A encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal é a causa mais importante de dano cerebral que ocorre no período de desenvolvimento e maturação causando à criança sequelas neurológicas de grande impacto ao longo da vida. O ambiente é um importante aliado no processo de reabilitação neuropediátrica, sendo muito utilizado pelos profissionais da saúde. Estímulos ambientais podem servir como estratégia de tratamento e inúmeros estudos têm demonstrado o seu potencial neuroprotetor. Este trabalho teve por objetivo avaliar o comportamento motor em dois momentos do desenvolvimento e os possíveis benefícios do enriquecimento ambiental em ratos submetidos à hipóxia-isquemia cerebral neonatal. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos a um modelo de lesão hipóxico-isquêmica encefálica neonatal no 7º dia pós-natal. Em um primeiro momento, foram avaliados com 22 dias e 42 dias de vida, e num segundo momento, foram submetidos a um protocolo de enriquecimento ambiental que iniciava no 8º dia de vida. Para avaliação do comportamento motor foi utilizado o teste de suspensão na barra, teste rota Rod e teste da caminhada na escada horizontal. Os animais não apresentaram alterações sensoriomotoras com 22 dias de vida, porém com 42 dias as alterações foram significativas. O enriquecimento ambiental promoveu uma recuperação parcial dos déficits motores em ratos machos quanto à latência de queda no teste da barra e no Rota Rod. As fêmeas demonstraram um melhor aproveitamento do ambiente enriquecido que lhes proporcionou uma melhor performance no teste da caminhada e uma curva de aprendizado no teste Rota Rod. Quanto à morfologia, o enriquecimento ambiental não foi capaz de promover modificações significativas no dano hipocampal e estriatal. Com base nos nossos resultados, podemos concluir que tanto animais com 22 DPN como com 42 DPN apresentaram alterações sensoriomotoras promovidas pela HIE neonatal e são influenciadas pelo gênero. O enriquecimento ambiental teve efeito neuroprotetor, melhorando o desempenho motor sem alterações morfológicas significativas. / The neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy is the most important cause of brain damage that occurs during development and maturation, causing neurological damage to the child with a big impact throughout the life. The environment is important in the process of neuropediatric rehabilitation and is widely used by health professionals. Enriched environmental serve as a treatment strategy and several studies have demonstrated its effects neuroprotective. This study aimed to evaluate motor behavior in two stages of development and the possible benefits of environmental enrichment in rats with neonatal cerebral hypoxia-ischemia. Male and female Wistar rats were subjected to a model of hypoxic-ischemic neonatal brain at the 7th postnatal day. At first, were evaluated 22 days and 42 days of life, and subsequently, underwent a protocol of environmental enrichment that began on the 8th day of life. For evaluation of motor behavior test was used to Grip Test, Rota Rod test and ladder walking test. The animals no showed sensorimotor disturbance with 22 days of life but with 42 days the changes were significant. Environmental enrichment promoted a partial recovery of motor deficits in male rats on the latency to fall in the Grip test and the Rota Rod test. The females showed a better application of the enriched environment that gave them a better performance in the ladder walking test and a learning curve in Rota Rod test. As to morphology, environmental enrichment did not cause significant changes in striatal and hippocampal damage. Based on our results, we conclude that changes in sensorimotor function sponsored by HIE is progressive and influenced by gender. Environmental enrichment had a neuroprotective effect, improving motor performance, without significant morphological changes.

Objetivo: Avaliar os níveis plasmáticos e liqüóricos de IL-6 e TNF-α em recém- -nascidos a termo com Encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI), comparando-os com recém- -nascidos a termo sépticos sem meningite e sem EHI e com recém-nascidos controles. Método: Foi realizado um estudo de caso-controle com três grupos de recém-nas-cidos a termo: grupo I, 20 recém-nascidos controles com escore de Apgar ≥ 9 no primeiro e quinto minutos de vida; grupo II, 19 recém-nascidos sépticos, sem meningite, com escore de Apgar ≥ 9 no primeiro e quinto minutos de vida; grupo III, 19 recém-nascidos asfixiados ca-racterizados pelo escore de Apgar ≤ 4 e ≤ 6 no primeiro e quinto minutos de vida, respecti-vamente, pH umbilical < 7,20 e/ou lactato arterial umbilical > 3,0 mmol/L, e necessidade de ventilação com pressão positiva pelo menos durante 2 minutos após o nascimento. Foram coletadas amostras de sangue e de líqüor nas primeiras 48 horas de vida para determinação dos níveis de IL-6 e TNF-α pela técnica de enzimoimunoensaio, utilizando-se kits R & D Systems. Resultados: Os três grupos foram semelhantes quanto ao peso de nascimento, ida-de gestacional, classificação peso/ idade gestacional, tipo de parto e tempo médio da coleta de sangue e líqüor. As medianas dos níveis plasmáticos de IL-6 foram semelhantes entre sépticos e asfixiados e significativamente superiores aos controles (p < 0,0001). A mediana do TNF-α plasmático foi semelhante nos recém-nascidos asfixiados e controles, significativamente in-ferior a dos sépticos (p < 0,00001). Nos recém-nascidos asfixiados, as medianas dos níveis liqüóricos da IL-6 e do TNF-α foram significativamente mais elevadas do que nos sépticos e nos controles. A mediana da IL-6 liqüórica foi significativamente mais elevada nos sépticos que nos controles e a mediana do TNF-α liqüórico foi semelhante nos sépticos e controles. As relações líqüor/plasma para IL-6 e TNF-α foram semelhantes nos sépticos e controles, e menores que nos asfixiados (p < 0,0002 para IL-6, p < 0,00001 para TNF-α). Conclusões: 1) Recém-nascidos a termo com EHI apresentam níveis elevados de IL-6 e TNF-α no líqüor. 2) IL-6 plasmática encontra-se elevada nos recém-nascidos asfixia-dos e nos sépticos. 3) TNF-α plasmático é elevado somente nos recém-nascidos com sepse. 4) A maior relação líqüor/plasma para IL-6 e TNF-α nos recém-nascidos asfixiados sugere uma produção local intra-cerebral dessas citocinas nos recém-nascidos a termo com EHI.

A encefalopatia causada pela hipóxia-isquemia durante o período neonatal é frequente e extremamente prejudicial para o encéfalo do recém-nascido. O estresse oxidativo é um componente da sua fisiopatologia e está relacionado à morte celular encontrada em animais submetidos ao modelo de hipóxiaisquemia, o que resulta em danos às células neurais, expresso em problemas cognitivos e alterações comportamentais. O exercício físico durante a gestação possui potencial terapêutico, considerando os benefícios que ele produz tanto para a mãe quanto para o feto. Nosso grupo demonstrou o efeito neuroprotetor que a natação materna apresenta para o filhote de ratos, através de uma regulação antioxidante positiva e biogênese mitocondrial. Com isso o objetivo deste trabalho foi avaliar se a adaptação proporcionada pelo exercício materno é capaz de amenizar os efeitos prejudiciais da hipóxia-isquemia neonatal e se eles persistem até a fase adulta, se manifestando através de alterações comportamentais. Ratas Wistar adultas realizaram o protocolo de natação materna antes e durante a gestação. Os filhotes dessas mães foram submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia 7 dias após o seu nascimento, permanecendo na caixa com cuidados maternos até completarem 21 dias de vida, quando ocorreu o desmame e uma parte dos animais foi eutanasiada. Cerebelo, córtex parietal, hipocampo e estriado foram dissecados e utilizados para a avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo. A outra parte dos animais permaneceu no biotério até a fase adulta, quando realizaram os testes comportamentais juntamente com a quantificação dos níveis de BDNF nas mesmas estruturas. Os animais que foram submetidos ao modelo de hipóxiaisquemia apresentaram uma modulação antioxidante dependente de estrutura juntamente com um aumento da atividade motora no campo aberto. Nas estruturas do hipocampo e córtex parietal foi observada uma diminuição dos níveis de espécies reativas, enquanto no estriado ocorreu um aumento estatisticamente significativo. O protocolo de nado materno apresentou uma melhora na memória de longo prazo no reconhecimento de objetos, porém, essa modulação não foi suficiente para deter os efeitos deletérios da encefalopatia neonatal induzida pela hipóxia-isquemia. Os níveis de BDNF não foram significativamente alterados em nenhum grupo experimental. Nossos dados sugerem que a hipóxia-isquemia produz efeitos deletérios sobre o encéfalo, demonstrados por alterações bioquímicas e comportamentais, que não puderam ser prevenidas pelo exercício de natação materno. / Encephalopathy caused by hypoxia-ischemia in the neonatal period is frequent and extremely harmful to the brain of the newborn. Oxidative stress is a component of the pathophysiology and is linked to cell death found in animals subjected to hypoxia-ischemia model, which results in damage to neural cells, expressed as cognitive impairment and behavioral changes. Exercise during pregnancy has therapeutic potential, considering the benefits it produces for both mother and fetus. Our group demonstrated the neuroprotective effect that maternal swimming presents to the offspring of rats, through a positive antioxidant regulation and mitochondrial biogenesis induction. Therefore, the objective of this study was to evaluate whether the adaptation provided by maternal exercise can minimize the harmful effects of neonatal hypoxiaischemia and if they persist into adulthood, manifesting through behavioral changes. Adult female Wistar rats performed the maternal swimming protocol before and during pregnancy. The pups delivered were submitted to the model of hypoxia-ischemia 7 days after birth, remaining in the box with maternal care until they are 21 days of life, when they were weaning and a part of the animals was euthanized. Cerebellum, parietal cortex, hippocampus, and striatum were dissected and used for the evaluation of oxidative stress parameters. The other part of the animals remained in the animal facility until adulthood, when performed behavioral tests along with the quantification of BDNF levels in the same structures. The animals which were subjected to hypoxia-ischemia model presented an antioxidant modulation dependent structure, along with an increase in motor activity in the open field. In hippocampal and parietal cortex structures were observed a decrease in the levels of reactive species, while the striatum had a statistically significant increase. Maternal swimming protocol showed an improvement in long-term memory evaluated by object recognition task, however, this modulation was not enough to stop the deleterious effects of neonatal encephalopathy induced by hypoxia-ischemia. BDNF levels were not significantly altered in any experimental group. Our data suggest that hypoxiaischemia produces deleterious effects on the brain, demonstrated by biochemical and behavioral changes, which could not be prevented by maternal swimming exercise.

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica neonatal causa diversas seqüelas motoras e cognitivas permanentes devido à grande degeneração celular que ocorre no encéfalo dos neonatos. Esse dano é progressivo e gera atrofias visíveis em diversas estruturas encefálicas, principalmente hipocampo, estriado e córtex cerebral. Um estudo recente do nosso grupo de pesquisa mostrou que o tratamento com ácido fólico (AF) reverteu o déficit cognitivo e a diminuição da atividade da enzima Na+, K+-ATPase, em ratos submetidos à HI neonatal. Assim, buscando compreender melhor a possível eficácia do ácido fólico em tratar e/ou prevenir o dano causado pela HI neonatal, o objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com ácido fólico na degeneração celular na região CA1 do hipocampo dorsal 24 horas após o evento lesivo e em diferentes marcos do desenvolvimento de animais submetidos à hipóxia-isquemia neonatal. Foram utilizados ratos Wistar de ambos os sexos que foram submetidos ao modelo de Levine-Rice no 7º dia de vida pós-natal, sendo divididos em quatro grupos experimentais: 1) controle tratado com salina (CTS); 2) controle tratado com ácido fólico (CTAF); 3) HI tratado com salina (HIS); 4) HI tratado com ácido fólico (HIAF). Os animais receberam uma dose intraperitoneal de AF (0,011 μmol/g de peso corporal) 24 horas antes, imediatamente antes e 24 horas após a HI ou, diariamente, até o 14° DPN. Não foram encontradas diferenças na quantificação de células imunomarcadas para caspase-3 clivada pela técnica de imunoistoquímica, porém na avaliação da densidade celular observou-se uma diminuição de células no grupo HIS 13 quando comparado com os grupos CTAF e HIAF no hipocampo direito. Tanto na análise qualitativa quanto quantitativa da ultraestrutura dos neurônios piramidais da região CA1 hipocampal também foi possível encontrar uma importante degeneração celular nos grupos submetidos à HI neonatal, predominantemente caracterizada pelo padrão necrótico, porém no grupo tratado com AF essa degeneração foi menos expressiva. Quanto aos marcos do desenvolvimento, não verificou-se diferença nem pela lesão nem pelo tratamento. A partir desse estudo, portanto, podemos concluir que 24h após a HI ocorre diminuição da densidade celular e evidente processo lesivo ao tecido hipocampal, mais expressivamente por necrose. Ainda, a suplementação com ácido fólico foi capaz de reduzir e/ou prevenir o dano celular na região CA1 do hipocampo ipsilateral à oclusão arterial. / Neonatal hypoxia-ischemia (HI) causes diverse permanent motor and cognitive sequelae due to extensive cellular degeneration that occurs in the brain of neonates. This damage is progressive and generates visible atrophy in several brain structures, particularly the hippocampus, cerebral cortex and striatum. A recent study from our research group demonstrated that treatment with folic acid (FA) reversed cognitive deficits and decreased activity of the enzyme Na+, K+-ATPase in rats submitted to neonatal HI. Thus, in order to better understand the possible effectiveness of folic acid in recovering and / or preventing the damage caused by neonatal HI, the aim of this study was to evaluate the effects of treatment with folic acid on cell degeneration in the CA1 region of the dorsal hippocampus 24 hours after neonatal hypoxia-ischemia and at different developmental milestones of animals submitted to neonatal hypoxia-ischemia. Wistar rats of both sexes were submitted to the Levine - Rice model on the 7th postnatal day, being divided into four experimental groups: 1) control treated with saline (CTS); 2) control treated with folic acid (CTAF); 3) HI treated with saline (HIS) 4) HI treated with folic acid (HIAF). Animals received an intraperitoneal dose of FA (0.011μmol/g of body weight) 24 hours before, immediately before and 24 hours after the HI. No differences were found in the quantification of positive cells for cleaved caspase-3 by immunohistochemistry, but in the assessment of cell density was observed a decrease of cells in the HIS group when compared with the CTFA and HIFA groups in the right hippocampus. In the analysis of the ultrastructure of pyramidal neurons of the 15 hippocampal CA1 region was also possible to find an important cellular degeneration in the groups subjected to neonatal HI, predominantly characterized by necrotic pattern, but in the group treated with FA this degeneration was less expressive. As for developmental milestones, no significant difference was observed either by injury or by treatment. Concluding, 24 hours after HI occurs decreased cell density and evident degeneration process to hippocampal tissue, most significantly with death by necrosis. Yet, supplementation with folic acid was able to reduce and / or prevent cell damage in the CA1 region of the hippocampus ipsilateral to the arterial occlusion.

O objetivo desta tese foi verificar os efeitos terapêuticos do enriquecimento ambiental (EA) na recuperação motora, funcional e tecidual de roedores expostos à hipóxia-isquemia (HI) neonatal. Outro objetivo foi acompanhar e descrever o desenvolvimento motor de crianças de 0 a 2 anos de idade junto ao programa Primeira Infância Melhor (PIM) em Porto Alegre- RS. No Capítulo 1 encontra-se o estudo em que foi avaliado o efeito do EA precoce sobre o aparecimento de sinais e reflexos neurológicos em animais submetidos à HI neonatal. No 7º dia pós-natal, ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos ao modelo de Rice-Vannucci de HI neonatal, onde a artéria carótida comum esquerda foi permanentemente ocluída e na sequência os animais foram expostos a uma atmosfera hipóxica (8% de oxigênio) durante 90 minutos. Um dia pós o procedimento de HI, os roedores foram alojados em gaiolas enriquecidas ou em gaiolas convencionais (ambiente padrão). Os sinais e reflexos neurológicos foram avaliados 24 horas antes da indução da HI, 24 horas após a HI e a cada 3 dias (11º, 14º, 17º) até o 20º dia pós-natal, quando os animais foram eutanaziados para posterior avaliação da extensão da lesão encefálica no estriado, corpo caloso e neocórtex. Os resultados apresentados no Capítulo 1 mostraram que independente da lesão hipóxicoisquêmica, a exposição ao EA precoce (8º ao 20º dia pós-natal) antecipou o aparecimento dos reflexos neurológicos (abertura dos olhos, desdobramento das orelhas, erupção do incisivo, reflexos de contração das pálpebras e das orelhas). Ademais, o EA foi capaz de prevenir atrofia do corpo caloso ipsilateral à lesão e no neocortex contralateral à lesão. No estudo apresentado no Capítulo 2 avaliou-se o efeito, pré (17º dia pós-natal) e pós (49º dia pós-natal) tratamento combinado de ciclosporina A (CsA) e reabilitação (EA e tarefa de alcance), na recuperação funcional de roedores submetidos à HI neonatal nos testes do cilindro, escada horizontal, campo aberto, reconhecimento de objetos e staircase. Ratos Sprague Dawley machos e fêmeas foram submetidos à HI (conforme descrito acima) e dez dias pós a lesão foram avaliados nos testes do cilindro, escada horizontal, campo aberto e reconhecimento de objetos. Os roedores apresentaram prejuízo motor no campo aberto (menor número de cruzamentos no primeiro minuto) e na escada horizontal (maior número de erros), contudo não houve comprometimento da função cognitiva. No 21º dia pós-natal os animais receberam a implantação subcutânea de uma bomba osmótica para liberação da CsA (420 mg/mL) ou veículo. E então, foram separados por sexo e alojados em gaiolas enriquecidas ou em gaiolas convencionais. Os animais enriquecidos também foram expostos a um treino de habilidade de alcance tendo como alvo a pata anterior afetada durante 4h/dia, 6 dias/semana por 4 semanas (21º ao 49º dia pós-natal). Ao final das 4 semanas de terapia combinada os animais foram reavaliados nas funções motora e cognitiva. Os resultados mostraram apenas o efeito da reabilitação motora, que por sua vez levou ao aumento da atividade exploratória no campo aberto, diminuição do número de erros na escada horizontal e melhor desempenho no teste do staircase. O componente farmacológico, CsA, não causou nenhum efeito sobre a recuperação dos roedores. A terapia combinada não recuperou a atrofia do hipocampo, córtex e hemisfério cerebral ipisilateral à lesão. E no estudo do Capítulo 3 objetivamos descrever o desenvolvimento motor de crianças de 0 a 2 anos de idade junto ao programa PIM em Porto Alegre-RS. Tal programa tem como alvo o desenvolvimento pleno das capacidades físicas, intelectuais, sociais e emocionais da criança dentro do seu ambiente familiar. As crianças avaliadas apresentaram desenvolvimento motor normal (apenas risco de atraso). As famílias avaliadas apresentavam baixo nível socioeconômico e ofereciam poucas oportunidades de estimulação no ambiente domiciliar. Concluímos que a estimulação ambiental apresentou efeitos benéficos sobre os aspectos do desenvolvimento e recuperação funcional nos roedores submetidos à HI neonatal e o programa PIM tem um grande potencial de utilização para estimulação de crianças em situação de vulnerabilidade social. / The aim of this study was to verify therapeutic effects of environmental enrichment (EE) on motor, functional and tissue recovery of rodents exposed to neonatal hypoxia-ischemia (HI). Besides, describe the motor development in children aged 0 to 2 years old attended by Better Early Childhood Program in Porto Alegre-RS, Brazil. In Chapter 1, the study aimed to evaluate the early housing in EE on maturation of physical characteristics and neurological reflexes in rats submitted to neonatal HI. At postnatal day 7, male and female Wistar rats were used to produce Rice-Vannucci model of unilateral brain injury where the left common carotid artery was occluded then pups were placed in a hypoxic chamber (O2 level at 8%) for 90 minutes. Rodents were housed in EE cages or in standard cages. We evaluated the maturation of physical characteristics and neurological reflexes from the day preceding the HI induction postnatal day 6 until postnatal day 20. Morphological analysis included the evaluation of striatal, corpus callosum and neocortex volume. Our results demonstrated that HI had no effect on neurological parameters evaluated in neonate rats. But we demonstrated a clear effect of early EE on sensorimotor development through earlier appearance of opening, eye reflex and incisor eruption were identified in early stimulated rats. Also, brain tissue was preserved in ipsilateral corpus callosum and contralateral neocortex after early environmental stimulation. The experiment presented in Chapter 2 investigated pre- and post- combinational therapy of cyclosporine A (CsA) and motor rehabilitation effects on motor function and cognition tests in rats submitted to neonatal HI. Male and female Sprague Dawley rats were submitted to neonatal HI model (as described above) and, ten days after HI surgery, rat pups were evaluated in motor function and cognition through cylinder, ladderrung walking, open field and novel object recognition. Results showed no cognitive deficit but motor function impairment in open field and ladder rung walking test in rats submitted to HI. At postnatal day 21, all HI pups were implanted subcutaneously on flank with osmotic pumps delivering CsA (420 mg/mL) or vehicle. Then, animals were housed in either standard home cages or enriched environment cages. In addition to being housed in EE, enriched groups were exposed to rehabilitative reach training 4h/day, 6 days/week for 4 weeks (PND 21 until PND 49). At the end of 4 weeks of combined therapy (EE, reaching and CsA) rats were reevaluated in same motor and cognitive tasks (cylinder, ladder walking, open field, novel object recognition, and staircase task). Rehabilitation appeared to be the most significant component of the combined therapy and was responsible for recovery of motor function as demonstrated in ladder rung walking, open field and staircase performance. Drug component, CsA, had no effects on behavioral outcomes. The combined therapy had no effect on hippocampal, cortical and hemispheric tissue atrophy. And the study of Chapter 3 aimed describe motor development of children from 0 to 2 years old inserted into Better Early Childhood Program (BECP) in south of Brazil. This program has the main goal to develop activities that cover physical, psychological, intellectual and social abilities inside the familiar context. Our results demonstrated that infants had typical motor development (only risk of delay). Evaluated families were considered at social-environmental risk and home affordances were limited. These findings can indicate a risk condition on infant development. We may conclude that environmental enrichment improved neurobehavioral development and functional recovery in rats submitted to neonatal HI, and the BECP has a great potential to stimulate children at social-environmental risk.

A encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal, ou simplesmente hipóxia-isquemia (HI) neonatal, é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em neonatos humanos. De 20% a 50% dos recém-nascidos com HI severa morrem no período perinatal. Quando sobrevivem, 25% apresentam deficiências neuropsicológicas, como dificuldade de aprendizado, epilepsia e paralisia cerebral. Devido a isso, a eficácia de possíveis agentes neuroprotetores tem sido testada em modelos animais. Há razão para se pensar que a progesterona tem um forte potencial para o tratamento da HI neonatal, já que a sua utilização tem se mostrado benéfica em pesquisas relacionadas com lesão cerebral traumática, lesão cerebral isquêmica e outros modelos de lesão do sistema nervoso central (SNC) em adultos. Inúmeros estudos têm mostrado que o modelo animal de HI de Rice e Vannucci (1981) em animais neonatos, utilizado no presente trabalho, pode produzir lesões no sistema nervoso central relativamente previsíveis, e que estas lesões encefálicas parecem semelhantes às observadas clinicamente em humanos (SALMASO et al., 2014). Para a realização do modelo de HI foram utilizados ratos Wistar com idade de 7 dias (P7). Após a oclusão da carótida esquerda, os animais foram colocados em câmaras para exposição à atmosfera hipóxica com 8% O2/92% N2 por 90 minutos. Os animais foram divididos em cinco grupos experimentais: SHAM, HI, HI+PROG-PRÉ (PRÉ), HI+PROG-PÓS (PÓS), HI+PROG-PRÉ/PÓS (PP). Os termos PRÉ e PÓS referem-se à administração de progesterona (na dose de 5 mg/kg) antes ou após o procedimento de HI neonatal . Dependendo do grupo experimental, os animais foram tratados com progesterona imediatamente antes da isquemia e/ou 6 e 24 horas após o início da hipóxia. Foram analisados o peso corporal dos animais (imediatamente antes da isquemia e 6, 24 e 48 horas após o início da hipóxia), o volume de lesão cerebral, além da expressão das proteínas p-Akt e caspase-3 pela técnica de Western blotting. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy or simply neonatal hypoxia-ischemia (HI) is a main cause of morbidity and mortality in human neonates. Moreover, 25% of survivors show neuropsychological dysfunctions such as learning difficulties, epilepsy and cerebral palsy. Because of this, the effectiveness of potential neuroprotective agents has been tested in animal models. There is a reason to suppose that progesterone has a strong potential for the treatment of neonatal HI since its use has been shown to be beneficial in researches related to traumatic brain injury, ischemic brain injury and other central nervous system injury models (CNS) in adults. Several studies have shown that the newborn animal model of HI developed by Rice and Vannucci (1981), and used in the present study, can produce lesions in the central nervous system which are predictable and similar to those observed clinically in humans. In order to perform the HI model we used 7 days old (P7) Wistar rats. After occlusion of the left carotid, the animals were placed in hypoxic chambers and exposed to the hypoxic atmosphere (8% O2/92% N2 for 90 minutes). The animals were divided into five groups: SHAM, HI, HI+PROG-PRÉ (PRÉ), HI+PROG-PÓS (PÓS), HI+PROG-PRÉ/PÓS (PP).The PRÉ and PÓS terms refer to the administration of progesterone (5 mg/kg) before and/or after the HI procedure. Progesterone was administered immediately before ischemia, 6 and 24 hours after the beginning of hypoxia, depending on the experimental group. Body weight was evaluated immediately before ischemia and/or 6 and 24 hours after the start of hypoxia. The volume of brain damage, in addition to the expression of p-Akt and caspase-3 were also evaluated.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) faz parte da etiologia de diversas patologias neurológicas e é causa de graves sequelas. Os mecanismos patofisiológicos dessa lesão começam com o insulto imediato após a HI e se estendem por dias ou semanas, pelo aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio associada a redução da defesas anti-oxidantes e reação glial, sendo a lesão secundária parte crucial no processo que culmina no dano final. A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) que parece ter uma importante ação neuroprotetora após a HI. A acetilcolinaesterase (AChE) é responsável pela degradação da ACh, inibidores dessa enzima vêm sendo utilizados para o tratamento de danos neurológicos. Sua ação positiva sobre a HI foi demonstrada em estudos realizados em nosso laboratório, onde a administração do extrato de Huperzia quadrifariata (inibidor de AChE) reduziu os déficits cognitivos e histológicos causados por essa lesão Para avaliar os efeitos das administrações pré e pós-hipóxia de galantamina, inibidor da AChE, no modelo de HI perinatal, ratos Wistar no 7º dia de vida pós-natal (DPN7) foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) durante 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de galantamina nos grupos HI+Galantamina 5 mg/kg pré-hipóxia (HIG5-Pré), HI+Galantamina 10 mg/kg pré-hipóxia (HIG10-Pré), HI+Galantamina 5 mg/kg pós-hipóxia (HIG5-Pós) e HI+Galantamina 10 mg/kg pós-hipóxia (HIG10-Pós). Os grupos Pré receberam galantamina imediatamente antes da hipóxia e os grupos Pós nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia. No DPN45 foi feita a análise do volume das estruturas encefálicas que demonstrou a redução do volume do hipocampo do grupo HIS em relação ao Sham e uma prevenção desse efeito no grupo HIG10-Pré, mas não nos demais grupos. Análises bioquímicas foram feitas no hipocampo ipsilesional 24 horas após a lesão e revelaram: através da citometria de fluxo uma redução na sobrevivência de neurônios no grupo HIS em relação ao Sham que foi prevenida no grupo HIG10-Pré; através de ELISA uma hipertrofia dos astrócitos no grupo HIS que foi revertida no grupo HIG10-Pré e um aumento na atividade da enzima anti-oxidante catalase. O tratamento pré-hipóxia com galantamina foi capaz de prevenir os déficits histológicos, aumentar a sobrevivência celular, reduzir a reação astrocitária e aumentar a atividade anti-oxidante em ratos submetidos à HI. / Neonatal hypoxia ischemia (HI) has a role in etiology of several neurological pathologies and causes severe sequelae. The pathophysiological mechanisms of this lesion start immediately after HI and last for days or weeks, with the secondary injury being a crucial part the process that culminates in the final damage. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter of the central nervous system that seems to have an important neuroprotective action after HI. Acetylcholinesterase (AChE) degradates ACh and inhibitors of this enzyme have been used to treat neurological damage. Its positive action on HI has been demonstrated in studies performed in our laboratory, where the administration of the alkaloid extract of Huperzia quadrifariata (An inhibitor of AChE) reduced the cognitive and histological deficits caused by this lesion. To evaluate the effects of the pre and post-hypoxia administrations of galantamine, a cholinesterase inhibitor, in the model oh perinatal HI, Wistar rats in the post-natal day 7 (PND7) were subjected to a combination of unilateral occlusion of the right charotid artery and of exposure to a hypoxic exposure (8% O2) for 60 minutes. Intraperitoneal injections of saline in the groups Sham anf HI+Saline (HIS) and of galantamine in the groups HI+Galantamine 5 mg/kg pre-hypoxia (HIG5-Pre), HI+Galantamine 10 mg/kg pre-hypoxia (HIG10-Pre), HI+Galantamine 5 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post) and HI+Galantamine 10 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post). The Pre groups received galantamine immediately before hypoxia and the Post groups in the intervals of 1, 24, 48 and 72 hours after HI. On PND45 the analysis of the volume of brain structures showed a reduction of the volume of the ipsilesional hippocampus in the HIS group when compared to the sham and a prevention of this effect in the HIG10-Pre, but not in any other group. Biochemical analysis was performed in the ipsilesional hippocampus 24 hours after the lesion and revealed: a reduction of the number of surviving neurons in the HIS group when compared to the Sham that was prevented in the HIG10-Pre; a hypertrophy of the astrocytes in the HIS group that was prevented in the HIG10-Pre group and an increase in the activity of the anti-oxidant enzyme catalase in the HIG10-Pre group. The treatment with galantamine was able to prevent the histological deficits, increase the survival of neurons, reduce astrocytic reaction and increase the anti-oxidant activity in rats submitted to HI.

Inúmeras estratégias neuroprotetoras vêm sendo desenvolvidas para o tratamento da encefalopatia neonatal causada pela hipóxia-isquemia (HI). O enriquecimento ambiental (EA) é uma ferramenta que propicia interação social, estimulação visual, sensorial e atividade física de forma espontânea e assim induz mudanças comportamentais e neurofisiológicas. O objetivo desta tese foi investigar os efeitos do EA em relação à estrutura e expressão de proteínas constituintes da barreira hematoencefálica (BHE) e parâmetros bioquímicos de citocinas neuroinflamatórias no hipocampo em fases subsequentes do desenvolvimento. Ainda, o escopo comportamental desta tese foi analisar o efeito do EA precoce sobre a ansiedade demonstrada por ratos adultos submetidos à HI. Para tanto, ratos Wistar machos e fêmeas, no 7º dia pós-natal (DPN), foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal. Os animais foram divididos em quatro grupos: CTAP (controle ambiente padrão), CTAE (controle ambiente enriquecido), HIAP (hipóxia-isquemia ambiente padrão) e HIAE (hipóxia-isquemia ambiente enriquecido). Os animais dos grupos EA permaneceram no enriquecimento ambiental mantido desde o 8º DPN. Após o desmame os animais foram divididos em grupos e estimulados no EA (1 h/dia por 5 semanas). Análises da expressão de proteínas estruturantes da BHE no hipocampo (β-catenina, ocludina, conexina-43, aquaporina-4, transportador de glicose 1 - Glut-1 e proteína fibrilar glial ácida - GFAP) foram quantificadas através de Western Blotting (WB) Observamos a permeabilidade e integridade da BHE através da coloração com azul de Evans e também foi realizada imuno-histoquímica para GFAP na região 1 do corno de Ammon - CA1 do hipocampo no 22º e 60º DPN. Realizamos análises da expressão das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral alfa - TNF-α e interleucina 1 beta - IL-1β, juntamente com análise imuno-histoquímica para marcação de microglia ativada na fase adulta de animais HI submetidos ao EA. Ademais, foram avaliados os efeitos da HI e do EA sobre a ansiedade no primeiro dia de exposição dos animais ao labirinto em cruz elevado (LCE) e no teste claro/escuro (TCE). Os nossos dados mostraram que o EA foi efetivo para reverter as alterações causadas pela HI aumentando a expressão de ocludina no 22º DPN e de β- catenina e GFAP no 60º DPN e diminuindo o extravasamento de azul de Evans. No 8º DPN não há alteração na BHE, sendo sugestivo de imaturidade da BHE. A avaliação imuno-histoquímica de IbA-1 demonstra ativação microglial após HI e o perfil bioquímico apresenta grande expressão das citocinas IL-1β e TNF-α em animais hipóxico-isquêmicos estimulados em EA. Através dos níveis de ansiedade encontrados, podemos estabelecer que o EA favorece uma ação menos impulsiva reduzindo o comportamento de risco dos animais após a HI. Assim, nossos resultados contribuíram para a compreensão do mecanismo da HI, visto que apresentamos de forma singular que o EA é eficaz na recuperação da disfunção da BHE maximizando os efeitos neuroprotetores de IL-1β e TNF-α sobre aspectos comportamentais relacionados à ansiedade. / Several neuroprotective strategies have been developed for the treatment of the neonatal encephalopathy caused by hypoxic ischemia (HI).The environmental enrichment (EE) is a strategy that propitiates social interaction, visual and sensorial stimulation, and physical activity spontaneously and, thus, it causes behavioral and neurophysiological changes. The aim of this thesis was to investigate the effects of EE on the structure and expression of proteins in the blood-brain barrier (BBB) and biochemical parameters of neuroinflammatory cytokines in the hippocampus in subsequent developmental stages. Moreover, the behavioral scope of this thesis was to analyze the effect of early EE on anxiety expressed by adult rats. Male and female Wistar rats, PND 7, were submitted to the Levine-Rice model of neonatal HI. The animals were divided into four groups: CSE (control - standard environment), CEE (control - enriched environment), HISE (hypoxic ischemia - standard environment) and HIEE (hypoxic ischemia - enriched environment). The animals of the EE groups were kept in the environmental enrichment since PND 8. After weaning, the animals were divided into groups and exposed to the EE (1h a day for 5 weeks). Expression analyses of the BBB structural proteins in the hippocampus (β-catenin, occludin, connexin-43, aquaporin-4, Glut-1, and GFAP) were quantified by Western Blotting (WB) We observed the BBB permeability and integrity through Evans blue staining as well as immunohistochemistry for GFAP in the CA1 hippocampus region on PND 22, and 60. We performed analyzes of the expression of the inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β, together with immunohistochemical analysis for quantification of IbA-1 in the adult phase of HI animals submitted to EE.Furthermore, the effects of the HI and the EE on anxiety on the first day of exposition to the elevated plus maze test (EPM) and the light-dark box test (LDB) were assessed. Our data have shown that the HI reduces occludin expression on PND 22 and β-catenin and GFAP on PND 60along with the extravasation of Evans blue, indicating BBB dysfunction in these periods and reversion of the alterations by the EE. On PND 8, there is no BBB change, which is suggestive of BBB immaturity. The immunohistochemicalassessment of IbA-1 demonstrates microglial activation after HI and the biochemical profile shows great expression of IL-1β and TNF-α cytokines in hypoxic-ischemic animals stimulated in EE. Through the levels of anxiety found, we can establish that the EE favors a less impulsive behavior and reduces the anxiogenic factor of animals after HI. Thus, our results have contributed to the understanding of the HI mechanism; we presented in a unique way the recovery of the BBB dysfunction and the maximization of the neuroprotective effects of IL-1β and TNF-α on behavioral aspects related to anxiety of animals exposed to the EE after HI.

This study aimed to develop and implement a therapeutic hypothermia protocol in newborns with Hipoxic Ischemic Encephalopathy and compare the short term outcomes with a historical control group. Therefore, this study was divided in two parts: the first one consisted in a literature review in order to develop an hypothermia protocol. In the second part this protocol was applied in all neonates with moderate or severe Hypoxic Ischemic Encephalopathy admitted to the Neonatal Intensive Care Unit of Santa Maria University Hospital. The hypothermia protocol, which consisted in reducing axillary temperature of the newborn to 33.2ºC for a period of 72 hours, was applied in 6 neonates with Hypoxic Ischemic Encephalopathy admitted to the Neonatal Intensive Care Unit between September 2012 to March 2013. Outcomes during the hospital course and status at discharge (mortality, length of stay and disabilities) were compared with a historical control group. For this, data from 18 newborns with Hipoxic Ischemic Encephalopathy admitted at the same unit from 2003 to 2011 were collected from medical records. Disabilities were defined as any of the following: use of antiepileptic drugs, use of feeding tube, abnormalities in the neurological examination. Hypothermia group had a higher incidence of hypotension (p = 0.001), coagulopathy (p = 0.000) and bleeding (p = 0.001) during the procedure but they did not result in major adverse events. The mortality rate was significantly lower in hypothermia group (p = 0.02) as well as the presence of disabilities at hospital discharge (p = 0.04). We concluded that therapeutic hypothermia for treatment of Hypoxic Ischemic Encephalopathy in newborn infants seems to be a safe and effective procedure having a significant impact on the mortality rate and improving the neurodevelopmental in short term. / Este trabalho teve como objetivo desenvolver e aplicar um protocolo de hipotermia terapêutica em recém-nascidos com Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica, comparando os desfechos a curto prazo com um grupo controle histórico. Para tanto, o estudo foi dividido em duas etapas: na primeira, foi realizada uma pesquisa bibliográfica sobre o assunto, de modo a desenvolver um protocolo para a aplicação de hipotermia. A segunda etapa correspondeu à aplicação do referido protocolo nos recém-nascidos com diagnóstico de Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica moderada ou grave internados na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Hospital Universitário de Santa Maria. O protocolo de hipotermia, que consistia em reduzir a temperatura axilar do recém-nascido a 33,2ºC por um período de 72 horas, foi aplicado em seis recém-nascidos com Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica que foram admitidos na Unidade de Terapia Intensiva Neonatal, no período entre setembro de 2012 e março de 2013. As variáveis clínicas durante a internação e os desfechos na alta (mortalidade, tempo de internação e presença de desabilidades) foram comparados a um grupo controle histórico constituído por 18 recém-nascidos com Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica, cujos dados foram coletados de prontuários referentes ao período de 2003 a 2011. A presença de desabilidades foi definida pelo uso de fármacos antiepilépticos, uso de sonda para alimentação e/ou alterações ao exame neurológico no momento da alta hospitalar. Os recém-nascidos submetidos à hipotermia apresentaram maior incidência de hipotensão (p = 0,001), alterações da coagulação (p = 0,000) e sangramento (p = 0,001) durante o procedimento, mas que não resultaram em eventos adversos maiores. A mortalidade foi no grupo de crianças submetidas à hipotermia (p = 0,002), bem como a presença de desabilidades (p = 0,04). Este estudo permitiu concluir que a hipotermia terapêutica para tratamento da Encefalopatia Hipóxico-Isquêmica, nesse pequeno grupo estudado, mostrou ser um procedimento seguro e eficaz, tendo reduzido significativamente a taxa de mortalidade e melhorado o neurodesenvolvimento a curto prazo.

Objetivo: Avaliar os níveis plasmáticos e liqüóricos de IL-6 e TNF-α em recém- -nascidos a termo com Encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI), comparando-os com recém- -nascidos a termo sépticos sem meningite e sem EHI e com recém-nascidos controles. Método: Foi realizado um estudo de caso-controle com três grupos de recém-nas-cidos a termo: grupo I, 20 recém-nascidos controles com escore de Apgar ≥ 9 no primeiro e quinto minutos de vida; grupo II, 19 recém-nascidos sépticos, sem meningite, com escore de Apgar ≥ 9 no primeiro e quinto minutos de vida; grupo III, 19 recém-nascidos asfixiados ca-racterizados pelo escore de Apgar ≤ 4 e ≤ 6 no primeiro e quinto minutos de vida, respecti-vamente, pH umbilical < 7,20 e/ou lactato arterial umbilical > 3,0 mmol/L, e necessidade de ventilação com pressão positiva pelo menos durante 2 minutos após o nascimento. Foram coletadas amostras de sangue e de líqüor nas primeiras 48 horas de vida para determinação dos níveis de IL-6 e TNF-α pela técnica de enzimoimunoensaio, utilizando-se kits R & D Systems. Resultados: Os três grupos foram semelhantes quanto ao peso de nascimento, ida-de gestacional, classificação peso/ idade gestacional, tipo de parto e tempo médio da coleta de sangue e líqüor. As medianas dos níveis plasmáticos de IL-6 foram semelhantes entre sépticos e asfixiados e significativamente superiores aos controles (p < 0,0001). A mediana do TNF-α plasmático foi semelhante nos recém-nascidos asfixiados e controles, significativamente in-ferior a dos sépticos (p < 0,00001). Nos recém-nascidos asfixiados, as medianas dos níveis liqüóricos da IL-6 e do TNF-α foram significativamente mais elevadas do que nos sépticos e nos controles. A mediana da IL-6 liqüórica foi significativamente mais elevada nos sépticos que nos controles e a mediana do TNF-α liqüórico foi semelhante nos sépticos e controles. As relações líqüor/plasma para IL-6 e TNF-α foram semelhantes nos sépticos e controles, e menores que nos asfixiados (p < 0,0002 para IL-6, p < 0,00001 para TNF-α). Conclusões: 1) Recém-nascidos a termo com EHI apresentam níveis elevados de IL-6 e TNF-α no líqüor. 2) IL-6 plasmática encontra-se elevada nos recém-nascidos asfixia-dos e nos sépticos. 3) TNF-α plasmático é elevado somente nos recém-nascidos com sepse. 4) A maior relação líqüor/plasma para IL-6 e TNF-α nos recém-nascidos asfixiados sugere uma produção local intra-cerebral dessas citocinas nos recém-nascidos a termo com EHI.