasies gebruik is. Lisosiemtiters was baie laag (< 0:25 mg/L), met al die kassette onder al die getoetste toestande vir beide FY23 en VIN13. In die geval van die VIN13’s, is ´n laer finale biomassa vir die uitskeidingstam in vergelyking met die VIN13 wilde-tipe gevind.

As hidrolases, principalmente as peptidases e lipases, são responsáveis pelo alto faturamento no mercado mundial e pelos diversos empregos industriais e biotecnológicos. A obtenção destas proteínas ocorre pela aplicação dos microrganismos a bioprocessos, tanto de forma selvagem quanto por expressão heteróloga. Neste contexto, existe uma busca incessante por enzimas mais estáveis e com maior atividade catalítica, e algumas técnicas têm sido utilizadas para o melhoramento destes parâmetros. A obtenção da peptidase e lipase pelo fungo Fusarium oxysporum foi realizada por bioprocesso submerso, gerando picos de 165 U/mL em 72 horas e 633 U/mL em 48 horas, respectivamente. A peptidase foi purificada utilizando a resina Sephadex G-50 de exclusão de massa e caracterizada utilizando um substrato peptídico com supressão intramolecular de fluorescência. A classe da proteína foi determinada como serino peptidase e demonstrou características neutra e estável quanto ao pH em uma faixa ampla. A temperatura ótima foi de e 50 °C e a partir dos ensaios de estabilidade térmica foi evidenciado a manutenção da atividade proteolítica de 60-90% até 60 °C no período de uma hora. Quanto à eficiência catalítica, os subsítios S1, S2 e S\'1 tem certa especificidade, pois não demonstram eficiência catalítica quando há a presença dos seguintes aminoácidos nas respectivas posições dos substratos P1 (ácido aspártico, prolina e isoleucina), P2 (ácido aspártico, histidina, lisina, asparagina e triptofano) e P\'1 (ácido aspártico, ácido glutâmico e prolina), ao contrário dos subsítios S3, S\'2 e S\'3, onde todos aminoácidos apresentaram eficiência catalítica. A lipase foi purificada utilizado resina iônica e apresentou características básica e estabilidade em pH neutro, sua temperatura ótima foi de 35 °C e manutenção da atividade catalítica em pelo mens 50% após 1 hora de exposição a 25 a 40 °C. A produção da quimera deu-se pela busca de uma peptidase e uma lipase provenientes do fungo F. oxysporum no banco de dados, elas foram então fusionadas utilizando um linker composto por cinco aminoácidos (GGAGG) nas regiões C-terminal da peptidase e N-terminal da lipase. Ambas atividades foram detectadas na quimera, tornando-a funcional. A aplicação biotecnológica de ambas enzimas selvagens e recombinante é um passo importante para inovação, e de acordo com as características apresentadas cada enzima pode ser aplicada a diversos processos industriais, desde detergentes a biorremediação / proteins is wild-type microorganisms by bioprocesses or by heterologous expression. In this context, there is an incessant search for more stable enzymes with higher catalytic activity, and some techniques have been used to improve these parameters. Obtainment of peptidase and lipase by the fungus Fusarium oxysporum was performed by submerged bioprocess, generating peaks of 165 U / mL in 72 hours and 633 U / mL in 48 hours, respectively. Peptidase was purified using the Sephadex G-50 size exclusion resin and characterized using a peptide substrate with intramolecular fluorescence suppression. The enzyme class was determined as serine peptidase and demonstrated neutral and stable characteristics in a wide range of pH. The optimum temperature was 50 ° C and the thermal stability assays showed the maintenance of the proteolytic activity from 60 to 90% up to 60 ° C within one hour of exposure. As for catalytic efficiency, the S1, S2 and S\'1 subsites have a certain specificity, since they do not demonstrate catalytic efficiency when the following amino acids are present in the respective positions of the substrates P1 (aspartic acid, proline and isoleucine), P2 (aspartic acid, Histidine, lysine, asparagine and tryptophan) and P\'1 (aspartic acid, glutamic acid and proline), unlike subsites S3, S\'2 and S\'3, where all amino acids showed catalytic efficiency. The lipase was purified using ionic resin and presented basic characteristics and stability at neutral pH, its optimum temperature was 35 ° C and maintenance of the catalytic activity by 50% after 1 hour of exposure at 25 to 40 ° C. Production of the chimera was done by the search of a peptidase and a lipase from the fungus F. oxysporum in the database, they were then fused using a linker composed of five amino acids (GGAGG) in the C-terminal regions of the peptidase and N- Terminal portion of the lipase. Both activities were detected in the chimera, making it functional. The biotechnological application of both wild and recombinant enzymes is an important step for innovation, and according to the characteristics presented each enzyme can be applied to several industrial processes.

Uma das estratégias utilizadas no desenvolvimento de novas drogas envolve a descoberta de compostos que modulem a atividade de enzimas, importantes no processo infeccioso de patógenos. Uma abordagem interessante na triagem de novos ligantes é o uso de métodos baseados na imobilização de enzimas em suportes cromatográficos acoplados a sistemas de cromatografia líquida. O uso de IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) como uma fase estacionária acoplado a sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência consiste em uma estratégia para triagem de compostos rápida e eficiente e tem vantagens em relação ao uso de enzimas em solução. A enzima NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi age como um facilitador da infecção do patógeno, inibindo assim a resposta imune do hospedeiro, permitindo uma infecção silenciosa, o que sugere seu uso como um bom alvo na busca por inibidores. Neste trabalho, a enzima NTPDase-1 foi imobilizada na parede interna de capilares de sílica fundida formando ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Estudos das condições de uso destes biorreatores juntamente com o desenvolvimento de um método cromatográfico multidimensional, foram realizados e validados. A otimização do método cromatográfico e sua validação, apresentaram ótimos resultados em relação aos valores obtidos para os parâmetros avaliados para métodos bioanalíticos. A imobilização da enzima foi realizada com sucesso, sendo possível a detecção da atividade catalítica no sistema cromatográfico (TcNTPDase1-ICER). Foi realizado também, o estudo cinético para ATP no TcNTPDase1-ICER, obtendo-se KM de 0,317 ± 0,044 mM, que comparado com estudos em solução, KM de 0,096 mM, ainda apresenta grande afinidade pelo substrato. / One of the strategies used in the development of new drugs involves the discovery of compounds that modulate the activity of enzymes, important in the infectious pathogens process. An interesting approach in the screening of new ligands is the use of methods based on immobilization of enzymes in chromatographic supports coupled to liquid chromatography systems. The use of IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) as a stationary phase coupled to high performance chromatographic systems consist in a strategy to a fast and efficient compounds screening and it has advantages comparing to the use of enzymes in solution. The enzyme NTPDase-1 Trypanosoma cruzi acts as a pathogen infection facilitator, thus inhibits the host immune response allowing a silent infection, suggesting its use as a good target in the search for inhibitors. In this paper, the enzyme NTPDase-1 was immobilized for the manufacturing of ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Studies of conditions to the use of these bioreactors in the ligands screening along with the development of a multidimensional chromatographic method were performed and validated. The chromatographic method optimization and validation, presented excellent results, relating to the obtained values, from evaluated parameters in bioanalytical methods. The enzyme immobilization was successfully performed, being possible to detect the catalytic activity in the chromatographic system (TcNTPDase1-ICER). The kinetic study for the substrate ATP was also performed in the TcNTPDase1-ICER, obtaining KM of 0.317 ± 0.044 mM, which in comparison with studies in solution KM of 0.096 mM, still presents high affinity for the substrate.

No presente trabalho, cultivou-se o microrganismo Escherichia coli RR1, contendo o vetor que carrega o gene estrutural para a síntese do hormônio de crescimento humano (hGH) (baseado no promotor pL e pR do fago l sob controle do repressor termosensível cI857) em processos descontínuo e descontínuo-alimentado realizados em biorreatores com capacidade útil de 2 e 4 L. Tal cepa é auxotrófica com relação aos aminoácidos l-leucina e l-prolina e à tiamina (vitamina B1). Nos cultivos descontínuos com concentrações menores de extrato de levedura e bactotriptona em relação ao meio denominado basal, a concentração celular foi baixa, atingindo 2,4 g.L-1, com fator de conversão glicose à células de 0,25 g.g-1. Em cultivos descontínuos com aumento (em relação ao meio basal) da concentração de extrato de levedura e de bactotriptona e com adição de l-prolina, a concentração celular alcançou valores da ordem de 5,9 g.L-1 e fator de conversão glicose à células de 0,48 g.g-1, simultaneamente à maior formação de acetato (2,5 g.L-1), este último prejudicial ao processo. Contudo, este resultado de crescimento celular não se repetiu devido a mudança do lote de células utilizado entre o primeiro e o segundo conjunto de ensaios. Os cultivos descontínuos-alimentados foram realizados com diferentes formas de alimentação bem como diferentes composições de solução de alimentação. Uma alimentação contínua com velocidade exponencial e composição semelhante à do meio, pareceu ser a mais favorável, levando à concentração celular final de 9,2 g.L-1 e fator de conversão glicose a células, na fase descontínua-alimentada, de 0,36 g.g-1. Os ensaios com indução térmica não foram eficientes provavelmente devido à problemas na detecção das concentração de glicose existente no instante inicial da ativação da síntese do hGH. Esta glicose presente pode ter prejudicado a formação do hGH por conseqüência do processo fermentativo causado pelo aumento da temperatura e pela presença de elevada concentração de nutrientes complexos. O meio de cultivo utilizado possivelmente não supriu as necessidades metabólicas da célula para a síntese do hormônio de crescimento humano e em nenhum dos cultivos com indução térmica houve a produção de hGH. / In the present work, the host Escherichia coli RR1, having the vector with the structural gene for human growth hormone (hGH) synthesis, based on pL or pR promoters from bacteriophage l under the control of the thermosensitive repressor cI857, was cultivated in batch and fed-batch cultures in bioreactors with working volumes of 2 and 4 L. This host has amino acids (l-leucine and l-proline) and thiamine (Vitamin B1) auxotrophy. Batch cultures under low yeast extract and bacto-tryptone concentrations (relative to the basal medium) resulted in a low biomass yield (2.4 g.L-1) and cell yield on glucose (0.25 g.g-1). Increasing these concentrations and adding l-proline to the medium led to higher biomass formation (5.9 g.L-1), cell yield on glucose (0.48 g.g-1) and acetate high levels (2.5 g.L-1), which were harmful to the process. However, these results of cellular growth were not reproducible due to different cell stocks applied. The fed-batch cultures were performed under different feeding strategies and different nutrients concentrations of the feeding solution. A continuous exponential feeding rate with growth medium-like composition seemed to be the most favorable, reaching final cellular concentration of 9.2 g.L-1 and yield on glucose on fed-batch mode of 0.36 g.g-1. The heat-shock runs were not efficient probably due to problems in detection of glucose concentration existing on initial instant of hGH activation synthesis. Glucose interferes with the hGH synthesis because the fermentation caused by temperature shift and presence of high complex nutrients concentration. The culture medium used, probably was not able to supply cell metabolic needs for the human growth hormone synthesis and in no other temperature-induced experiment the hGH production was observed.

Neste trabalho, construiu-se linhagens recombinantes de Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae que expressam hormônio de crescimento de carpa (GHc). Para expressão de GHc em P. pastoris, o cDNA de GH de H. molitrix foi inserido nos plasmídeos pHILD2 (expressão interna) e pPIC9K (expressão e secreção) dando origem aos plasmídeos pHILGH e pPICGH. A expressão em S. cerevisiae foi controlada pelo promotor e terminador PGK e o cassete de expressão ladeado por elementos &#948;, dirigindo a integração em múltiplas cópias no genoma. Ainda, construiu-se um plasmídeo onde a sequência de GHc foi fusionada a uma sequência sinal modificada (sequência sinal de proteína de K. lactis, fusionada a fragmento de interleucina humana), visando altos níveis de secreção. Os transformantes (expressão interna) expressaram proteína recombinante de 20 KDa. Um dos transformantes de S. cerevisiae secreta cerca de 1045,0 µg/ml de GHc. As proteínas recombinantes apresentaram hibridação específica contra anticorpo anti GHc comercial indicando que são biologicamente ativas. / In order to achieve the GHc expression in P. pastoris, the GH cDNA of the carp H. molitrix was introduced into the plasmids pHILD2 (intracellular expression) and pPIC9K (expression and secretion) originating the plasmids pHILGH and pPICGH. The expression of the GH cassette in S. cerevisiae was driven by the PGK promoter and terminator and the cassette was flanked by the &#948; elements, which provides multiple copies integration into the genome. We also constructed a plasmid in which the GHc cDNA sequence was fused to a modified signal sequence (K. lactis protein signal sequence fused to a human interleukin fragment), aiming to reach high levels of secretion. P. pastoris and S. cerevisiae recombinant clones (intracellular expression) were shown to express a recombinant protein of 20 KDa. One of the S. cerevisiae recombinant clones secreted around 1045.0 µg/ml of GHc. The recombinant proteins showed hybridization of the bands against antibody anti-commercial GHc. The results indicate that the recombinant proteins produced in this work are biologically active.

O interior do Estado de São Paulo, anteriormente ocupado por matas semidecíduas e cerrado, hoje está praticamente tomado por diferentes culturas ou pastagens, restando apenas algumas pequenas manchas de cerrado e de mata, apontando para uma drástica perda do rico patrimônio genético florestal. A região de Ribeirão Preto é uma das mais devastadas do Estado de São Paulo, principalmente nas regiões próximas aos mananciais e indústrias de cana-de-açúcar e suas matas encontram-se hoje totalmente fragmentadas e reduzidas a 2 % de sua área original. Ante a urgência de se resgatar as espécies arbóreas nativas da flora regional, foi implantado o Projeto Floresta USP, no campus da USP de Ribeirão Preto, sendo 30 ha de reflorestamento heterogêneo e 45 ha correspondem ao Banco de Germoplasma (BG-USP/RP). Tabebuia roseo-alba (ipê-branco; Bignoniaceae) é uma das 44 espécies presentes nesse Banco pelo fato de ser pouco observada em condições naturais, necessitando de estudos que visem o entendimento da sua diversidade genética nos remanescentes florestais e no próprio BG-USP/RP para a adoção correta das estratégias de manejo e conservação. Os marcadores microssatélites são indiscutivelmente os mais indicados para este tipo de estudo, em razão de seu elevado conteúdo informativo, sua robustez analítica, transferibilidade e facilidade de obtenção de dados genéticos via PCR. Este estudo teve por objetivos analisar a diversidade genética de matrizes e progênies de T. roseo-alba e verificar a maternidade dessas progênies conservadas no BG-USP/RP, utilizando 10 pares de primers SSR transferidos de Tabebuia aurea. O DNA foi extraído de folhas de todos os indivíduos, as condições de amplificação e separação por eletroforese vertical em géis de poliacrilamida padronizadas e os géis corados com nitrato de prata. A partir dos dados gerados foram estimados parâmetros genéticos de diversidade com auxílio dos programas GDA 1.0, FSTAT 2.9.3, Cervus 3.0 e Structure 2.2.3. Houve um sucesso de 90% na amplificação das regiões microssatélites para os 10 locos SSR analisados, mas foram empregados neste estudo apenas 8 locos SSR, que estão em equilíbrio de ligação e apresentaram um valor médio de PIC altamente informativo (0,745). Nas matrizes e progênies do Banco analisadas foi observada uma alta riqueza alélica (85 e 96 alelos), e uma elevada diversidade genética (0,746 e 0,775), respectivamente, sendo que a heterozigosidade média observada foi menor que a esperada, evidenciando um déficit de heterozigotos. O índice de fixação para as matrizes de T. roseo-alba foi alto (Fis =0,638) e significativamente diferente de zero (P<0,05), sugerindo a atuação de algum fator gerador de endogamia como cruzamentos entre indivíduos aparentados, auto-fecundação, efeito Wahlund e a presença de alelos nulos segregando nestes locos. Adicionalmente, as progênies também apresentaram um alto valor de Fis (0,696), indicando que o sistema de cruzamento de T. roseo-alba deve ser o principal fator pelo alto coeficiente de endogamia. A análise conjunta dos locos tanto nas matrizes como nas progênies apresentou altas probabilidades de exclusão de paternidade, confirmando que esta bateria de locos tem alto potencial para estudos de análise de paternidade/maternidade em T. roseo-alba. Análises de maternidade mostraram que apenas 62 % das progênies de T. roseo-alba do BG-USP/RP têm sua origem materna identificada, mas o fornecimento de sementes para programas de reflorestamento não ficará comprometido uma vez que foram transferidos 95,3 % dos alelos das matrizes para as progênies do BG-USP/RP, contribuindo para a conservação ex situ desta importante espécie florestal. / The State of Sao Paulo, originally covered with semideciduous forests and Brazilian savannah (Cerrado), is nowadays almost completely covered with different cultures or pastures. Therefore only some small forests and Brazilian savannah fragments remain, pointing to a drastic loss of the rich forest genetic patrimony. The Region of Ribeirão Preto is one of the most devastated areas within the State of Sao Paulo. Especially areas that are located next to water sources and sugar cane plantations are affected. The original forests have nearly totally been fragmented and their actual extension has been reduced to about 2% of the original zone. The USP Forest Project has been implanted at the Sao Paulo University in Ribeirao Preto given the urgency to rescue the native forest species of the regional flora. There are 30 ha of heterogeneous reforestation and 45 ha that belong to the Germplasm Bank (BG-USP/RP). Tabebuia roseo-alba (White Tabebuia tree; Bignoniaceae) is one of the 44 species conserved at this Bank due to the fact that it is nowadays rarely encountered in the natural environment. There is na exigence of studies that aim at the agreement of its genetic diversity in the forest remnants and at the BG-USP/RP for the correct adoption of management and conservation strategies. Microsatellite markers are unquestionably indicated for this type of study because of their high information content, analytical robustness, transferability and easiness of genetic data attainment via PCR. This study aimed to analyze the genetic diversity of mother trees and their progeny individuals of T. roseo-alba and verify the maternity of these progeny individuals conserved at the BG-USP/RP, using 10 primer pairs SSR transferred from Tabebuia aurea. DNA was extracted from fresh leaves of all samples, the amplification and electrophoresis conditions were standardized and the polyacrilamyde gels stained with silver nitrate. Genetic parameters were estimated using the programs GDA 1.0, FSTAT 2.9.3, Cervus 3.0 and Structure 2.2.3. There was a 90% success in the amplification of the microsatellite regions for 10 loci SSR, but 8 loci SSR had been used in this study. These loci are in linkage equilibrium and presented an average PIC value highly informative (0.745). A high allelic richness was observed for the mother trees (85 alleles) and the progeny individuals at the Bank (96 alleles) and also a high genetic diversity (0.746 e 0.775, respectively), being that the Ho average was smaller than the He average, evidencing a heterozigote deficit. The fixation index for the mother trees of T. roseo-alba was high (Fis =0.638) and significantly different from zero (P < 0.05)), suggesting the performance of some factor that caused endogamy such as crossings between related individuals, self-fertilization, the Wahlund effect and the null alleles presence segregating in these loci. Additionally, the progeny individuals also presented a high Fis value (0.696), indicating that the T. roseo-alba mating system might be the main factor for the high endogamy coefficient. The joint analysis of these loci in the mother trees and progeny individuals presented high paternity exclusion probabilities, confirming that this loci battery has a high potential for paternity/maternity analysis studies in T. roseo-alba. Maternity analyses showed that only 62 % of the T. roseo-alba progeny individuals at the BG-USP/RP have their maternal origin identified. The supplying with T. roseo-alba seeds for reforestation programs will not be endangered because 95.3 % of the mother tree alleles have been transferred to the progeny individuals at the BG-USP/RP, contributing to the ex situ conservation of this important forest species.

A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e de uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e no segundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1722 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial. Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos. / In spite of the advantageous physiological properties of the yeast Kluyveromyces marxianus to produce heterologous proteins, this species has not been widely explored for the synthesis of these biomolecules. On the other hand, more than 40 heterologous expression systems, including commercial ones, were developed for Kluyveromyces lactis. Moreover, there is no available literature concerning heterologous protein glycosylation in K. marxianus. Taking these facts into account, this work aimed at developing systems for the heterologous production of Aspergillus niger glucose oxidase (GOX) and of a thermophilic esterase (EST) from Thermus thermophilus in K. marxianus. The strain K. lactis CBS 2359 was utilized as a reference throughout the whole work. First, a physiological study was carried out in order to select one K. marxianus strain, out of three which had been chosen based on literature information, that exhibited the best physiological traits to be a heterologous expression host. The chosen strain was CBS 6556, based on a combination of the following properties: specific growth rate, metabolites formation, biomass yield on substrate, and secretion of the homologous enzyme inulinase. Subsequently, two episomal systems were constructed. In one of them, the heterologous gene was expressed under control of the S. cerevisiae PGK promoter, whereas in the other system, heterologous gene expression occurred under control of the K. marxianus INU1 promoter. An integrative expression system was also constructed, in which the KmINU1 promoter drove foreign gene expression. Both heterologous enzymes were characterized biochemically and also with respect to their glycosylation. The results attained with GOX led to an expression level of 1722 U/g DW (unit per gram of dry cell weight) in K. marxianus transformed with the episomal INU1-based system. The biochemical studies showed that the enzyme was very similar to the A. niger GOX. Furthermore, analysis of the glycosylation pattern showed a lower tendency of K. marxianus to hypermannosylate proteins, when compared to K. lactis. Higher levels of esterase (294 U/gDW) were obtained in K. lactis than in K. marxianus. However, the enzyme produced in the latter host presented a higher temperature for maximal activity ((50 °C), when compared to the former organism (45 °C). Both values are lower than the temperature for maximal activity of the homologous enzyme (65 °C), which can be explained by the glycans added by both yeast species to the peptide, resulting in a glycosylated protein, in contrast to the homologous esterase. Moreover, the yeast products presented three glycosylation patterns. In conclusion, the work presented in this thesis reached its aims, which were to develop these expression systems and to characterize biochemically the heterologous enzymes expressed, which included an analysis of the glycosylation pattern. The results presented here will certainly be of interest and aid the scientific community working on the expression of heterologous proteins in microorganisms.

Segundo a classificação CAZy (Carbohydrate Active enZymes), as glicosil hidrolases (GH) da família 93 são exo-?-1,5-arabinanases que atuam nas ligações ?-1,5 que unem os resíduos de L-arabinofuranosideo que conformam a cadeia principal de arabinana desramificada, liberando arabinose ou arabinobiose. Esta recém descrita família de enzimas, além de ter o potencial de participar junto com outras proteínas na sacarificação de resíduos industriais como a polpa de beterraba, oferece a possibilidade de sintetizar novas moléculas, pois alguns membros desta família podem catalisar reações de transarabinosilação utilizando glicerol, xilitol e sorbitol como aceptores. Embora as GH93 apresentem caraterísticas atrativas para aplicações industriais, até o momento apenas cinco enzimas desta família foram caraterizadas bioquimicamente, sendo que a maioria delas apresentou maior atividade em pHs ácidos e nenhuma com caraterísticas termofílicas. Neste trabalho uma exo-?-1,5-arabinanase abnt do fungo termofílico Thielavia terrestris foi expressa heterólogamente pela primeira vez em fungo filamentoso, utilizando Aspergillus nidulans linhagem A773 transformado com o vetor pEXPYR como sistema de expressão. A enzima foi caraterizada bioquimicamente e sua produção fermentativa avaliada, utilizando dois tipos de indutores em diferentes concentrações e condições de cultivo, escolhendo a melhor condição para o escalonamento. A proteína recombinante de 39,8 KDa mostrou ser uma glicoproteína com uma atividade especifica de 248 U.mg-1 em arabinana desramificada 0,28 mM, pH 5 e temperatura de 70 ?C (valores ótimos para enzima), um Km 0,29 mM, Vmax 0,45 ?mol.min-1, Kcat 115,4 s-1, e eficiência catalítica de 3,9 *105 s-1 M-1, mostrando também um aumento de 34% na liberação de produto quando incubada na presença de CoCl2 1mM. Esta é a primeira exo-arabinanase reportada na literatura com comportamento termofílico e prolongada estabilidade em pHs ácidos. No processo fermentativo a melhor produção de abnt foi atingida usando 3% (m/v) do indutor em condições de cultivo submerso, o escalonamento do processo não afetou a produção enzimática. O sistema de expressão A. nidulans+pEXPYR foi capaz de produzir a mesma quantidade de proteína recombinante utilizando como indutor, um composto cinquenta vezes mais barato que o normalmente utilizado. / According to CAZy (Carbohydrate Active enZymes) classification, glycosyl hydrolases (GH) from family 93 are exo-?-1,5-arabinanases acting on ?-1,5 bonds that bind L-arabinofuranose residues in the main chain of arabinan releasing arabinose or arabinobiose. This new family of enzymes was described recently and, besides having the potential to participate along with other proteins in the saccharification of agro industrial wastes such as sugar beet pulp, offers the possibility of synthesize new molecules, since some members of this family can catalyze reactions of transarabinosylation using glycerol, xylitol and sorbitol as acceptors. Although, GH93 presents attractive characteristics for industrial applications, only five enzymes have been characterized biochemically so far, most of them presenting higher activity in acidic pHs and none with thermophilic characteristics. In this work an exo-?-1,5-arabinanase abnt of the thermophilic fungus Thielavia terrestris was heterologously expressed for the first time in a filamentous fungus using Aspergillus nidulans strain A773 transformed with the pEXPYR vector as expression system. The enzyme was characterized biochemically and its fermentative production was evaluated using two types of inducers in different concentrations and conditions of cultivation, setting the best condition for scale up. The recombinant protein of 39.8 KDa showed be a glycoprotein with a specific activity of 248 U.mg-1 in 0.28 mM debranched arabinana at pH 5 and temperature of 70 °C (optimum values for enzyme), a Km 0,29 mM, Vmax 0.45 ?mol.min-1, Kcat 115.4 s-1, and catalytic efficiency of 3.9 * 105 s-1 M-1, also showed an increase of 34% in product release when incubated in the presence of 1 mM CoCl2. This, is the first exo-arabinanase reported in the literature with thermophilic behavior and prolonged stability at acidic pHs. In the fermentation process the best abnt production was achieved using 3% (m/v) of the inducer under submerged culture conditions, and the scaling process did not affect the enzymatic production. The A. nidulans+pEXPYR expression system was able to produce the same amount of recombinant protein using as an inducer, a compound fifty fold less expensive then the normally used.

A biomassa lignocelulósica é uma fonte abundante de açúcares simples passíveis de serem fermentados em uma variedade de bioprodutos de maior valor agregado, além do etanol de segunda geração. Tal diversidade é relevante ao desenvolvimento e aprimoramento do conceito de biorrefinarias e da bioeconomia, em um viés mais amplo. Todavia, a elevada recalcitrância dos lignocelulósicos dificulta a sua sacarificação enzimática, resultando em bioprocessos mais onerosos. Por isso, coquetéis com diferentes enzimas ativas em carboidrato (CAZymes) são desenvolvidos, em busca de uma maior eficiência e melhor relação custo/benefício, para processos em larga escala. Dentre as CAZymes estudadas, encontram-se as mono-oxigenases líticas de polissacarídeo (LPMOs), tendo em vista a sua atestada capacidade de otimizar a hidrólise da lignocelulose, quando em sinergismo com diversas hidrolases. Levando isto em conta, selecionou-se, ao atual estudo, o ascomiceto termofílico Thermothelomyces thermophila (anteriormente denominado Myceliophthora thermophila), pois este tem se mostrado capaz de expressar e secretar ampla gama de LPMOs ativas em diferentes substratos. Objetivando-se estudar duas LPMOs derivadas deste organismo, as mesmas foram expressas, heterologamente, por Aspergillus nidulans linhagem A773, utilizando-se o vetor de expressão pEXPYR construído para viabilizar a secreção de altas concentrações de proteínas recombinantes. As proteínas heterólogas aqui analisadas foram denominadas TtLPMO1A9 e TtLPMO2A9. Embora ambas tenham sido capazes de gerar peróxido de hidrogênio na presença de oxigênio molecular e de um doador de elétrons, apenas TtLPMO2A9 apresentou atividade contra substratos celulósicos e bagaço de cana pré-tratado hidrotermicamente, atuando, em associação com hidrolases homemade e o preparo enzimático comercial Celluclast 1.5L, a degradação de tais materiais. / The lignocellulosic biomass is an abundant source of simple sugars that can be fermented to various value-added bio-based products. This diversity is seen as relevant to the improvement of biorefinery and bioeconomy concept. Nevertheless, the significant recalcitrance of lignocellulose imposes dificulties to its enzymatic saccharification, resulting in onerous bioprocessing. This scenario stimulates studies based on the development of efficient and cost-effective customizable carbohydrate-active enzyme (CAZymes) cocktails for large-scale processes. Among the available CAZymes, there are the lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), a set of oxidative proteins capable of optimizing the lignocellulose hydrolysis, when acting in synergism with various hydrolases. Based on this fact, in the current study, the thermophilic ascomycete Thermothelomyces thermophila (previously known as Myceliophthora thermophila) was adopted, because of its ability of expressing and secreting large amounts of LPMOs. Thus, two LPMOs derived from this fungus was heterologously produced by an expression system composed by Aspergillus nidulans strain A773 and the vector pEXPYR: an expression vector built to increase the secretion of recombinant proteins. The heterologous proteins herein analysed were termed as TtLPMO1A9 and TtLPMO2A9. Although both enzymes were able to produce hydrogen peroxide in the presence of molecular oxygen and an electron donor, only the second one was active in reactions with cellulosic substrates and hydrothermally pre-treated sugar cane bagasse. When tailor-made hydrolases and the commercial enzymatic mixture Celluclast 1.5L were supplemented with TtLPMO2A9, it was noticed na improvement of the deconstruction of the aforementioned substrates.