A hipóxia-isquemia (HI) é a principal causa de mortalidade no período perinatal e, nos sobreviventes, a incidência de seqüelas neurológicas é elevada. O encéfalo imaturo, altamente susceptível ao insulto hipóxico-isquêmico, é vulnerável a estímulos ambientais tais como o enriquecimento ambiental (EA). O objetivo deste estudo foi investigar o desempenho comportamental no teste do campo-aberto, reconhecimento de objetos, esquiva-inibitória e no rota-rod, bem como a densidade de espinhos dendríticos no hipocampo, utilizando o método de Golgi, em ratos submetidos à HI e expostos ao EA (1h/dia, 6 dias/semana, 9 semanas). Ratos de 7 dias de idade foram submetidos ao procedimento de HI e divididos em 4 grupos experimentais: controle mantido em ambiente padrão (CTAP), controle em ambiente enriquecido (CTAE), HI em ambiente padrão (HIAP) e HI em ambiente enriquecido (HIAE). Parâmetros comportamentais e morfológicos foram avaliados após 9 semanas de estimulação ambiental. Os dados indicaram que a memória de reconhecimento de objetos foi prejudicada em ratos HI adultos e recuperada após a estimulação pelo ambiente enriquecido; no teste de esquiva-inibitória os animais apresentaramum prejuízo na memória aversiva em animais HI, independentemente do ambiente. Surpreendentemente, no teste do campo-aberto, um maior número de crossings foi identificado nos grupos HI no primeiro minuto quando comparados aos grupos controle. No teste de rota-rod não foram detectadas diferenças entre animais controle e animais HI. Resultados morfológicos demonstraram uma diminuição na densidade de espinhos dendríticos no hipocampo de animais HI, com recuperação pelo EA. A densidade de espinhos dendríticos do hemisfério esquerdo (contralateral à oclusão arterial) obteve os melhores resultados, indicando uma recuperação total do dano hipóxico-isquêmico pelo EA. Os dados dos espinhos dendríticos do hemisfério direito indicaram uma recuperação parcial pela estimulação ambiental nos animais HI. Concluindo, o enriquecimento ambiental foi efetivo na recuperação do déficit comportamental e da densidade de espinhos dendríticos nos neurônios hipocampais conseqüente à hipóxia-isquemia neonatal em ratos. / Hypoxia-ischemia (HI) is the main mortality cause in perinatal period and, in survivors, the incidence of neurological disabilities is elevated. The immature brain, highly susceptible to hypoxic-ischemic insult, is responsive to environmental stimuli, as environmental enrichment (EE). The aim of this study was to investigate behavioral performance in the open field apparatus, objects recognition, inhibitory avoidance and in the Rota-rod apparatus, and dendritic spines density in the hippocampus, using the Golgi technique, in rats submitted to the HI and exposed to EE (1h/day, 6 days/week, 9 weeks). Seven-days old rats were submitted to the HI procedure and divided in 4 groups: control in standard conditions (CTSE), control in enriched environment (CTEE), HI in standard conditions (HISE) and HI in enriched environment (HIEE). Behavioral and morphological parameters were evaluated after 9 weeks of environmental stimulation. Data indicated that object-recognition memory was impaired in HI adult rats and recovered after stimulation by the EE; in the inhibitory avoidance task was demonstrated aversive memory impairment in HI animals, independent of the environment. Interestingly, in the open field task, significant more crossing responses were identified in HI groups, in the first minute, comparing to control groups. No differences between control and HI adult animals were detected in the rota-rod test. Morphological results demonstrated a decreased spines density in the hippocampus of the HI animals, with recovery by the EE. Dendritic spines density from left hemisphere (contralateral to arterial occlusion) obtained the better results, indicating a total recovery effect of the EE on HI damage. Data of dendritic spines from right hemisphere indicated a partial recovery by the environmental stimulation on HI animals. Concluding, environmental enrichment was effective in recovery behavioral impairment and dendritic spine density in hippocampal neurons, consequent to neonatal hypoxia-ischemia in rats.

A encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal é a causa mais importante de dano cerebral que ocorre no período de desenvolvimento e maturação causando à criança sequelas neurológicas de grande impacto ao longo da vida. O ambiente é um importante aliado no processo de reabilitação neuropediátrica, sendo muito utilizado pelos profissionais da saúde. Estímulos ambientais podem servir como estratégia de tratamento e inúmeros estudos têm demonstrado o seu potencial neuroprotetor. Este trabalho teve por objetivo avaliar o comportamento motor em dois momentos do desenvolvimento e os possíveis benefícios do enriquecimento ambiental em ratos submetidos à hipóxia-isquemia cerebral neonatal. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos a um modelo de lesão hipóxico-isquêmica encefálica neonatal no 7º dia pós-natal. Em um primeiro momento, foram avaliados com 22 dias e 42 dias de vida, e num segundo momento, foram submetidos a um protocolo de enriquecimento ambiental que iniciava no 8º dia de vida. Para avaliação do comportamento motor foi utilizado o teste de suspensão na barra, teste rota Rod e teste da caminhada na escada horizontal. Os animais não apresentaram alterações sensoriomotoras com 22 dias de vida, porém com 42 dias as alterações foram significativas. O enriquecimento ambiental promoveu uma recuperação parcial dos déficits motores em ratos machos quanto à latência de queda no teste da barra e no Rota Rod. As fêmeas demonstraram um melhor aproveitamento do ambiente enriquecido que lhes proporcionou uma melhor performance no teste da caminhada e uma curva de aprendizado no teste Rota Rod. Quanto à morfologia, o enriquecimento ambiental não foi capaz de promover modificações significativas no dano hipocampal e estriatal. Com base nos nossos resultados, podemos concluir que tanto animais com 22 DPN como com 42 DPN apresentaram alterações sensoriomotoras promovidas pela HIE neonatal e são influenciadas pelo gênero. O enriquecimento ambiental teve efeito neuroprotetor, melhorando o desempenho motor sem alterações morfológicas significativas. / The neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy is the most important cause of brain damage that occurs during development and maturation, causing neurological damage to the child with a big impact throughout the life. The environment is important in the process of neuropediatric rehabilitation and is widely used by health professionals. Enriched environmental serve as a treatment strategy and several studies have demonstrated its effects neuroprotective. This study aimed to evaluate motor behavior in two stages of development and the possible benefits of environmental enrichment in rats with neonatal cerebral hypoxia-ischemia. Male and female Wistar rats were subjected to a model of hypoxic-ischemic neonatal brain at the 7th postnatal day. At first, were evaluated 22 days and 42 days of life, and subsequently, underwent a protocol of environmental enrichment that began on the 8th day of life. For evaluation of motor behavior test was used to Grip Test, Rota Rod test and ladder walking test. The animals no showed sensorimotor disturbance with 22 days of life but with 42 days the changes were significant. Environmental enrichment promoted a partial recovery of motor deficits in male rats on the latency to fall in the Grip test and the Rota Rod test. The females showed a better application of the enriched environment that gave them a better performance in the ladder walking test and a learning curve in Rota Rod test. As to morphology, environmental enrichment did not cause significant changes in striatal and hippocampal damage. Based on our results, we conclude that changes in sensorimotor function sponsored by HIE is progressive and influenced by gender. Environmental enrichment had a neuroprotective effect, improving motor performance, without significant morphological changes.

A participação de marcadores bioquímicos na avaliação de quadros de asfixia neonatal é cada vez mais relevante. A proteína S100B tem um papel destacado nestas pesquisas. O objetivo deste estudo foi procurar destacar a importância da proteína S100B na avaliação de recém-nascidos a termo com quadros de encefalopatia hipóxico-isquêmica, assim como correlacionar com outras substâncias que também participam do processo isquêmico. Foram analisados 21 casos de recém-nascidos a termo que desenvolveram quadro de encefalopatia hipóxico-isquêmica, no período de setembro de 2003 a outubro de 2004. Realizadas coletas no 1º e 4º dia de vida e dosadas, por método imunocitoquímico, a proteína S100B e o lactato. Foi possível detectar uma correlação positiva entre as 2 substâncias, assim como, quando comparadas entre si, observou-se também significância estatística. / Biochemical markers have played an increasingly relevant role in the assessment of neonatal asphyxia. The S100B protein is particularly important in research conducted in this field. The purpose of this study was to underline the importance of S100B protein in the assessment of term newborn infants with hypoxic ischemic encephalopathy, as well as to relate it to other substances also involved in the ischemic process. An assessment was made from September 2003 to October 2004 of twenty-one term newborn infants who developed hypoxic ischemic encephalopathy. Samples were collected on the 1st and 4th day of life and S100B protein and lactate levels were calculated using the immune cytochemical method. A positive relationship was found between the 2 substances. Additionally, a comparison between the two substances showed a statistically significant correlation.

A hipóxia-isquemia (HI) encefálica neonatal causa diversas seqüelas motoras e cognitivas permanentes devido à grande degeneração celular que ocorre no encéfalo dos neonatos. Esse dano é progressivo e gera atrofias visíveis em diversas estruturas encefálicas, principalmente hipocampo, estriado e córtex cerebral. Um estudo recente do nosso grupo de pesquisa mostrou que o tratamento com ácido fólico (AF) reverteu o déficit cognitivo e a diminuição da atividade da enzima Na+, K+-ATPase, em ratos submetidos à HI neonatal. Assim, buscando compreender melhor a possível eficácia do ácido fólico em tratar e/ou prevenir o dano causado pela HI neonatal, o objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com ácido fólico na degeneração celular na região CA1 do hipocampo dorsal 24 horas após o evento lesivo e em diferentes marcos do desenvolvimento de animais submetidos à hipóxia-isquemia neonatal. Foram utilizados ratos Wistar de ambos os sexos que foram submetidos ao modelo de Levine-Rice no 7º dia de vida pós-natal, sendo divididos em quatro grupos experimentais: 1) controle tratado com salina (CTS); 2) controle tratado com ácido fólico (CTAF); 3) HI tratado com salina (HIS); 4) HI tratado com ácido fólico (HIAF). Os animais receberam uma dose intraperitoneal de AF (0,011 μmol/g de peso corporal) 24 horas antes, imediatamente antes e 24 horas após a HI ou, diariamente, até o 14° DPN. Não foram encontradas diferenças na quantificação de células imunomarcadas para caspase-3 clivada pela técnica de imunoistoquímica, porém na avaliação da densidade celular observou-se uma diminuição de células no grupo HIS 13 quando comparado com os grupos CTAF e HIAF no hipocampo direito. Tanto na análise qualitativa quanto quantitativa da ultraestrutura dos neurônios piramidais da região CA1 hipocampal também foi possível encontrar uma importante degeneração celular nos grupos submetidos à HI neonatal, predominantemente caracterizada pelo padrão necrótico, porém no grupo tratado com AF essa degeneração foi menos expressiva. Quanto aos marcos do desenvolvimento, não verificou-se diferença nem pela lesão nem pelo tratamento. A partir desse estudo, portanto, podemos concluir que 24h após a HI ocorre diminuição da densidade celular e evidente processo lesivo ao tecido hipocampal, mais expressivamente por necrose. Ainda, a suplementação com ácido fólico foi capaz de reduzir e/ou prevenir o dano celular na região CA1 do hipocampo ipsilateral à oclusão arterial. / Neonatal hypoxia-ischemia (HI) causes diverse permanent motor and cognitive sequelae due to extensive cellular degeneration that occurs in the brain of neonates. This damage is progressive and generates visible atrophy in several brain structures, particularly the hippocampus, cerebral cortex and striatum. A recent study from our research group demonstrated that treatment with folic acid (FA) reversed cognitive deficits and decreased activity of the enzyme Na+, K+-ATPase in rats submitted to neonatal HI. Thus, in order to better understand the possible effectiveness of folic acid in recovering and / or preventing the damage caused by neonatal HI, the aim of this study was to evaluate the effects of treatment with folic acid on cell degeneration in the CA1 region of the dorsal hippocampus 24 hours after neonatal hypoxia-ischemia and at different developmental milestones of animals submitted to neonatal hypoxia-ischemia. Wistar rats of both sexes were submitted to the Levine - Rice model on the 7th postnatal day, being divided into four experimental groups: 1) control treated with saline (CTS); 2) control treated with folic acid (CTAF); 3) HI treated with saline (HIS) 4) HI treated with folic acid (HIAF). Animals received an intraperitoneal dose of FA (0.011μmol/g of body weight) 24 hours before, immediately before and 24 hours after the HI. No differences were found in the quantification of positive cells for cleaved caspase-3 by immunohistochemistry, but in the assessment of cell density was observed a decrease of cells in the HIS group when compared with the CTFA and HIFA groups in the right hippocampus. In the analysis of the ultrastructure of pyramidal neurons of the 15 hippocampal CA1 region was also possible to find an important cellular degeneration in the groups subjected to neonatal HI, predominantly characterized by necrotic pattern, but in the group treated with FA this degeneration was less expressive. As for developmental milestones, no significant difference was observed either by injury or by treatment. Concluding, 24 hours after HI occurs decreased cell density and evident degeneration process to hippocampal tissue, most significantly with death by necrosis. Yet, supplementation with folic acid was able to reduce and / or prevent cell damage in the CA1 region of the hippocampus ipsilateral to the arterial occlusion.

A encefalopatia causada pela hipóxia-isquemia durante o período neonatal é frequente e extremamente prejudicial para o encéfalo do recém-nascido. O estresse oxidativo é um componente da sua fisiopatologia e está relacionado à morte celular encontrada em animais submetidos ao modelo de hipóxiaisquemia, o que resulta em danos às células neurais, expresso em problemas cognitivos e alterações comportamentais. O exercício físico durante a gestação possui potencial terapêutico, considerando os benefícios que ele produz tanto para a mãe quanto para o feto. Nosso grupo demonstrou o efeito neuroprotetor que a natação materna apresenta para o filhote de ratos, através de uma regulação antioxidante positiva e biogênese mitocondrial. Com isso o objetivo deste trabalho foi avaliar se a adaptação proporcionada pelo exercício materno é capaz de amenizar os efeitos prejudiciais da hipóxia-isquemia neonatal e se eles persistem até a fase adulta, se manifestando através de alterações comportamentais. Ratas Wistar adultas realizaram o protocolo de natação materna antes e durante a gestação. Os filhotes dessas mães foram submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia 7 dias após o seu nascimento, permanecendo na caixa com cuidados maternos até completarem 21 dias de vida, quando ocorreu o desmame e uma parte dos animais foi eutanasiada. Cerebelo, córtex parietal, hipocampo e estriado foram dissecados e utilizados para a avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo. A outra parte dos animais permaneceu no biotério até a fase adulta, quando realizaram os testes comportamentais juntamente com a quantificação dos níveis de BDNF nas mesmas estruturas. Os animais que foram submetidos ao modelo de hipóxiaisquemia apresentaram uma modulação antioxidante dependente de estrutura juntamente com um aumento da atividade motora no campo aberto. Nas estruturas do hipocampo e córtex parietal foi observada uma diminuição dos níveis de espécies reativas, enquanto no estriado ocorreu um aumento estatisticamente significativo. O protocolo de nado materno apresentou uma melhora na memória de longo prazo no reconhecimento de objetos, porém, essa modulação não foi suficiente para deter os efeitos deletérios da encefalopatia neonatal induzida pela hipóxia-isquemia. Os níveis de BDNF não foram significativamente alterados em nenhum grupo experimental. Nossos dados sugerem que a hipóxia-isquemia produz efeitos deletérios sobre o encéfalo, demonstrados por alterações bioquímicas e comportamentais, que não puderam ser prevenidas pelo exercício de natação materno. / Encephalopathy caused by hypoxia-ischemia in the neonatal period is frequent and extremely harmful to the brain of the newborn. Oxidative stress is a component of the pathophysiology and is linked to cell death found in animals subjected to hypoxia-ischemia model, which results in damage to neural cells, expressed as cognitive impairment and behavioral changes. Exercise during pregnancy has therapeutic potential, considering the benefits it produces for both mother and fetus. Our group demonstrated the neuroprotective effect that maternal swimming presents to the offspring of rats, through a positive antioxidant regulation and mitochondrial biogenesis induction. Therefore, the objective of this study was to evaluate whether the adaptation provided by maternal exercise can minimize the harmful effects of neonatal hypoxiaischemia and if they persist into adulthood, manifesting through behavioral changes. Adult female Wistar rats performed the maternal swimming protocol before and during pregnancy. The pups delivered were submitted to the model of hypoxia-ischemia 7 days after birth, remaining in the box with maternal care until they are 21 days of life, when they were weaning and a part of the animals was euthanized. Cerebellum, parietal cortex, hippocampus, and striatum were dissected and used for the evaluation of oxidative stress parameters. The other part of the animals remained in the animal facility until adulthood, when performed behavioral tests along with the quantification of BDNF levels in the same structures. The animals which were subjected to hypoxia-ischemia model presented an antioxidant modulation dependent structure, along with an increase in motor activity in the open field. In hippocampal and parietal cortex structures were observed a decrease in the levels of reactive species, while the striatum had a statistically significant increase. Maternal swimming protocol showed an improvement in long-term memory evaluated by object recognition task, however, this modulation was not enough to stop the deleterious effects of neonatal encephalopathy induced by hypoxia-ischemia. BDNF levels were not significantly altered in any experimental group. Our data suggest that hypoxiaischemia produces deleterious effects on the brain, demonstrated by biochemical and behavioral changes, which could not be prevented by maternal swimming exercise.

O conteúdo de zinco (Zn) reativo cerebral é importante para o equilíbrio da sinaptofisiologia neural. A prova disto é que um aumento nos seus níveis, após evento hipóxico-isquêmico, resulta em neurotoxicidade, o que tem estimulado o tratamento desta disfunção cerebral com quelantes de Zn, tal como o dietilditiocarabamato (DEDTC). No caso do DEDTC, o uso deste composto sobre esta disfunção deve ser analisado com cuidado, pois ele também apresenta muitos efeitos colaterais sobre o sistema nervoso central. Desta forma, para atender este propósito, é necessário antes obter uma concentração de DEDTC com menores efeitos colaterais. Por esta razão, no presente trabalho, nós decidimos usar um modelo vertebrado mais simples, tal como o peixe-zebra, o qual permitiria a triagem, em larga escala, dos efeitos de DEDTC sobre o Zn reativo. Entretanto, jamais foi mostrada a presença de Zn reativo no cérebro de peixe-zebra. Com isto, através de marcações histológicas, nós conseguimos mostrar pela primeira vez a distribuição citoarquitectônica de Zn reativo em neurônios glutamatérgicos, bem como o número desses neurônios contendo Zn no cérebro de peixe-zebra. Isto nos permitiu avaliar o efeito de diferentes concentrações de DEDTC sobre o conteúdo de Zn cerebral do peixe-zebra, o qual foi intensamente quelado por elevadas quantidades do composto, induzindo comportamentos tipo-crise. Neste mesmo estudo nós obtemos também uma concentração de DEDTC com poucos efeitos colaterais que poderia exercer neuroproteção sobre o aumento de Zn reativo induzido pela hipóxia-isquemia. Assim, após a padronização de um modelo de hipóxia em peixe-zebra, que demonstra danos relacionados à isquemia, nós testamos se essa concentração de DEDTC poderia ser neuroprotetora sobre este modelo. Contudo, DEDTC apresentou efeitos pró-oxidantes, embora ele tenha atenuado o elevado conteúdo de Zn reativo induzido pela hipóxia. Portanto, mesmo que o DEDTC tenha falhado, este modelo, agora, está apto para a triagem de outros fármacos com potencial ação sobre o alterado conteúdo de Zn reativo que ocorre em eventos hipóxicos-isquêmicos. / The content of brain reactive zinc (Zn) is important for the synaptophysiology in the central nervous system (CNS). This is evidenced in hypoxic-ischemic events, when an increase in their levels results in neurotoxicity. Consequently, this has stimulated the treatment of cerebral ischemia with Zn chelators, such as diethyldithiocarbamate (DEDTC). In the case of DEDTC, the use of this compound in this dysfunction should be examined carefully, because it also has many side effects on the (CNS). Thus, to meet this, it is necessary first to obtain a concentration of DEDTC with negligible side effects. Here, we decided to use a simpler vertebrate model, such as zebrafish, which would allow large-scale screening of DEDTC effects on reactive Zn. However, the presence of reactive Zn has never been shown in zebrafish brain. Then, using histological markers, we were able to show for the first time the cytoarchitectonic distribution of reactive Zn in glutamatergic neurons as well as the number of these neurons containing Zn in the zebrafish brain. This allowed us to evaluate the effect of different DEDTC concentrations on the brain content of Zn in zebrafish. As a result, high levels of the compound did strongly chelate the metal, inducing seizure-like behaviors. In this study we also obtained a DEDTC concentration with few side effects that could exert neuroprotection on the increased reactive Zn induced by hypoxia-ischemia. Then, after the standardization of an ischemic-sensitive model of hypoxia in zebrafish, we tested if this DEDTC concentration could be neuroprotective on this model. Nevertheless, DEDTC showed pro-oxidant effects, though it had mitigated the elevated content of reactive Zn induced hypoxia. Therefore, despite the DEDTC have failed as neuroprotective drug, this model enables the screening of other chemical agents with potential action on the increased content of reactive Zn that occurs in hypoxic-ischemic events.

Inúmeras estratégias neuroprotetoras vêm sendo desenvolvidas para o tratamento da encefalopatia neonatal causada pela hipóxia-isquemia (HI). O enriquecimento ambiental (EA) é uma ferramenta que propicia interação social, estimulação visual, sensorial e atividade física de forma espontânea e assim induz mudanças comportamentais e neurofisiológicas. O objetivo desta tese foi investigar os efeitos do EA em relação à estrutura e expressão de proteínas constituintes da barreira hematoencefálica (BHE) e parâmetros bioquímicos de citocinas neuroinflamatórias no hipocampo em fases subsequentes do desenvolvimento. Ainda, o escopo comportamental desta tese foi analisar o efeito do EA precoce sobre a ansiedade demonstrada por ratos adultos submetidos à HI. Para tanto, ratos Wistar machos e fêmeas, no 7º dia pós-natal (DPN), foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal. Os animais foram divididos em quatro grupos: CTAP (controle ambiente padrão), CTAE (controle ambiente enriquecido), HIAP (hipóxia-isquemia ambiente padrão) e HIAE (hipóxia-isquemia ambiente enriquecido). Os animais dos grupos EA permaneceram no enriquecimento ambiental mantido desde o 8º DPN. Após o desmame os animais foram divididos em grupos e estimulados no EA (1 h/dia por 5 semanas). Análises da expressão de proteínas estruturantes da BHE no hipocampo (β-catenina, ocludina, conexina-43, aquaporina-4, transportador de glicose 1 - Glut-1 e proteína fibrilar glial ácida - GFAP) foram quantificadas através de Western Blotting (WB) Observamos a permeabilidade e integridade da BHE através da coloração com azul de Evans e também foi realizada imuno-histoquímica para GFAP na região 1 do corno de Ammon - CA1 do hipocampo no 22º e 60º DPN. Realizamos análises da expressão das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral alfa - TNF-α e interleucina 1 beta - IL-1β, juntamente com análise imuno-histoquímica para marcação de microglia ativada na fase adulta de animais HI submetidos ao EA. Ademais, foram avaliados os efeitos da HI e do EA sobre a ansiedade no primeiro dia de exposição dos animais ao labirinto em cruz elevado (LCE) e no teste claro/escuro (TCE). Os nossos dados mostraram que o EA foi efetivo para reverter as alterações causadas pela HI aumentando a expressão de ocludina no 22º DPN e de β- catenina e GFAP no 60º DPN e diminuindo o extravasamento de azul de Evans. No 8º DPN não há alteração na BHE, sendo sugestivo de imaturidade da BHE. A avaliação imuno-histoquímica de IbA-1 demonstra ativação microglial após HI e o perfil bioquímico apresenta grande expressão das citocinas IL-1β e TNF-α em animais hipóxico-isquêmicos estimulados em EA. Através dos níveis de ansiedade encontrados, podemos estabelecer que o EA favorece uma ação menos impulsiva reduzindo o comportamento de risco dos animais após a HI. Assim, nossos resultados contribuíram para a compreensão do mecanismo da HI, visto que apresentamos de forma singular que o EA é eficaz na recuperação da disfunção da BHE maximizando os efeitos neuroprotetores de IL-1β e TNF-α sobre aspectos comportamentais relacionados à ansiedade. / Several neuroprotective strategies have been developed for the treatment of the neonatal encephalopathy caused by hypoxic ischemia (HI).The environmental enrichment (EE) is a strategy that propitiates social interaction, visual and sensorial stimulation, and physical activity spontaneously and, thus, it causes behavioral and neurophysiological changes. The aim of this thesis was to investigate the effects of EE on the structure and expression of proteins in the blood-brain barrier (BBB) and biochemical parameters of neuroinflammatory cytokines in the hippocampus in subsequent developmental stages. Moreover, the behavioral scope of this thesis was to analyze the effect of early EE on anxiety expressed by adult rats. Male and female Wistar rats, PND 7, were submitted to the Levine-Rice model of neonatal HI. The animals were divided into four groups: CSE (control - standard environment), CEE (control - enriched environment), HISE (hypoxic ischemia - standard environment) and HIEE (hypoxic ischemia - enriched environment). The animals of the EE groups were kept in the environmental enrichment since PND 8. After weaning, the animals were divided into groups and exposed to the EE (1h a day for 5 weeks). Expression analyses of the BBB structural proteins in the hippocampus (β-catenin, occludin, connexin-43, aquaporin-4, Glut-1, and GFAP) were quantified by Western Blotting (WB) We observed the BBB permeability and integrity through Evans blue staining as well as immunohistochemistry for GFAP in the CA1 hippocampus region on PND 22, and 60. We performed analyzes of the expression of the inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β, together with immunohistochemical analysis for quantification of IbA-1 in the adult phase of HI animals submitted to EE.Furthermore, the effects of the HI and the EE on anxiety on the first day of exposition to the elevated plus maze test (EPM) and the light-dark box test (LDB) were assessed. Our data have shown that the HI reduces occludin expression on PND 22 and β-catenin and GFAP on PND 60along with the extravasation of Evans blue, indicating BBB dysfunction in these periods and reversion of the alterations by the EE. On PND 8, there is no BBB change, which is suggestive of BBB immaturity. The immunohistochemicalassessment of IbA-1 demonstrates microglial activation after HI and the biochemical profile shows great expression of IL-1β and TNF-α cytokines in hypoxic-ischemic animals stimulated in EE. Through the levels of anxiety found, we can establish that the EE favors a less impulsive behavior and reduces the anxiogenic factor of animals after HI. Thus, our results have contributed to the understanding of the HI mechanism; we presented in a unique way the recovery of the BBB dysfunction and the maximization of the neuroprotective effects of IL-1β and TNF-α on behavioral aspects related to anxiety of animals exposed to the EE after HI.

A lesão hipóxico-isquêmica perinatal (HI) é uma das principais causas de mortalidade aguda e morbidade neurológica crônica em lactentes e crianças. Os mecanismos de lesão podem ser classificados em fase primária, latente, secundária e terciária. A inflamação aguda desencadeia a expressão de uma série de genes pró-inflamatórios, que induzem a síntese de fatores de transcrição e de mediadores inflamatórios. Uma posível via de sinalização alterada que pode ter uma importância fundamental na HI depende dos astrócitos e envolve a uma subunidade de uma proteína ligante de cálcio, chamada S100b. Sua inibição parece ter efeito neuroprotetor em modelos de lesão ao sistema nervoso central. Este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos neuroprotetores do ácido arúndico (um inibidor da síntese astrocítica de S100b) administrado pré e pós hipóxia sobre os parâmetros comportamentais, morfológicos e bioquímicos no modelo de hipóxia-isquemia neonatal em ratos Wistar. No 7º dia de vida pós-natal os animais foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) por 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de ácido arúndico nos grupos HI+AA0,1mg/kg pré-hipóxia (HIAA0,1pré), HI+AA 1mg/kg pré-hipóxia (HIAA1 pré), HI+AA10mg/kg pré-hipóxia (HIAA10pré) e HI+AA10 mg/kg pré e pós-hipóxia (HIAA10pré e pós). Os grupos pré receberam ácido arúndico imediatamente antes da hipóxia e o grupo pós, nos intervalos de 1, 24 e 48 horas após a cirurgia. Os resultados demonstraram que o ácido arúndico foi efetivo na dose de 10 mg/kg aplicados pré e pós-hipóxia, sendo capaz de reduzir a lesão tecidual no hipocampo ipsilateral à oclusão da carótida, também promoveu a sobrevivência astrocitária no hipocampo, reduziu a liberação de S100b no líquor, manteve a expressão dos níveis dos transportadores de glutamato (GLT-1 e GLAST) e da glutamina sintetase, contudo não foi capaz de melhorar os déficits cognitivos induzidos pela HI. / Perinatal hypoxic-ischemic injury (HI) is one of the main causes of acute mortality and chronic neurological morbidity in infants and children. Injury mechanisms can be classified as primary, latent, secondary and tertiary. Acute inflammation triggers the expression of a number of proinflammatory genes, which induce the synthesis of transcription factors and inflammatory mediators. One possible signaling pathway altered that may have fundamental importance in HI depends on astrocytes and involves a subunit of a calcium binding protein, called S100b. Its inhibition may have neuroprotective effects on central nervous system injury models. This study aimed to evaluate the neuroprotective effects of arundic acid (an S100b astrocytic synthesis inhibitor) when administered in the pre and post hypoxia periods on behavioral, morphological and biochemical parameters in the neonatal hypoxia-ischemia model in Wistar rats. On the 7th day postnatal life the animals were submitted to a combination of unilateral occlusion of the right carotid artery and exposure to a hypoxic atmosphere (8% O 2) for 60 minutes. Intraperitoneal saline injections were used for the groups Sham and HI + Saline (HIS) and of arundic acid in the groups HI+AA0,1mg/kg pre-hypoxia (HIAA0,1pre), HI+AA 1mg/kg pre-hypoxia (HIAA1pre), HI+AA10mg/kg pre-hypoxia (HIAA10pre) and HI+AA10 mg/kg pre and post-hypoxia (HIAA10pre and post). Pre groups received arundic acid immediately prior to hypoxia and the Post group at intervals of 1, 24 and 48 hours after surgery. The results demonstrated that the arundic acid was effective at a dose of 10 mg/kg applied before and after hypoxia, being able to reduce tissue damage in the ipsilateral hippocampus to carotid occlusion, also promoted astrocytic survival in the hippocampus, reduced extracellular release of S100b in liquor, promoted maintenance of expression of glutamate transporter levels (GLT-1 and GLAST) and glutamine synthetase, but was not able to improve HI-induced cognitive deficits.

Estudos com animais submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia (HI) neonatal reproduzem achados observados em humanos, tais como transtornos de aprendizado, comprometimento tecidual nervoso e alterações bioquímicas. O ácido fólico (AF), uma vitamina que pode ser obtida diretamente da dieta, tem sido relacionado à prevenção de eventos isquêmicos, e a proteção antioxidante. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do tratamento com ácido fólico sobre parâmetros comportamentais, bioquímicos e morfológicos de animais submetidos à HI. Foram utilizados ratos Wistar de ambos os sexos com sete dias pós-natal (DPN) divididos em quatro grupos: 1) grupo controle tratado com salina 0,9% (CTS); 2) grupo controle tratado com ácido fólico (CTAF); 3) grupo HI tratado com salina 0,9% (HIS); 4) grupo HI tratado com ácido fólico (HIAF). Uma dose intraperitoneal de ácido fólico (0,011μmol/g de peso corporal) foi administrada imediatamente antes do procedimento de HI e, após, diariamente até o 30 ou 40 DPN. No experimento 1 investigamos os efeitos do tratamento com AF sobre o comportamento motor, memória aversiva e atividade da enzima Na+,K+-ATPase. Os resultados demonstraram um efeito ansiogênico nos animais HI visto no campo aberto, prejuízo na memória aversiva no teste de esquiva inibitória e ainda diminuição na atividade da enzima Na+,K+-ATPase. No entanto, os animais HI tratados com ácido fólico não apresentaram estes efeitos, indicando uma reversão desses achados. O experimento 2 teve como objetivo investigar se o tratamento com AF influenciaria em outro tipo de memória, como a de referência e se seria efetivo na reversão da atrofia hipocampal causada pela HI. Nossos resultados indicaram que houve prejuízo no aprendizado na tarefa do labirinto aquático de Morris nos animais HI tanto na memória de referência quanto na memória de trabalho. Também, houve diminuição do volume hipocampal e área estriatal nesses animais. Todavia, observamos significativa melhora no quadro de atrofia hipocampal nos animais tratados com AF. Portanto, esses dados demonstram que o tratamento com ácido fólico desempenha um papel relevante na reversão do efeito ansiogênico, do déficit na memória aversiva, na prevenção da inibição da atividade da Na+,K+,ATPase e recuperação do volume hipocampal ocasionados pela HI neonatal. / Perinatal hypoxic-ischemic (HI) is a significant cause of mortality and morbidity in infants and young children. Folic acid is a water soluble vitamin that can be obtained through diet and has been related to the antioxidant effect, protecting ischemic events and Alzheimer's disease. The aim of this study was to investigate the role of the folic acid treatment over the behavioral, biochemical and morphologic alterations in animals submitted to neonatal HI model. Four groups of seven days-old Wistar rats, of both sexes, were used in the experiments: 1) control group treated with saline 0.9% (CT-S); 2) control group treated with folic acid (CT-FA); 3) HI group treated with saline 0.9% (HI-S); 4) HI group treated with folic acid (HI-FA). Folic acid was intraperitoneal administrated (0.011μmol/g of body weight) once before HI procedure and injections were repeated daily until the 30th or 40th postnatal day. Results were obtained from two experiments. In the first, it was investigated the effects of the FA treatment on motor performance, aversive memory and enzymatic Na+,K+-ATPase activity. Rats submitted to HI demonstrated an ansiogenic effect in the open field task, impairment in the aversive memory during avoidance test and reduction in the Na+,K+-ATPase activity. Nevertheless, when treated with folic acid, all symptoms were reverted, as observed in the animal group HI treated with folic acid. The second experiment investigated the influence of the folic acid treatment in the spatial memory, working memory and recovery of hippocampus atrophy caused by HI. Results showed impairment in the learning task during Morris’ water maze and reduction in hippocampus volume and area striatal due to HI. Folic acid treatment until the 40th postnatal day was able to reverse significantly the hippocampus atrophy. Therefore, these results demonstrate that folic acid play an important role in the recovery of the ansiogenic effect, aversive memory impairment, hippocampus atrophy and Na+,K+-ATPase activity inhibition caused by neonatal HI.

Estudos com animais submetidos ao modelo de hipóxia-isquemia (HI) neonatal reproduzem achados observados em humanos, tais como transtornos de aprendizado, comprometimento tecidual nervoso e alterações bioquímicas. O ácido fólico (AF), uma vitamina que pode ser obtida diretamente da dieta, tem sido relacionado à prevenção de eventos isquêmicos, e a proteção antioxidante. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do tratamento com ácido fólico sobre parâmetros comportamentais, bioquímicos e morfológicos de animais submetidos à HI. Foram utilizados ratos Wistar de ambos os sexos com sete dias pós-natal (DPN) divididos em quatro grupos: 1) grupo controle tratado com salina 0,9% (CTS); 2) grupo controle tratado com ácido fólico (CTAF); 3) grupo HI tratado com salina 0,9% (HIS); 4) grupo HI tratado com ácido fólico (HIAF). Uma dose intraperitoneal de ácido fólico (0,011μmol/g de peso corporal) foi administrada imediatamente antes do procedimento de HI e, após, diariamente até o 30 ou 40 DPN. No experimento 1 investigamos os efeitos do tratamento com AF sobre o comportamento motor, memória aversiva e atividade da enzima Na+,K+-ATPase. Os resultados demonstraram um efeito ansiogênico nos animais HI visto no campo aberto, prejuízo na memória aversiva no teste de esquiva inibitória e ainda diminuição na atividade da enzima Na+,K+-ATPase. No entanto, os animais HI tratados com ácido fólico não apresentaram estes efeitos, indicando uma reversão desses achados. O experimento 2 teve como objetivo investigar se o tratamento com AF influenciaria em outro tipo de memória, como a de referência e se seria efetivo na reversão da atrofia hipocampal causada pela HI. Nossos resultados indicaram que houve prejuízo no aprendizado na tarefa do labirinto aquático de Morris nos animais HI tanto na memória de referência quanto na memória de trabalho. Também, houve diminuição do volume hipocampal e área estriatal nesses animais. Todavia, observamos significativa melhora no quadro de atrofia hipocampal nos animais tratados com AF. Portanto, esses dados demonstram que o tratamento com ácido fólico desempenha um papel relevante na reversão do efeito ansiogênico, do déficit na memória aversiva, na prevenção da inibição da atividade da Na+,K+,ATPase e recuperação do volume hipocampal ocasionados pela HI neonatal. / Perinatal hypoxic-ischemic (HI) is a significant cause of mortality and morbidity in infants and young children. Folic acid is a water soluble vitamin that can be obtained through diet and has been related to the antioxidant effect, protecting ischemic events and Alzheimer's disease. The aim of this study was to investigate the role of the folic acid treatment over the behavioral, biochemical and morphologic alterations in animals submitted to neonatal HI model. Four groups of seven days-old Wistar rats, of both sexes, were used in the experiments: 1) control group treated with saline 0.9% (CT-S); 2) control group treated with folic acid (CT-FA); 3) HI group treated with saline 0.9% (HI-S); 4) HI group treated with folic acid (HI-FA). Folic acid was intraperitoneal administrated (0.011μmol/g of body weight) once before HI procedure and injections were repeated daily until the 30th or 40th postnatal day. Results were obtained from two experiments. In the first, it was investigated the effects of the FA treatment on motor performance, aversive memory and enzymatic Na+,K+-ATPase activity. Rats submitted to HI demonstrated an ansiogenic effect in the open field task, impairment in the aversive memory during avoidance test and reduction in the Na+,K+-ATPase activity. Nevertheless, when treated with folic acid, all symptoms were reverted, as observed in the animal group HI treated with folic acid. The second experiment investigated the influence of the folic acid treatment in the spatial memory, working memory and recovery of hippocampus atrophy caused by HI. Results showed impairment in the learning task during Morris’ water maze and reduction in hippocampus volume and area striatal due to HI. Folic acid treatment until the 40th postnatal day was able to reverse significantly the hippocampus atrophy. Therefore, these results demonstrate that folic acid play an important role in the recovery of the ansiogenic effect, aversive memory impairment, hippocampus atrophy and Na+,K+-ATPase activity inhibition caused by neonatal HI.