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L'empaquetage du génome eucaryote sous forme de chromatine constitue une barrière physique aux facteurs nécessaires à la transcription des gènes, la replication, la recombinaison et la réparation de l'ADN. Les eucaryotes ont développé différents mécanismes par lesquels la structure de la chromatine et sa composition peuvent être manipulées afin de contrôler l'accès à l'ADN. Il s'agit notamment de modifications covalentes des histones, le remodelage ATP-dépendant des nucléosomes et l'incorporation de variants d'histones. Le but initial de ma thèse était d'étudier les interactions fonctionnelles entre les différents régulateurs de la chromatine. Dotl (Disruptor of telomeric silencing-1) est une histone méthyltransférase qui cible la lysine 79 de l'histone H3 nucléosomale et contribue à l'établissement de la frontière entre l'hétérochromatine et l'euchromatine en bloquant la propagation du complexe SIR. La méthylation par Dotl a été liée à l'élongation de la transcription et est régulée par l'ubiquitination de l'histone H2B. Lors de nos études sur les relations fonctionnelles avec d'autres modifications des histones, nous avons constaté que le domaine N-terminal de l'histone H4, à la différence des autres queues d'histones, est essentiel pour la méthylation de la lysine 79 de H3 par Dotl, tant in vivo que in vitro. La protéine hétérochromatinienne Sir3 lie également la queue de H4 et compétitionne donc avec Dotl pour la même cible moléculaire sur la chromatine, expliquant ainsi le mécanisme d'établissement de frontières chromatiniennes. L'acétylation de l'histone H4 joue également un rôle important dans l'organisation des frontières chromatiniennes et l'incorporation du variant d'histone H2A.Z près des telomeres, un processus catalysé par SWR1, un complexe de remodelage ATP-dépendant. Au niveau de gènes euchromatiniens, l'acétylation de H4 et l'incorporation de H2A.Z se produisent surtout au niveau des promoteurs. Ces deux événements sont importants pour préparer le promoteur du gène PH05 à son activation transacriptionnelle. Nous avons déjà identifié une relation fonctionnelle entre SWR1 et NuA4, un complexe acetyltransferase d'histone essentiel pour la viabilité cellulaire et l'acétylation des histones H4 et H2A. NuA4 et SWR1 montrent de fortes interactions génétiques et nos résultats indiquent qu'ils coopèrent également au niveau des promoteurs des gènes ADE. Fait important, NuA4 affecte l'incorporation de l'histone H2A.Z in vivo et l'acétyle directement à l'intérieur de nucléosomes, in vitro et in vivo. Afin d'analyser la relation fonctionnelle entre NuA4 et SWR1 au niveau moléculaire, nous avons développé un essai d'échange d'histones en utilisant de la chromatine native purifiée et des dimères H2A.Z-H2B recombinants. Nos données indiquent que NuA4 stimule l'échange de dimères d'histones par SWR1, dans une réaction dépandant de l'acétyl-CoA et de l'ATP. En outre, l'acétylation des histones H4 et H2A par NuA4 fonctionnent de façon redondante dans la promotion de l'incorporation de H2A.Z par le complexe SWR1. Pris dans leur ensemble, nos résultats dressent un tableau détaillé de la succession d'événements moléculaires survenant lors de l'établissement des frontières hétérochromatine/euchromatine et mènent à une meilleure compréhension mécanistique de la relation intime et conservée évolutivement entre l'acétylation de la chromatine par le complexe NuA4/TIP60 et l'échange de variants d'histones H2A par le complexe SWRl/p400.

Les nucléosomes, composés d’histones et d’ADN, constituent l’unité de base de la chromatine. Toutes les actions portant sur l’ADN ou nécessitant cette molécule doivent d’abord éliminer la répression physique réalisée par la structure du nucléosome. Il existe pour cela trois mécanismes principaux permettant de rendre plus fluide et plus dynamique cette structure. Les différents éléments mis en jeu dans ces mécanismes sont les chaperons d’histones, les facteurs de remodelage de la chromatine et enfin les facteurs modifiant les extrémités des histones. NuA4, un complexe de 12 sous-unités de la levure Saccharomyces cerevisiae faisant partie de la dernière famille de facteurs pouvant influencer la structure de la chromatine, est capable d’acétyler les histones H4 et H2A sur leur extrémité N-terminale. Sa sous-unité catalytique, Esa1, est la seule histone acétyltransférase essentielle pour la levure. Plusieurs sous-unités du complexe possèdent des domaines particuliers présents dans des protéines ayant un rôle dans la structure de la chromatine. C’est le cas notamment de Esa1 et de Eaf3 qui possèdent un chromodomaine, domaine selon la protéine a été caractérisé comme un module de reconnaissance soit d’ARN soit de lysine méthylées des histones. Le but de mon projet doctoral était de caractériser la régulation de NuA4 et plus particulièrement de comprendre le rôle de ses deux protéines à chromodomaine Esa1 et Eaf3. Dans un premier temps, nous avons cherché à identifier certaines modifications sur les histones capables de moduler l’activité de NuA4. Ce travail nous a permis d’identifier et de caractériser deux nouvelles enzymes, Rmt1 et Dot1, responsables respectivement de la méthylation de l’arginine 3 de H4 et de la lysine 79 sur l’histone H3. Seule la première de ces deux modifications s’est révélée avoir une influence sur l’activité de NuA4 et ce en combinaison avec la phosphorylation de la sérine 1 de l’histone H4. Dans un deuxième temps nous avons essayé de comprendre la fonction de Eaf3, en particulier son rôle potentiel dans la reconnaissance des lysines méthylées. Grâce à des études génétiques et biochimiques nous avons pu établir un lien entre Eaf3 et la lysine 36 méthylée de H3. / Nucleosomes, composed of DNA and histones, are the basal unit of chromatin. All cellular mechanisms involving DNA have to deal with the repressive structure formed by nucleosomes. Histone chaperons, chromatin remodelling enzymes and complexes able to modify the N terminus of histones are major molecular compounds able to affect chromatin structure. NuA4 is a 12-subunit-histone-acetyltransferase-complex from Saccharomyces cerevisiae able to influence chromatin by acetylating N terminus of H4 and H2A. Esa1, its catalytic subunit, is the only essential histone acetyltransferase in yeast. Other subunits of the complex possess domains find in proteins playing a role in chromatin dynamic structure. This is the case for Esa1 and Eaf3, each one has a chromodomaine which is found to be, depending on the protein, a non-coding RNA binding module or a histone methyl lysine binding module. The main aim of this project was to find how NuA4 was regulated and more precisely to understand functions of its 2 chromodomain-containing proteins, Esa1 and Eaf3. First, we looked for histone modifications able to influence NuA4 activity which leads us to characterize two new enzymes, Rmt1 and Dot1, responsible respectively for the methylation of H4 arginine 3 and H3 lysine 79. Of these 2 modifications only the first one was able to influence NuA4 activity in combination with H4 serine 1 phosphorylation. Second, we tried to understand Eaf3’s function and particularly its potential role in histone methyl lysine binding. With genetic and biochemical studies we demonstrated a link between Eaf3 and méthylation of lysine 36 on histone H3.

Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont un outil essentiel pour la recherche biomédicale. Elles ont à la fois la particularité de se multiplier de manière indéfinie tout en gardant leurs propriétés souches et l’incroyable capacité de donner naissance à tous les types cellulaires de l’organisme. Ces caractéristiques ouvrent de nouvelles perspectives pour la médecine régénérative mais également pour la mise au point de nouveaux essais thérapeutiques. Une des révolutions majeures reposant sur la reprogrammation cellulaire des cellules somatiques adultes en cellules souches, permet notamment d’entrevoir de nouvelles applications thérapeutiques. Les mécanismes moléculaires, tels que la méthylation de l’ADN, les modifications d’histones, et l’intervention de facteurs épigénétiques dans le remodelage de la chromatine, jouent un rôle essentiel dans la reprogrammation cellulaire et le contrôle de la pluripotence des cellules souches. L’épigénome des CSE doit non seulement maintenir l’expression des gènes associés à la pluripotence, mais également permettre une activation rapide et spécifique des gènes impliqués dans les étapes de différenciation cellulaire. Une des modifications ayant un rôle important dans l’homéostasie des CSE correspond aux méthylations d’histones H3K9 et H3K27 essentiellement associées à une répression transcriptionnelle. Ces modifications sont effectuées par des lysines méthyltransferases (HKM) dont G9a, ou bien EZH2 appartenant au complexe Polycomb PRC2. Elles recrutent également ces complexes protéiques permettant le maintien et la propagation de la modification le long du génome. Ainsi, dans ce contexte, mes travaux de thèse ont eu pour objectif de caractériser deux facteurs épigénétiques potentiels reconnaissant les histones H3K9me et H3K27me et interagissant avec le complexe PRC2. Ces études ont permis de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans la régulation des cellules souches embryonnaires murines. Nos premières données ont montré que nos gènes candidats sont fortement exprimés dans les cellules souches embryonnaires murines (mESC) contrairement aux cellules différenciées. Par la suite, l’expression forcée d’un de ces facteurs altère la différenciation des CSE induite par le retrait de la cytokine LIF. Pour mieux comprendre comment le maintien de l’expression de notre facteur empêche la différenciation des cellules souches embryonnaires, nous avons analysé l’expression des facteurs de pluripotence Oct4, Nanog, Sox2 et Klf4. Nous avons noté un maintien de l’expression de ces facteurs ainsi que le maintien de la régulation des signaux intracellulaires intervenant en amont tels que: l’activation de la voie JAK-STAT3 pour le maintien à l’état pluripotent des ESC, et la diminution de la voie MAPK-ERK impliquée dans les processus de différenciation / Embryonic stem cells (ES cells) are an essential tool for biomedical research. They have the particularity to multiply indefinitely while keeping their stemness properties, and the incredible ability to generate all cell types of the body. These characteristics open up new perspectives for regenerative medicine but also for the development of new therapeutic trials. One of the major revolutions based on the cellular reprogramming of adult somatic cells into stem cells makes it possible to glimpse new therapeutic applications. Molecular mechanisms, such as DNA methylation, histone modifications, and the intervention of epigenetic factors in chromatin remodeling, play a critical role in cell reprogramming and pluripotency. The CSE epigenome must maintain not only the expression of genes associated with pluripotency but also allow rapid and specific activation of genes involved in cell differentiation. One of the modifications having an important role in the homeostasis of the CSE corresponds to histone methylations H3K9 and H3K27 essentially associated with transcriptional repression. These modifications are carried out by lysine methyltransferases (HKM) including G9a, or EZH2 belonging to the Polycomb PRC2 complex. They also recruit these protein complexes to maintain and propagate the change along the genome. Thus, in this context, my thesis work aimed to characterize two potential epigenetic factors recognizing histones H3K9me and H3K27me and interacting with the PRC2 complex. These studies have provided a better understanding of the role of these proteins in the regulation of murine embryonic stem cells. Our first data showed that our candidate genes are strongly expressed in murine embryonic stem cells CGR8 (mESC), unlike differentiated cells. Subsequently, the forced expression of one of these factors alters the CSE differentiation (CGR8) induced by LIF cytokine withdrawal. To better understand how maintaining the expression of our factor prevents the differentiation of embryonic stem cells, we analyzed the expression of pluripotency factors Oct4, Nanog, Sox2 and Klf4. We noted maintenance of the expression of these factors as well as the maintenance of the regulation of signals intervening upstream: including the maintenance of the activation of the JAK-STAT3 pathway for the maintenance of the pluripotent state, and the decrease of the MAPK-ERK pathway involved in differentiation processes

Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Thesis (M.Sc.). / Written for the Dept. of Animal Science. Title from title page of PDF (viewed 2009/07/07). Includes bibliographical references.

Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels. / Production of functional messenger RNA (mRNA) requires a complex mechanism that couples transcription with maturation and export of the mRNA. In addition to this mechanism, chromatin needs to be unwound to allow the transcription machinery access the DNA, this unwinding being also highly regulated. Thus, production of a functional mRNA requires a huge number of factors implicated in these different processes. Among these proteins Spt6 and Iws1 are participating in the mechanism of transcription, chromatin unwinding, and maturation and export of the mRNA. The work carried out during this thesis has enabled the biochemical, structural and functional characterization of these proteins, their complex and their interaction with other effectors of transcription. This work has specifically enabled the molecular and functional characterization (i) of the recruitment of Spt6 by RNA polymerase II and (ii) of the formation of the Spt6/Iws1 complex. Moreover, this work has identified putative new partners of Spt6, not ably the elongation factor TFIIS. Thus, our work has highlighted the essential and complex role of Spt6 and Iws1 during the production of functional mRNA, and has also enabled future studies of the complexes formed by these two proteins with other transcriptional factors.

Au sein du noyau, l'ADN est organise en chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. La structure de la chromatine est très dynamique, ce qui est nécessaire pour la plupart des opérations qui se produisent dans l'ADN telles que la réplication, la transcription, la réparation et la recombinaison. Le nucléosome est constitué de deux dimères H2A/H2B et deux dimères H3/H4 associés avec 147 paires de bases d'ADN. La protéine Nap1 est un chaperon d'histone H2A/H2B impliquée dans l'assemblage et démontage des nucléosomes. Nap1 protège les interactions non spécifiques entre l'ADN chargé négativement et les dimères H2A/H2B chargés positivement, afin de permettre la formation de la structure ordonnée des nucléosomes. Lors de l'assemblage des nucléosomes, les dimères d'histones H3/H4 sont déposés en premier lieu, suivi par le dépôt de dimères H2A/H2B. Lors du démontage du nucléosome, les dimères H2A/H2B sont retirés avant le retrait des dimères H3/H4. La determination de la structure du complexe Nap1-H2A/H2B pourra permettre une meilleure compréhension du processus d'assemblage du nucléosome. Dans cette étude, nous voulons comprendre comment le chaperon Nap1 cible spécifiquement les dimères d'histones H2A/H2B pour l'assemblage des nucléosomes. Notre objectif est de caractériser la structure et la fonction du complexe de Nap1-H2A/H2B. Ainsi nous nous sommes tout d'abord intéresse à la stoechiometrie de ce complexe. Nous avons trouvé qu'un dimère de Nap1 s'associe à un dimère H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). D'autre part, l'analyse par spectrométrie de masse non-dénaturante a montré que ce complexe de base peut s'oligomériser et contenir jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. L'analyse de ce complexe par spectrométrie de masse non-dénaturant a montré que ce complexe peu oligomériser dans un grand complexe contenant jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Nous avons également obtenu la première structure cristalline à basse résolution de ce complexe. L'analyse du même complexe par microscopie électronique à coloration négative a révélé la présence en solution du même oligomère que dans l'unité asymétrique du cristal, qui contient aussi 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles interfaces d'interaction entre les différents composants de ce complexe qui nous permettent de mieux comprendre le processus d'assemblage des nucléosomes. Le remodelage de la chromatine permet l'expression des gènes eucaryotes. Ce remodelage nécessite des enzymes telles que des histone acétyltransférases (HAT) et les chaperons d'histones. Les HATs acétylent les chaînes latérales des lysines. Il a été proposé que les HATs et les histones chaperons agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine pendant la transcription. La HAT p300 a été proposé d'interagir avec l'histone chaperon Nap1. Nous avons entrepris de caractériser cette interaction. Malheureusement, nos expériences n'ont pas pu détecter d'interaction directe entre ces protéines. / Assembly of chromatin is an essential process that concerns most DNA transactions in eukaryotic cells. The basic repeating unit of chromatin are nucleosomes, macromolecular complexes that consist of a histone octamer that organizes 147 bp of DNA in two superhelical turns. Although, the structures of nucleosomes are known in detail, their assembly is poorly understood. In vivo, nucleosome assembly is orchestrated by ATP-dependent remodelling enzymes, histone-modifying enzymes and a number of at least partially redundant histone chaperones. Histone chaperons are a structurally diverse class of proteins that direct the productive assembly and disassembly of nucleosomes by facilitating histone deposition and exchange. The currently accepted model is that nucleosome assembly is a sequential process that begins with the interaction of H3/H4 with DNA to form a (H3/H4)2 tetramer-DNA complex. The addition of two H2A/H2B dimers completes a canonical nucleosome. High-resolution structures of histone chaperons in complex with H3/H4 histones have resulted in detailed insights into the process of nucleosome assembly. However, our understanding of the mechanism of nucleosome assembly has been hampered by the as yet limited number of co-crystal structures of histone–chaperone complexes. In particular it remains unclear how histone chaperons mediate H2A/H2B deposition to complete nucleosome assembly. In this work, we have investigated the role of the H2A/H2B chaperon Nap1 (Nucleosome assembly protein 1) in nucleosome assembly. We have determined the crystal structure of the complex between Nap1 and H2A/H2B and analysed the assembly by various biophysical methods. The structure shows that a Nap1 dimer binds to one copy of H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). A large ~550 kDa macromolecular assembly containing 6 copies of the Nap12-H2A/H2B complex is seen in the asymmetric crystallographic unit. We confirmed by both non-denaturing mass spectroscopy and negative stain electron microscopy studies that this assembly is the predominant form of the Nap1_2-H2A/H2B complex in solution. We further investigated the potential interplay between p300-mediated histone acetylation and nucleosome assembly. Together, the structure and associated functional analysis provide a detailed mechanism for the Nap1 chaperon activity, its role in H2A/H2B deposition and in nucleosome assembly.

In this study, the brain of senescence accelerated mouse prone 8 (SAMP8) mice model was adopted to investigate PTMs state (especially methylation patterns) of core histones (H2A, H2B, H3 and H4). Seven methylated sites (H3K24, H3K27, H3K36, H3K79, H3R128, H4K20 and H2A R89) were detected by tandem matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS) analysis. The methylation of H3K27 and H3K36 demonstrated a modulating relationship and methylated H3K27 might contribute to the hypermethylation state and gene repression in aged brain. Western blotting results showed that mono-methylated H4K20 decreased during SAMP8 mice aging and di-methylated H3K79 decreased in the brain of 12-month-old SAMP8 mice compared with age-matched senescence accelerated-resistant mouse (SAMR1) control. Di-methylated H3K79 could express in neuron cells of cerebral cortex and hippocampus. Whereas, the number of H3K79 methylation negative cells was higher in the cortex of 12-month old SAMP8 mice than that of age-matched control SAMR1 mice. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) result indicated homeodomain transcription factor Pbx1 isoform 1 (Pbx1), transcription factors and transcriptional regulator proteins, such as T-box isoform 20, TetR family precursor BAZ2B and ribosomal protein, were recruited to methylated H3K79 site. Therefore, a model of methylated H3K79 on gene transcriptional regulation was proposed. Furthermore, the consequences of decreased H3K79 methylation in Neuro-2a (N2a) cells were investigated via transfection with Dot1 (disruptor of telomeric silencing) siRNA. After transfection, N2a cells displayed shorter neurite and less dendrite. Proteomic change in the N2a cells provided convincing evidence for the multi-function of decreased H3K79 methylation on transcriptional regulation, protein translation and folding, stress response and DNA breaks repair, which would contribute to brain dysfunction during neurodegenerative disease or aging. / Nowadays, many countries including China are experiencing aging populations. Aging has become the major risk factor for many diseases, such as neurodegenerative disease. The studies on the role of epigenetics in the aging process have grown tremendously in recent years. However, no systematic investigations have provided the information on histone post-translational modifications (PTMs) in aged brain and the roles of histone PTMs in brain aging are still unknown. / This study gave a new insight into the link between histone PTMs and brain aging. It could provide the experimental evidence for future studies and help us to better understand aging or neurodegenerative disease at epigenetic level. Furthermore, it could benefit for setting up the strategies for epigenetic therapy to neurodegenerative disease. / Wang, Chunmei. / Adviser: Ngai Saiming. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-01, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaf 136). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Le complexe SAGA (Spt-Ada-Gcn5 acetyl transferase) est un co-activateur transcriptionel, conservé chez les eucaryotes, qui participent à la transcription d’environ 10% des gènes chez la levure, où il fait le lien entre les composants du complexe de pré-initiation, tel que la TATA-box Binding Protein (TBP) et des activateurs, et modifie les histones dans le contexte de la chromatine (acétylation et déubiquitination). Ces travaux de thèse ont permis de décrire l’architecture moléculaire du complexe observée par microscopie électronique. Nous avons pu (i) localiser le module de déubiquitination au sein du complexe entier et ainsi (ii) définir une zone d’interaction avec le nucléosome ; (iii) montrer la présence de deux sites d’interaction avec la protéine TBP situé au niveau d’une « pince »moléculaire ; (iv) observer un lien fonctionnel entre le module de déubiquitination, en particulier de la protéine Sgf73, et les conformations adoptées par cette pince. / The SAGA complex (Spt-Ada-Gcn5 acetyl transferase) is a transcriptional coactivator, highly conserved in eukaryotes, involved in the transcription of 10% of the genes in yeast, where it bridges the components of the pre-initiation complex such as the TATA-box Binding Protein (TBP) and activators, as well as modifies histones in the chromatin template (acetylation and deubiquitination). This work has revealed the molecular architecture of the complex observed by electron microscopy. We could (i) localize the deubiquitination module within the whole complex and thus (ii) define the interaction surface with the nucleosome; (iii) reveal the presence of two TBP-interacting surfaces localized at the tips of a molecular clamp; (iv) observe a functional link between the deubiquitination module, in particular the Sgf73 protein, and the conformation adopted by this clamp.