Inúmeras estratégias neuroprotetoras vêm sendo desenvolvidas para o tratamento da encefalopatia neonatal causada pela hipóxia-isquemia (HI). O enriquecimento ambiental (EA) é uma ferramenta que propicia interação social, estimulação visual, sensorial e atividade física de forma espontânea e assim induz mudanças comportamentais e neurofisiológicas. O objetivo desta tese foi investigar os efeitos do EA em relação à estrutura e expressão de proteínas constituintes da barreira hematoencefálica (BHE) e parâmetros bioquímicos de citocinas neuroinflamatórias no hipocampo em fases subsequentes do desenvolvimento. Ainda, o escopo comportamental desta tese foi analisar o efeito do EA precoce sobre a ansiedade demonstrada por ratos adultos submetidos à HI. Para tanto, ratos Wistar machos e fêmeas, no 7º dia pós-natal (DPN), foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal. Os animais foram divididos em quatro grupos: CTAP (controle ambiente padrão), CTAE (controle ambiente enriquecido), HIAP (hipóxia-isquemia ambiente padrão) e HIAE (hipóxia-isquemia ambiente enriquecido). Os animais dos grupos EA permaneceram no enriquecimento ambiental mantido desde o 8º DPN. Após o desmame os animais foram divididos em grupos e estimulados no EA (1 h/dia por 5 semanas). Análises da expressão de proteínas estruturantes da BHE no hipocampo (β-catenina, ocludina, conexina-43, aquaporina-4, transportador de glicose 1 - Glut-1 e proteína fibrilar glial ácida - GFAP) foram quantificadas através de Western Blotting (WB) Observamos a permeabilidade e integridade da BHE através da coloração com azul de Evans e também foi realizada imuno-histoquímica para GFAP na região 1 do corno de Ammon - CA1 do hipocampo no 22º e 60º DPN. Realizamos análises da expressão das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral alfa - TNF-α e interleucina 1 beta - IL-1β, juntamente com análise imuno-histoquímica para marcação de microglia ativada na fase adulta de animais HI submetidos ao EA. Ademais, foram avaliados os efeitos da HI e do EA sobre a ansiedade no primeiro dia de exposição dos animais ao labirinto em cruz elevado (LCE) e no teste claro/escuro (TCE). Os nossos dados mostraram que o EA foi efetivo para reverter as alterações causadas pela HI aumentando a expressão de ocludina no 22º DPN e de β- catenina e GFAP no 60º DPN e diminuindo o extravasamento de azul de Evans. No 8º DPN não há alteração na BHE, sendo sugestivo de imaturidade da BHE. A avaliação imuno-histoquímica de IbA-1 demonstra ativação microglial após HI e o perfil bioquímico apresenta grande expressão das citocinas IL-1β e TNF-α em animais hipóxico-isquêmicos estimulados em EA. Através dos níveis de ansiedade encontrados, podemos estabelecer que o EA favorece uma ação menos impulsiva reduzindo o comportamento de risco dos animais após a HI. Assim, nossos resultados contribuíram para a compreensão do mecanismo da HI, visto que apresentamos de forma singular que o EA é eficaz na recuperação da disfunção da BHE maximizando os efeitos neuroprotetores de IL-1β e TNF-α sobre aspectos comportamentais relacionados à ansiedade. / Several neuroprotective strategies have been developed for the treatment of the neonatal encephalopathy caused by hypoxic ischemia (HI).The environmental enrichment (EE) is a strategy that propitiates social interaction, visual and sensorial stimulation, and physical activity spontaneously and, thus, it causes behavioral and neurophysiological changes. The aim of this thesis was to investigate the effects of EE on the structure and expression of proteins in the blood-brain barrier (BBB) and biochemical parameters of neuroinflammatory cytokines in the hippocampus in subsequent developmental stages. Moreover, the behavioral scope of this thesis was to analyze the effect of early EE on anxiety expressed by adult rats. Male and female Wistar rats, PND 7, were submitted to the Levine-Rice model of neonatal HI. The animals were divided into four groups: CSE (control - standard environment), CEE (control - enriched environment), HISE (hypoxic ischemia - standard environment) and HIEE (hypoxic ischemia - enriched environment). The animals of the EE groups were kept in the environmental enrichment since PND 8. After weaning, the animals were divided into groups and exposed to the EE (1h a day for 5 weeks). Expression analyses of the BBB structural proteins in the hippocampus (β-catenin, occludin, connexin-43, aquaporin-4, Glut-1, and GFAP) were quantified by Western Blotting (WB) We observed the BBB permeability and integrity through Evans blue staining as well as immunohistochemistry for GFAP in the CA1 hippocampus region on PND 22, and 60. We performed analyzes of the expression of the inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β, together with immunohistochemical analysis for quantification of IbA-1 in the adult phase of HI animals submitted to EE.Furthermore, the effects of the HI and the EE on anxiety on the first day of exposition to the elevated plus maze test (EPM) and the light-dark box test (LDB) were assessed. Our data have shown that the HI reduces occludin expression on PND 22 and β-catenin and GFAP on PND 60along with the extravasation of Evans blue, indicating BBB dysfunction in these periods and reversion of the alterations by the EE. On PND 8, there is no BBB change, which is suggestive of BBB immaturity. The immunohistochemicalassessment of IbA-1 demonstrates microglial activation after HI and the biochemical profile shows great expression of IL-1β and TNF-α cytokines in hypoxic-ischemic animals stimulated in EE. Through the levels of anxiety found, we can establish that the EE favors a less impulsive behavior and reduces the anxiogenic factor of animals after HI. Thus, our results have contributed to the understanding of the HI mechanism; we presented in a unique way the recovery of the BBB dysfunction and the maximization of the neuroprotective effects of IL-1β and TNF-α on behavioral aspects related to anxiety of animals exposed to the EE after HI.

This study aimed to develop and implement a therapeutic hypothermia protocol in newborns with Hipoxic Ischemic Encephalopathy and compare the short term outcomes with a historical control group. Therefore, this study was divided in two parts: the first one consisted in a literature review in order to develop an hypothermia protocol. In the second part this protocol was applied in all neonates with moderate or severe Hypoxic Ischemic Encephalopathy admitted to the Neonatal Intensive Care Unit of Santa Maria University Hospital. The hypothermia protocol, which consisted in reducing axillary temperature of the newborn to 33.2ºC for a period of 72 hours, was applied in 6 neonates with Hypoxic Ischemic Encephalopathy admitted to the Neonatal Intensive Care Unit between September 2012 to March 2013. Outcomes during the hospital course and status at discharge (mortality, length of stay and disabilities) were compared with a historical control group. For this, data from 18 newborns with Hipoxic Ischemic Encephalopathy admitted at the same unit from 2003 to 2011 were collected from medical records. Disabilities were defined as any of the following: use of antiepileptic drugs, use of feeding tube, abnormalities in the neurological examination. Hypothermia group had a higher incidence of hypotension (p = 0.001), coagulopathy (p = 0.000) and bleeding (p = 0.001) during the procedure but they did not result in major adverse events. The mortality rate was significantly lower in hypothermia group (p = 0.02) as well as the presence of disabilities at hospital discharge (p = 0.04). We concluded that therapeutic hypothermia for treatment of Hypoxic Ischemic Encephalopathy in newborn infants seems to be a safe and effective procedure having a significant impact on the mortality rate and improving the neurodevelopmental in short term. / Este trabalho teve como objetivo desenvolver e aplicar um protocolo de hipotermia terapêutica em recém-nascidos com Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica, comparando os desfechos a curto prazo com um grupo controle histórico. Para tanto, o estudo foi dividido em duas etapas: na primeira, foi realizada uma pesquisa bibliográfica sobre o assunto, de modo a desenvolver um protocolo para a aplicação de hipotermia. A segunda etapa correspondeu à aplicação do referido protocolo nos recém-nascidos com diagnóstico de Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica moderada ou grave internados na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital Universitário de Santa Maria. O protocolo de hipotermia, que consistia em reduzir a temperatura axilar do recém-nascido a 33,2ºC por um período de 72 horas, foi aplicado em seis recém-nascidos com Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica que foram admitidos na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal, no período entre setembro de 2012 e março de 2013. As variáveis clínicas durante a internação e os desfechos na alta (mortalidade, tempo de internação e presença de desabilidades) foram comparados a um grupo controle histórico constituído por 18 recém-nascidos com Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica, cujos dados foram coletados de prontuários referentes ao período de 2003 a 2011. A presença de desabilidades foi definida pelo uso de fármacos antiepilépticos, uso de sonda para alimentação e/ou alterações ao exame neurológico no momento da alta hospitalar. Os recém-nascidos submetidos à hipotermia apresentaram maior incidência de hipotensão (p = 0,001), alterações da coagulação (p = 0,000) e sangramento (p = 0,001) durante o procedimento, mas que não resultaram em eventos adversos maiores. A mortalidade foi no grupo de crianças submetidas à hipotermia (p = 0,002), bem como a presença de desabilidades (p = 0,04). Este estudo permitiu concluir que a hipotermia terapêutica para tratamento da Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica, nesse pequeno grupo estudado, mostrou ser um procedimento seguro e eficaz, tendo reduzido significativamente a taxa de mortalidade e melhorado o neurodesenvolvimento a curto prazo.

Objetivo: Avaliar os níveis plasmáticos e liqüóricos de IL-6 e TNF-α em recém- -nascidos a termo com Encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI), comparando-os com recém- -nascidos a termo sépticos sem meningite e sem EHI e com recém-nascidos controles. Método: Foi realizado um estudo de caso-controle com três grupos de recém-nas-cidos a termo: grupo I, 20 recém-nascidos controles com escore de Apgar ≥ 9 no primeiro e quinto minutos de vida; grupo II, 19 recém-nascidos sépticos, sem meningite, com escore de Apgar ≥ 9 no primeiro e quinto minutos de vida; grupo III, 19 recém-nascidos asfixiados ca-racterizados pelo escore de Apgar ≤ 4 e ≤ 6 no primeiro e quinto minutos de vida, respecti-vamente, pH umbilical < 7,20 e/ou lactato arterial umbilical > 3,0 mmol/L, e necessidade de ventilação com pressão positiva pelo menos durante 2 minutos após o nascimento. Foram coletadas amostras de sangue e de líqüor nas primeiras 48 horas de vida para determinação dos níveis de IL-6 e TNF-α pela técnica de enzimoimunoensaio, utilizando-se kits R & D Systems. Resultados: Os três grupos foram semelhantes quanto ao peso de nascimento, ida-de gestacional, classificação peso/ idade gestacional, tipo de parto e tempo médio da coleta de sangue e líqüor. As medianas dos níveis plasmáticos de IL-6 foram semelhantes entre sépticos e asfixiados e significativamente superiores aos controles (p < 0,0001). A mediana do TNF-α plasmático foi semelhante nos recém-nascidos asfixiados e controles, significativamente in-ferior a dos sépticos (p < 0,00001). Nos recém-nascidos asfixiados, as medianas dos níveis liqüóricos da IL-6 e do TNF-α foram significativamente mais elevadas do que nos sépticos e nos controles. A mediana da IL-6 liqüórica foi significativamente mais elevada nos sépticos que nos controles e a mediana do TNF-α liqüórico foi semelhante nos sépticos e controles. As relações líqüor/plasma para IL-6 e TNF-α foram semelhantes nos sépticos e controles, e menores que nos asfixiados (p < 0,0002 para IL-6, p < 0,00001 para TNF-α). Conclusões: 1) Recém-nascidos a termo com EHI apresentam níveis elevados de IL-6 e TNF-α no líqüor. 2) IL-6 plasmática encontra-se elevada nos recém-nascidos asfixia-dos e nos sépticos. 3) TNF-α plasmático é elevado somente nos recém-nascidos com sepse. 4) A maior relação líqüor/plasma para IL-6 e TNF-α nos recém-nascidos asfixiados sugere uma produção local intra-cerebral dessas citocinas nos recém-nascidos a termo com EHI.

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do enriquecimento ambiental (EA) sobre a memória e a morfologia hipocampal, estriatal e cortical, estado oxidativo e níveis do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF), em ratos Wistar submetidos à hipóxia-isquemia (HI) neonatal. No capítulo 1 foram examinados os efeitos do EA sobre o prejuízo na memória observado no labirinto aquático de Morris (LAM) e sobre a atrofia hipocampal e cortical em animais hipóxicos-isquêmicos adultos. Ratos Wistar machos, no 7º dia pós-natal (DPN) foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal, no qual a artéria carótida comum direita é ocluída permanentemente e, na seqüência, os animais foram mantidos em uma atmosfera hipóxica (90 min, 8% O2-92% N2). Duas semanas após a HI, os animais foram estimulados em um ambiente enriquecido (1h/dia, por 9 semanas). No LAM, os animais HI mantidos em ambiente padrão apresentaram pior performance quando comparados aos grupos CT e o grupo HI enriquecido teve mesmo comportamento que os grupos CT. Uma significante atrofia hipocampal e cortical foi identificada nos animais hipóxico-isquêmicos, porém, nesta análise, o EA não resultou em proteção significativa. O capítulo 2 teve como intuito investigar se a manutenção em ambiente enriquecido precocemente (8º-30 DPN) seria efetiva na recuperação da atrofia hipocampal pela HI, e, se os efeitos cognitivos vistos no EA diário seriam extensivos a outro tipo de memória e, também a outros períodos do desenvolvimento. Ratos e ratas Wistar machos foram submetidos à HI (conforme descrito acima) e, no dia seguinte, foram colocados em um ambiente enriquecido. Na seqüência, a memória de reconhecimento, no teste de reconhecimento de objetos e a memória espacial no LAM são analisadas. Na vida adulta, os animais foram submetidos a mais uma sessão experimental no LAM. O déficit cognitivo observado na memória de reconhecimento nos animais HI foi revertido pela estimulação. Porém, o prejuízo na memória espacial foi parcialmente revertido pelo EA; a memória de trabalho nas fêmeas, no período da adolescência, foi mais claramente beneficiada por este efeito. E, corroborando os resultados do primeiro experimento, a HI resultou em dano tecidual ao hipocampo e também ao estriado, sem indicação de efeito significativo pela estimulação. O capítulo 3 teve como objetivo investigar se a modulação do estado oxidativo e os níveis de BDNF cerebrais podem estar envolvidos no efeito neuroprotetor cognitivo do EA em animais adultos submetidos à HI. Ratos Wistar machos foram utilizados neste experimento; os procedimentos de HI e EA foram os mesmos do primeiro experimento. Os animais foram sacrificados 24 horas após o término do período de enriquecimento (85º DPN), quando hipocampo e córtex foram dissecados para a posterior determinação dos parâmetros de estresse oxidativo (quantificação de radicais livres, dano em macromoléculas e atividade da enzima superóxido dismutase - SOD) e dos níveis de BDNF. Os resultados demonstraram uma diminuição na quantidade de radicais livres no hipocampo esquerdo dos animais HI e um aumento destes níveis no córtex direito; e, também, um aumento na atividade da SOD no hipocampo direito dos animais HI e uma diminuição desta atividade no hipocampo esquerdo nos animais não estimulados. Além disso, os níveis de BDNF foram aumentados no hipocampo dos animais HI mantidos em ambiente padrão. Estes resultados sugerem que o efeito neuroprotetor cognitivo do EA diário pode não ser dependente da expressão de BDNF nem do estado oxidativo do hipocampo e córtex. / This study was undertaken to investigate the environmental enrichment (EE) effects over memory function and hippocampus and cortex morphology, oxidative status and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels, consequent to neonatal hypoxiaischemia (HI) in Wistar rats. The objective of chapter 1 was to examine, in adulthood, the effects of daily EE on memory deficits in the Morris water maze (MWM) and hippocampal and cerebral damage, caused by neonatal HI. Male wistar rats at the 7th postnatal day were submitted to the Levine-Rice model of neonatal HI, comprising permanent occlusion of the right common carotid artery and a period of hypoxia (90 min, 8%O2-92%N2). Two weeks after the HI event, animals were stimulated by the enriched environment (1h/day for 9 weeks). In the MWM, non-stimulated HI animals had worse performance than controls and HI-enriched rats showed memory performance as good as that of controls. There was a reduction of both hippocampal volume and cortical area, ipsilateral to arterial occlusion, in HI animals; EE did not affect these morphological measurements, despite its clear cognitive neuroprotective effect. The chapter 2 investigated whether early continuous housing in an enriched environment would be effective in recovering hippocampal atrophy consequent to the neonatal HI, as well as if the benefits of continuous EE would extending to other memory types, both in adult and adolescent female and male rats. As described above, animals were submitted to HI and, starting 1day after the event, they were housed in an enriched environment (8th-30th PN day). Performances of animals in the novel-object recognition were assessed in the adolescence period and in the MWM task in the adolescence and, again, in adulthood. Cognitive deficits arising after neonatal HI in the novel-object recognition test were completely recovered by the environmental stimulation, in animals of both genders. However, spatial memory impairment in the MWM was partially prevented by EE; the effect was observed especially in female adolescent rats on the working memory. Corroborating the findings of the first experiment, there was no enrichment effect over hippocampus volume and striatum area. These data indicate that early housing in an enriched environment recovered performance in the object recognition task and, in adolescent females, in the working memory spatial task after a neonatal hypoxicischemic event. No effects of enrichment were revealed in adult animal performance nor in tissue atrophy of hippocampus and striatum consequent to HI. The chapter 3 was designed to investigate whether the modulation of brain oxidative status and/or BDNF content in adulthood are involved in functional neuroprotection caused by EE after neonatal HI. Protocols of the HI and EE utilized in this experiment were the same as of the first experiment. Male rats were sacrificed 24 hours after the enrichment period, i.e., at PN day 85. We have determined BDNF levels and several oxidative stress parameters, specifically the free radicals levels, macromolecules damage and superoxide dismutase (SOD) activity, in hippocampus and frontal cortex samples. It was found a decrease in free radical content in the left hippocampus of HI animals and an increase in non-stimulated rats in the right cortex; also, increased SOD activity in the right hippocampus of HI and a decrease of enzyme activity in the left hippocampus of stimulated groups were found. Moreover, BDNF levels were increased in the hippocampus of the non-stimulated HI group. These results suggest that the neuroprotective cognitive effect of daily environmental enrichment may not be dependent on BDNF expression nor on the oxidative status in hippocampus and cortex.

A hipóxia-isquemia (HI) é a principal causa de mortalidade no período perinatal e, nos sobreviventes, a incidência de seqüelas neurológicas é elevada. O encéfalo imaturo, altamente susceptível ao insulto hipóxico-isquêmico, é vulnerável a estímulos ambientais tais como o enriquecimento ambiental (EA). O objetivo deste estudo foi investigar o desempenho comportamental no teste do campo-aberto, reconhecimento de objetos, esquiva-inibitória e no rota-rod, bem como a densidade de espinhos dendríticos no hipocampo, utilizando o método de Golgi, em ratos submetidos à HI e expostos ao EA (1h/dia, 6 dias/semana, 9 semanas). Ratos de 7 dias de idade foram submetidos ao procedimento de HI e divididos em 4 grupos experimentais: controle mantido em ambiente padrão (CTAP), controle em ambiente enriquecido (CTAE), HI em ambiente padrão (HIAP) e HI em ambiente enriquecido (HIAE). Parâmetros comportamentais e morfológicos foram avaliados após 9 semanas de estimulação ambiental. Os dados indicaram que a memória de reconhecimento de objetos foi prejudicada em ratos HI adultos e recuperada após a estimulação pelo ambiente enriquecido; no teste de esquiva-inibitória os animais apresentaramum prejuízo na memória aversiva em animais HI, independentemente do ambiente. Surpreendentemente, no teste do campo-aberto, um maior número de crossings foi identificado nos grupos HI no primeiro minuto quando comparados aos grupos controle. No teste de rota-rod não foram detectadas diferenças entre animais controle e animais HI. Resultados morfológicos demonstraram uma diminuição na densidade de espinhos dendríticos no hipocampo de animais HI, com recuperação pelo EA. A densidade de espinhos dendríticos do hemisfério esquerdo (contralateral à oclusão arterial) obteve os melhores resultados, indicando uma recuperação total do dano hipóxico-isquêmico pelo EA. Os dados dos espinhos dendríticos do hemisfério direito indicaram uma recuperação parcial pela estimulação ambiental nos animais HI. Concluindo, o enriquecimento ambiental foi efetivo na recuperação do déficit comportamental e da densidade de espinhos dendríticos nos neurônios hipocampais conseqüente à hipóxia-isquemia neonatal em ratos. / Hypoxia-ischemia (HI) is the main mortality cause in perinatal period and, in survivors, the incidence of neurological disabilities is elevated. The immature brain, highly susceptible to hypoxic-ischemic insult, is responsive to environmental stimuli, as environmental enrichment (EE). The aim of this study was to investigate behavioral performance in the open field apparatus, objects recognition, inhibitory avoidance and in the Rota-rod apparatus, and dendritic spines density in the hippocampus, using the Golgi technique, in rats submitted to the HI and exposed to EE (1h/day, 6 days/week, 9 weeks). Seven-days old rats were submitted to the HI procedure and divided in 4 groups: control in standard conditions (CTSE), control in enriched environment (CTEE), HI in standard conditions (HISE) and HI in enriched environment (HIEE). Behavioral and morphological parameters were evaluated after 9 weeks of environmental stimulation. Data indicated that object-recognition memory was impaired in HI adult rats and recovered after stimulation by the EE; in the inhibitory avoidance task was demonstrated aversive memory impairment in HI animals, independent of the environment. Interestingly, in the open field task, significant more crossing responses were identified in HI groups, in the first minute, comparing to control groups. No differences between control and HI adult animals were detected in the rota-rod test. Morphological results demonstrated a decreased spines density in the hippocampus of the HI animals, with recovery by the EE. Dendritic spines density from left hemisphere (contralateral to arterial occlusion) obtained the better results, indicating a total recovery effect of the EE on HI damage. Data of dendritic spines from right hemisphere indicated a partial recovery by the environmental stimulation on HI animals. Concluding, environmental enrichment was effective in recovery behavioral impairment and dendritic spine density in hippocampal neurons, consequent to neonatal hypoxia-ischemia in rats.

Os mecanismos envolvidos nas atividades toxicológicas e/ou farmacológicas dos compostos orgânicos de selênio são pouco conhecidos. Os compostos orgânicos de selênio (disseleneto de difenila e ebselen) e organotelúrio (ditelureto de difenila) foram alvo dos trabalhos realizados“in vitro”, neste estudo. Os compostos organocalcogênios apresentaram efeitos diversos sobre o influxo de 45Ca2+ medido em sinaptossomas de cérebro de rato, dependendo das condições e agentes despolarizantes usados. Ebselen, (PhSe)2 e (PhTe)2 alteram a captação de 45Ca2+ de maneira distinta quando expostos a aminopiridina ou KCl. Enquanto (PhTe)2 inibe a captação de cálcio em todas as condições experimentadas, (PhSe)2, apresenta este efeito apenas quando incubado em condições basais ou sob a ação de aminopiridina. Ebselen, por sua vez, aumenta a captação de cálcio em altas concentrações em condições basais e sob a ação de aminopiridina, porém, apresenta efeito inverso quando os sinaptossomas são despolarizados por KCl. Ebselen evitou a inibição da captação de 45Ca2+ “in vitro” provocada por cloreto de mercúrio(HgCl) em sinaptossomas de cérebro de rato em condições basais do ensaio, no entanto, ebselen não afetou a inibição da captação de glutamato “in vitro” por HgCl, indicando que ebselen pode atuar dependendo das proteínas-alvo consideradas.Os compostos de mercúrio, MeHg e HgCl, inibiram a captação de glutamato em córtex cerebral de ratos de 17 dias e ebselen reverteu somente o efeito do MeHg porém, não, o do HgCl. Disseleneto de difenila não alterou os parâmetros avaliados na exposição de ambos os compostos de mercúrio.Os compostos de mercúrio estudados provocaram a morte celular das fatias de córtex, porém, ebselen protegeu as fatias dos efeitos lesivos provocados por MeHg e não pelo HgCl.

A participação de marcadores bioquímicos na avaliação de quadros de asfixia neonatal é cada vez mais relevante. A proteína S100B tem um papel destacado nestas pesquisas. O objetivo deste estudo foi procurar destacar a importância da proteína S100B na avaliação de recém-nascidos a termo com quadros de encefalopatia hipóxico-isquêmica, assim como correlacionar com outras substâncias que também participam do processo isquêmico. Foram analisados 21 casos de recém-nascidos a termo que desenvolveram quadro de encefalopatia hipóxico-isquêmica, no período de setembro de 2003 a outubro de 2004. Realizadas coletas no 1º e 4º dia de vida e dosadas, por método imunocitoquímico, a proteína S100B e o lactato. Foi possível detectar uma correlação positiva entre as 2 substâncias, assim como, quando comparadas entre si, observou-se também significância estatística. / Biochemical markers have played an increasingly relevant role in the assessment of neonatal asphyxia. The S100B protein is particularly important in research conducted in this field. The purpose of this study was to underline the importance of S100B protein in the assessment of term newborn infants with hypoxic ischemic encephalopathy, as well as to relate it to other substances also involved in the ischemic process. An assessment was made from September 2003 to October 2004 of twenty-one term newborn infants who developed hypoxic ischemic encephalopathy. Samples were collected on the 1st and 4th day of life and S100B protein and lactate levels were calculated using the immune cytochemical method. A positive relationship was found between the 2 substances. Additionally, a comparison between the two substances showed a statistically significant correlation.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A diminuição do aporte de oxigênio e nutrientes na vida perinatal resulta em danos, como astrogliose, morte de neurônios e de células proliferativas. Déficits cognitivos podem estar relacionados a danos no hipocampo. Neste trabalho avaliamos a citoarquitetura do giro dentado (DG) durante o desenvolvimento e a memória de ratos submetidos à HI. Para tal, utilizamos a técnica de imunohistoquímica para marcador de proliferação celular (KI67), neurônio jovem (DCX), de astrócitos (GFAP) e de óxido nítrico sintase neuronal (NOSn). Para avaliar a memória de curta e de longa duração foi utilizado o teste de reconhecimento de objetos (RO). Ratas Wistar grávidas em E18 foram anestesiadas (tribromoetanol) e as quatro artérias uterinas foram ocluídas com grampos de aneurisma (Grupo HI). Após 45 minutos, os grampos foram removidos e foi feita a sutura por planos anatômicos. Os animais do grupo controle (SHAM) sofreram o mesmo procedimento, excetuando a oclusão das artérias. Os animais nasceram a termo. Animais com idades de 7 a 90 dias pós-natal (P7 a P90), foram anestesiados e perfundido-fixados com paraformaldeído a 4%, e os encéfalos submetidos ao processamento histológico. Cortes coronais do hipocampo (20m) foram submetidos à imunohistoquímica para KI67, DCX, GFAP e NOSn. Animais P90 foram submetidos ao RO. Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética (CEA/019/2010). Observamos menor imunomarcação para KI67 no giro dentado de animais HI em P7. Para a marcação de DCX nesta idade não foi observada diferença entre os grupos. Animais HI em P15, P20 e P45 tiveram menor imunomarcação para DCX e Ki67 na camada granular. Animais P90 de ambos os grupos não apresentaram marcação para KI67 e DCX. Vimos aumento da imunomarcação para GFAP nos animais HI em todas as idades. A imunomarcação para NOSn nos animais HI foi menor em todas as idades. O maior número de células NOSn positivas foi visto em animais P7 em ambos os grupos na camada polimórfica. Em P15, animais HI apresentam células NOSn+ em todo o DG. Em P30 animais HI apresentam células NOSn+ nas camadas polimórfica e sub-granular. Animais adultos (P90) de ambos os grupos apresentam células NOSn positivas apenas nas camadas granular e sub-granular. Embora animais HI P90 não apresentaram déficits de memória, estes apresentaram menor tempo de exploração do objeto. Comportamento correspondente a déficits de atenção em humanos. Nossos resultados sugerem que HI perinatal diminui a população de células proliferativas, de neurônios jovens, de neurônios NOSn+, além de causar astrogliose e possivelmente déficits de atenção. O modelo demonstrou ser útil para a compreensão dos mecanismos celulares das lesões hipóxico-isquêmicas e pode ser usado para testar estratégias terapêuticas. / The supply of oxygen and nutrients decreasing in perinatal life may results in CNS damage such as deficits in memory and attention and increased susceptibility to epileptic disorders in adulthood. Perinatal hypoxia-ischemia ( HI ) results in astrogliosis in white matter and loss of cortical neurons (Robinson et al, 2005). Cognitive deficits may be related to hippocampal damage. In this study we evaluate the cytoarchitecture of the dentate gyrus (DG) during development and memory in rats submeted to HI. We used the immunohistochemistry marker of cell proliferation (Ki67), young neuron (DCX), astrocytes (GFAP) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS). To evaluate the short-memory and long-lasting the recognition of objects (RO) test was used. Pregnant Wistar rats on E18 were anesthetized (tribromoethanol) and the four uterine arteries were occluded with aneurysm clips (Group HI). After 45 minutes, the clips were removed and the incision was sutured to the anatomical planes. The control group (SHAM) underwent the same procedure, except the occlusion of arteries. The animals were born at term. Animals aged 7 to 90 days postnatal (P7 to P90) were anesthetized and perfused-fixed with 4% paraformaldehyde, and their brains were subjected to histological processing. Coronal sections of the hippocampus (20&#956;m) were subjected to immunohistochemistry for Ki67, DCX, GFAP and nNOS. Animals were subjected to RO P90. The procedures were approved by the ethics committee ( CEA/019/2010 ). We observed lower Ki67 immunostaining in the dentate gyrus of animals HI at P7. For marking DCX at this age is no difference between the groups was observed. HI animals at P15, P20 and P45 had less immunostaining for DCX and Ki67 in the granular layer. Animals P90 in both groups showed no labeling for Ki67 and DCX. We have seen an increase in GFAP immunostaining HI in animals at any age. The immunostaining for nNOS in HI animals was lower at all ages. The greater number of positive cells was seen in nNOS P7 animals in both groups in the polymorphic layer. In P15 animals HI nNOS + cells present in the whole DG. In P30 animals HI feature nNOS + cells in the polymorphic layer and sub-granular. Adult animals (P90) of both groups have positive nNOS granular cell layers, and only in the sub-granular. Although HI P90 animals showed no memory deficits, these patients had shorter holding the object. Corresponding to attention deficits in human behavior. Our results suggest that perinatal HI decreases the population of proliferative cells, young neurons, nNOS+ neurons, and astrocytic and possibly cause attention deficits. The model proved to be useful for understanding the cellular mechanisms of hypoxic- ischemic injury and can be used to test therapeutic strategies.

A encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal, ou simplesmente hipóxia-isquemia (HI) neonatal, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em neonatos humanos. De 20% a 50% dos recém-nascidos com HI severa morrem no período perinatal. Quando sobrevivem, 25% apresentam deficiências neuropsicológicas, como dificuldade de aprendizado, epilepsia e paralisia cerebral. Devido a isso, a eficácia de possíveis agentes neuroprotetores tem sido testada em modelos animais. Há razão para se pensar que a progesterona tem um forte potencial para o tratamento da HI neonatal, já que a sua utilização tem se mostrado benéfica em pesquisas relacionadas com lesão cerebral traumática, lesão cerebral isquêmica e outros modelos de lesão do sistema nervoso central (SNC) em adultos. Inúmeros estudos têm mostrado que o modelo animal de HI de Rice e Vannucci (1981) em animais neonatos, utilizado no presente trabalho, pode produzir lesões no sistema nervoso central relativamente previsíveis, e que estas lesões encefálicas parecem semelhantes às observadas clinicamente em humanos (SALMASO et al., 2014). Para a realização do modelo de HI foram utilizados ratos Wistar com idade de 7 dias (P7). Após a oclusão da carótida esquerda, os animais foram colocados em câmaras para exposição à atmosfera hipóxica com 8% O2/92% N2 por 90 minutos. Os animais foram divididos em cinco grupos experimentais: SHAM, HI, HI+PROG-PRÉ (PRÉ), HI+PROG-PÓS (PÓS), HI+PROG-PRÉ/PÓS (PP). Os termos PRÉ e PÓS referem-se à administração de progesterona (na dose de 5 mg/kg) antes ou após o procedimento de HI neonatal . Dependendo do grupo experimental, os animais foram tratados com progesterona imediatamente antes da isquemia e/ou 6 e 24 horas após o início da hipóxia. Foram analisados o peso corporal dos animais (imediatamente antes da isquemia e 6, 24 e 48 horas após o início da hipóxia), o volume de lesão cerebral, além da expressão das proteínas p-Akt e caspase-3 pela técnica de Western blotting. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy or simply neonatal hypoxia-ischemia (HI) is a main cause of morbidity and mortality in human neonates. Moreover, 25% of survivors show neuropsychological dysfunctions such as learning difficulties, epilepsy and cerebral palsy. Because of this, the effectiveness of potential neuroprotective agents has been tested in animal models. There is a reason to suppose that progesterone has a strong potential for the treatment of neonatal HI since its use has been shown to be beneficial in researches related to traumatic brain injury, ischemic brain injury and other central nervous system injury models (CNS) in adults. Several studies have shown that the newborn animal model of HI developed by Rice and Vannucci (1981), and used in the present study, can produce lesions in the central nervous system which are predictable and similar to those observed clinically in humans. In order to perform the HI model we used 7 days old (P7) Wistar rats. After occlusion of the left carotid, the animals were placed in hypoxic chambers and exposed to the hypoxic atmosphere (8% O2/92% N2 for 90 minutes). The animals were divided into five groups: SHAM, HI, HI+PROG-PRÉ (PRÉ), HI+PROG-PÓS (PÓS), HI+PROG-PRÉ/PÓS (PP).The PRÉ and PÓS terms refer to the administration of progesterone (5 mg/kg) before and/or after the HI procedure. Progesterone was administered immediately before ischemia, 6 and 24 hours after the beginning of hypoxia, depending on the experimental group. Body weight was evaluated immediately before ischemia and/or 6 and 24 hours after the start of hypoxia. The volume of brain damage, in addition to the expression of p-Akt and caspase-3 were also evaluated.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) faz parte da etiologia de diversas patologias neurológicas e é causa de graves sequelas. Os mecanismos patofisiológicos dessa lesão começam com o insulto imediato após a HI e se estendem por dias ou semanas, pelo aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio associada a redução da defesas anti-oxidantes e reação glial, sendo a lesão secundária parte crucial no processo que culmina no dano final. A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) que parece ter uma importante ação neuroprotetora após a HI. A acetilcolinaesterase (AChE) é responsável pela degradação da ACh, inibidores dessa enzima vêm sendo utilizados para o tratamento de danos neurológicos. Sua ação positiva sobre a HI foi demonstrada em estudos realizados em nosso laboratório, onde a administração do extrato de Huperzia quadrifariata (inibidor de AChE) reduziu os déficits cognitivos e histológicos causados por essa lesão Para avaliar os efeitos das administrações pré e pós-hipóxia de galantamina, inibidor da AChE, no modelo de HI perinatal, ratos Wistar no 7º dia de vida pós-natal (DPN7) foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) durante 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de galantamina nos grupos HI+Galantamina 5 mg/kg pré-hipóxia (HIG5-Pré), HI+Galantamina 10 mg/kg pré-hipóxia (HIG10-Pré), HI+Galantamina 5 mg/kg pós-hipóxia (HIG5-Pós) e HI+Galantamina 10 mg/kg pós-hipóxia (HIG10-Pós). Os grupos Pré receberam galantamina imediatamente antes da hipóxia e os grupos Pós nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia. No DPN45 foi feita a análise do volume das estruturas encefálicas que demonstrou a redução do volume do hipocampo do grupo HIS em relação ao Sham e uma prevenção desse efeito no grupo HIG10-Pré, mas não nos demais grupos. Análises bioquímicas foram feitas no hipocampo ipsilesional 24 horas após a lesão e revelaram: através da citometria de fluxo uma redução na sobrevivência de neurônios no grupo HIS em relação ao Sham que foi prevenida no grupo HIG10-Pré; através de ELISA uma hipertrofia dos astrócitos no grupo HIS que foi revertida no grupo HIG10-Pré e um aumento na atividade da enzima anti-oxidante catalase. O tratamento pré-hipóxia com galantamina foi capaz de prevenir os déficits histológicos, aumentar a sobrevivência celular, reduzir a reação astrocitária e aumentar a atividade anti-oxidante em ratos submetidos à HI. / Neonatal hypoxia ischemia (HI) has a role in etiology of several neurological pathologies and causes severe sequelae. The pathophysiological mechanisms of this lesion start immediately after HI and last for days or weeks, with the secondary injury being a crucial part the process that culminates in the final damage. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter of the central nervous system that seems to have an important neuroprotective action after HI. Acetylcholinesterase (AChE) degradates ACh and inhibitors of this enzyme have been used to treat neurological damage. Its positive action on HI has been demonstrated in studies performed in our laboratory, where the administration of the alkaloid extract of Huperzia quadrifariata (An inhibitor of AChE) reduced the cognitive and histological deficits caused by this lesion. To evaluate the effects of the pre and post-hypoxia administrations of galantamine, a cholinesterase inhibitor, in the model oh perinatal HI, Wistar rats in the post-natal day 7 (PND7) were subjected to a combination of unilateral occlusion of the right charotid artery and of exposure to a hypoxic exposure (8% O2) for 60 minutes. Intraperitoneal injections of saline in the groups Sham anf HI+Saline (HIS) and of galantamine in the groups HI+Galantamine 5 mg/kg pre-hypoxia (HIG5-Pre), HI+Galantamine 10 mg/kg pre-hypoxia (HIG10-Pre), HI+Galantamine 5 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post) and HI+Galantamine 10 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post). The Pre groups received galantamine immediately before hypoxia and the Post groups in the intervals of 1, 24, 48 and 72 hours after HI. On PND45 the analysis of the volume of brain structures showed a reduction of the volume of the ipsilesional hippocampus in the HIS group when compared to the sham and a prevention of this effect in the HIG10-Pre, but not in any other group. Biochemical analysis was performed in the ipsilesional hippocampus 24 hours after the lesion and revealed: a reduction of the number of surviving neurons in the HIS group when compared to the Sham that was prevented in the HIG10-Pre; a hypertrophy of the astrocytes in the HIS group that was prevented in the HIG10-Pre group and an increase in the activity of the anti-oxidant enzyme catalase in the HIG10-Pre group. The treatment with galantamine was able to prevent the histological deficits, increase the survival of neurons, reduce astrocytic reaction and increase the anti-oxidant activity in rats submitted to HI.