Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-28. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:59Z : No. of bitstreams: 1 000854060_20160924.pdf: 173359 bytes, checksum: 751c8dda16bb9f3e364df6ed6ec0acfd (MD5) Bitstreams deleted on 2016-09-26T12:32:59Z: 000854060_20160924.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-26T12:33:34Z : No. of bitstreams: 1 000854060.pdf: 3213706 bytes, checksum: 918cc12ee2165eed29dfc4857e28e7a9 (MD5) / Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um fungo dimórfico causador da Histoplasmose, uma doença fúngica sistêmica que constitui um importante problema de saúde mundial. A infecção ocorre através da inalação de propágulos infectantes provenientes do meio ambiente. A capacidade de formação de biofilme por esse fungo foi caracterizada recentemente, porém ainda pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na sua formação. Neste caso, estudos com abordagens proteômicas seriam de fundamental importância para o entendimento da diferença entre a forma planctônica e o biofilme. Os antifúngicos usados na terapia convencional contra biofilmes não são eficientes, além disso, doses elevadas para perfusão destes fármacos nesta forma seriam tóxicas para os pacientes. O presente trabalho teve como objetivo verificar a atividade anti-Histoplasma de 92 compostos derivados de chalcona e do ácido protocatecuico; caracterizar o biofilme do isolado clínico H. capsulatum 317 e pesquisar compostos anti-biofilme buscando um provável mecanismo de ação através da análise proteômica diferencial entre o biofilme tratado e não tratado. Os testes de susceptibilidade foram realizados conforme o documento M27-A3, proposto pelo CLSI (2008). Os biofilmes foram formados em caldo BHI suplementado e a atividade metabólica foi determinada através do ensaio de redução do XTT. Para a caracterização da formação do biofilme e da ação do composto, utilizou-se a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal, enquanto que a massa do biofilme e a matriz extracelular foram quantificadas pelo cristal violeta e safranina. E como etapa final foi realizada a análise do perfil proteico dos biofilmes com e sem tratamento. Os melhores valores de concentração inibitória mínima (CIM) foram obtidos por seis derivados de chalconas (T50, C3, E2A, F2A, T18A e T46A) e... / Histoplasma capsulatum var. capsulatum is a dimorphic fungi that causes Histoplasmosis, a systemical fungal disease that is a major health problem worldwide. Infection occurs by inhalation of infective propagules from the environment. The biofilm formation by this fungi was characterized recently, however little is known about the mechanisms involved in their formation. In this case, studies with proteomic approaches would be of fundamental importance for understanding the difference between the planktonic and biofilm forms. The antifungal agents used in conventional therapy are not effective against biofilms, in addition, high doses of these drugs can be toxic to patients. This study aimed to verify the anti-Histoplasma activity of 93 compounds derived from chalcones and protocatechuic acid; characterize the biofilm formation by the clinical isolate H. capsulatum 317 and discover new anti-biofilm compounds searching for a mechanism of action by differential proteomics analysis, comparing the treated and untreated biofilms. Susceptibility tests were performed according to the document M27- A3, proposed by the CLSI (2008). The biofilms were formed in BHI broth supplemented and metabolic activity was determined by the XTT reduction assay. For the characterization of biofilm formation and action of the compound, was used the scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy, while the mass of the biofilm and the extracellular matrix were quantified by crystal violet and safranin. Lastly was performed the analysis of the protein profile of biofilms with and without treatment. The best minimum inhibitory concentration values (MIC) were obtained for six derivatives of chalcones (T50, C3, E2A, F2A, T18A and T46A) and nonyl protocatechuate (MIC = 3.9 mg/L). The clinical isolate H. capsulatum EH317 was able to form biofilms in vitro after 96 hours. After 96 hours, the biofilm ...

Introdução: A histoplasmose é uma infecção geralmente subclínica e autolimitada em pacientes imunocompetentes. A maioria dos pacientes com HIV apresenta a forma disseminada da doença, considerada definidora de aids. As manifestações cutâneo-mucosas da histoplasmose são variadas, dificultando o diagnóstico. Métodos: Estudo retrospectivo de 24 pacientes com diagnóstico de histoplasmose, avaliados no serviço de Dermatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, de 2000 a 2003 e, prospectivamente, mais 12 pacientes, atendidos em 2004 e 2005. A análise considerou dados epidemiológicos e demográficos, bem como os parâmetros clínicos, distribuição e morfologia das lesões, contagem de células CD4+, terapia da micose e antirretroviral e se a doença foi a definidora de aids. Resultados: Vinte e seis (72%) doentes eram homens. A idade média foi 34 anos (17-58) e 16 pacientes (49%) tiveram seus diagnósticos realizados de dezembro a março, no verão. A histoplasmose foi confirmada por biópsia cutânea em 33 casos e por cultura em 23 deles. Onze pacientes recebiam antirretrovirais no momento do diagnóstico e a sua contagem de células CD4+ variou de 2 a 103 (média 29 células/mm³). Não houve diferenças significativas em relação a sexo, idade, método diagnóstico e uso de antirretrovirais entre a amostra retrospectiva e prospectiva. O número médio de lesões foi 2,7, variando de 1 a 7 tipos diferentes em um mesmo paciente. Pápulas com crosta e erosão/úlcera de mucosa foram as mais frequentes, em 64% e 58% dos pacientes, respectivamente. Uma distribuição difusa foi a mais comum, em mais de 58% dos casos. Houve uma associação significativa entre a contagem de células CD4+ e a variabilidade morfológica de lesões por paciente, sendo que um menor polimorfismo de lesões está associado a contagens mais baixas de células CD4+. Conclusão: A familiaridade com as manifestações dermatológicas da histoplasmose é importante para uma maior suspeição tanto da doença, quanto do próprio HIV. Pápulas com crostas difusas e erosão/úlcera de mucosa, no verão, em pacientes com aids e contagem de células CD4+ menor do que 50 células/ mm³ são achados muito sugestivos de histoplasmose. Porém, é de suma importância a realização de exames complementares para a exclusão dos outros diagnósticos diferenciais. A maior variabilidade morfológica das lesões nos pacientes com menor comprometimento imunológico (CD4 maior) poderia ser devido à necessidade de um certo grau de imunidade na gênese das lesões cutâneas. / Mucocutaneous lesions of disseminated histoplasmosis in HIV-infected patients have a wide spectrum of clinical manifestations making the diagnosis very difficult. The authors conducted a retrospective and prospective study in 36 HIVinfected patients with mucocutaneous histoplasmosis in a tertiary-care hospital in Brazil. Eleven patients (30%) were taking antiretrovirals when diagnosed and their CD4+ cell counts ranged from 2 to 103 cells/mm³. The average number of lesions was 3 per patient, and each patient presented 1 to 7 different morphological types of lesions. Erythematous papules and plaques with crusts, and oral mucosa erosions or ulcers were the most frequent dermatological alterations found in 64% and 58% of the patients respectively. A diffuse pattern of distribution of the skin lesions was found in 58% of the cases. There was a significant association between the CD4+ cell counts and the morphological variability of lesions per patient. Polymorphism of lesions was associated with higher counts of CD4+ cells. Limitations include the retrospective part of the study, where the data was not collected for an unique examiner. Physicians caring for HIV-infected patients should be aware of the wide spectrum of dermatological lesions observed in disseminated histoplasmosis, besides the importance to detect and isolate the fungus in mucocutaneous tissues.

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Maria Aparecida de Resende Stoianoff / Banca: Juliana Campos Junqueira / Resumo: Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um fungo dimórfico causador da Histoplasmose, uma doença fúngica sistêmica que constitui um importante problema de saúde mundial. A infecção ocorre através da inalação de propágulos infectantes provenientes do meio ambiente. A capacidade de formação de biofilme por esse fungo foi caracterizada recentemente, porém ainda pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na sua formação. Neste caso, estudos com abordagens proteômicas seriam de fundamental importância para o entendimento da diferença entre a forma planctônica e o biofilme. Os antifúngicos usados na terapia convencional contra biofilmes não são eficientes, além disso, doses elevadas para perfusão destes fármacos nesta forma seriam tóxicas para os pacientes. O presente trabalho teve como objetivo verificar a atividade anti-Histoplasma de 92 compostos derivados de chalcona e do ácido protocatecuico; caracterizar o biofilme do isolado clínico H. capsulatum 317 e pesquisar compostos anti-biofilme buscando um provável mecanismo de ação através da análise proteômica diferencial entre o biofilme tratado e não tratado. Os testes de susceptibilidade foram realizados conforme o documento M27-A3, proposto pelo CLSI (2008). Os biofilmes foram formados em caldo BHI suplementado e a atividade metabólica foi determinada através do ensaio de redução do XTT. Para a caracterização da formação do biofilme e da ação do composto, utilizou-se a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal, enquanto que a massa do biofilme e a matriz extracelular foram quantificadas pelo cristal violeta e safranina. E como etapa final foi realizada a análise do perfil proteico dos biofilmes com e sem tratamento. Os melhores valores de concentração inibitória mínima (CIM) foram obtidos por seis derivados de chalconas (T50, C3, E2A, F2A, T18A e T46A) e... / Abstract: Histoplasma capsulatum var. capsulatum is a dimorphic fungi that causes Histoplasmosis, a systemical fungal disease that is a major health problem worldwide. Infection occurs by inhalation of infective propagules from the environment. The biofilm formation by this fungi was characterized recently, however little is known about the mechanisms involved in their formation. In this case, studies with proteomic approaches would be of fundamental importance for understanding the difference between the planktonic and biofilm forms. The antifungal agents used in conventional therapy are not effective against biofilms, in addition, high doses of these drugs can be toxic to patients. This study aimed to verify the anti-Histoplasma activity of 93 compounds derived from chalcones and protocatechuic acid; characterize the biofilm formation by the clinical isolate H. capsulatum 317 and discover new anti-biofilm compounds searching for a mechanism of action by differential proteomics analysis, comparing the treated and untreated biofilms. Susceptibility tests were performed according to the document M27- A3, proposed by the CLSI (2008). The biofilms were formed in BHI broth supplemented and metabolic activity was determined by the XTT reduction assay. For the characterization of biofilm formation and action of the compound, was used the scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy, while the mass of the biofilm and the extracellular matrix were quantified by crystal violet and safranin. Lastly was performed the analysis of the protein profile of biofilms with and without treatment. The best minimum inhibitory concentration values (MIC) were obtained for six derivatives of chalcones (T50, C3, E2A, F2A, T18A and T46A) and nonyl protocatechuate (MIC = 3.9 mg/L). The clinical isolate H. capsulatum EH317 was able to form biofilms in vitro after 96 hours. After 96 hours, the biofilm ... / Mestre

Introdução: A histoplasmose é uma infecção geralmente subclínica e autolimitada em pacientes imunocompetentes. A maioria dos pacientes com HIV apresenta a forma disseminada da doença, considerada definidora de aids. As manifestações cutâneo-mucosas da histoplasmose são variadas, dificultando o diagnóstico. Métodos: Estudo retrospectivo de 24 pacientes com diagnóstico de histoplasmose, avaliados no serviço de Dermatologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, de 2000 a 2003 e, prospectivamente, mais 12 pacientes, atendidos em 2004 e 2005. A análise considerou dados epidemiológicos e demográficos, bem como os parâmetros clínicos, distribuição e morfologia das lesões, contagem de células CD4+, terapia da micose e antirretroviral e se a doença foi a definidora de aids. Resultados: Vinte e seis (72%) doentes eram homens. A idade média foi 34 anos (17-58) e 16 pacientes (49%) tiveram seus diagnósticos realizados de dezembro a março, no verão. A histoplasmose foi confirmada por biópsia cutânea em 33 casos e por cultura em 23 deles. Onze pacientes recebiam antirretrovirais no momento do diagnóstico e a sua contagem de células CD4+ variou de 2 a 103 (média 29 células/mm³). Não houve diferenças significativas em relação a sexo, idade, método diagnóstico e uso de antirretrovirais entre a amostra retrospectiva e prospectiva. O número médio de lesões foi 2,7, variando de 1 a 7 tipos diferentes em um mesmo paciente. Pápulas com crosta e erosão/úlcera de mucosa foram as mais frequentes, em 64% e 58% dos pacientes, respectivamente. Uma distribuição difusa foi a mais comum, em mais de 58% dos casos. Houve uma associação significativa entre a contagem de células CD4+ e a variabilidade morfológica de lesões por paciente, sendo que um menor polimorfismo de lesões está associado a contagens mais baixas de células CD4+. Conclusão: A familiaridade com as manifestações dermatológicas da histoplasmose é importante para uma maior suspeição tanto da doença, quanto do próprio HIV. Pápulas com crostas difusas e erosão/úlcera de mucosa, no verão, em pacientes com aids e contagem de células CD4+ menor do que 50 células/ mm³ são achados muito sugestivos de histoplasmose. Porém, é de suma importância a realização de exames complementares para a exclusão dos outros diagnósticos diferenciais. A maior variabilidade morfológica das lesões nos pacientes com menor comprometimento imunológico (CD4 maior) poderia ser devido à necessidade de um certo grau de imunidade na gênese das lesões cutâneas. / Mucocutaneous lesions of disseminated histoplasmosis in HIV-infected patients have a wide spectrum of clinical manifestations making the diagnosis very difficult. The authors conducted a retrospective and prospective study in 36 HIVinfected patients with mucocutaneous histoplasmosis in a tertiary-care hospital in Brazil. Eleven patients (30%) were taking antiretrovirals when diagnosed and their CD4+ cell counts ranged from 2 to 103 cells/mm³. The average number of lesions was 3 per patient, and each patient presented 1 to 7 different morphological types of lesions. Erythematous papules and plaques with crusts, and oral mucosa erosions or ulcers were the most frequent dermatological alterations found in 64% and 58% of the patients respectively. A diffuse pattern of distribution of the skin lesions was found in 58% of the cases. There was a significant association between the CD4+ cell counts and the morphological variability of lesions per patient. Polymorphism of lesions was associated with higher counts of CD4+ cells. Limitations include the retrospective part of the study, where the data was not collected for an unique examiner. Physicians caring for HIV-infected patients should be aware of the wide spectrum of dermatological lesions observed in disseminated histoplasmosis, besides the importance to detect and isolate the fungus in mucocutaneous tissues.

Thèse d'exercice : Médecine. Biologie médicale : Paris 12 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 76-88.

O Histoplasma capsulatum (H.capsulatum) é um fungo dimórfico patogênico e responsável por graves lesões pulmonares, as quais se caracterizam pelo acúmulo de leucócitos ao redor do fungo, resultando na formação de granulomas. A infecção ocorre principalmente pela inalação de conídios ou pequenos fragmentos de micélio que alcançam os alvéolos, onde se transformam em leveduras, que é a forma patogênica do fungo. Na resposta imune do hospedeiro, as integrinas participam nos mecanismos fagocíticos, essenciais na resposta à histoplasmose. As 2integrinas contêm uma cadeia 2, também conhecida como CD18, comum a várias moléculas de adesão, e uma cadeia variável. Até o momento foram identificadas quatro cadeias distintas: L, a qual forma o dímero L2, também conhecido como LFA-1 (do inglês leukocyte function antigen-1) ou CD11aCD18; m, formando m2, chamado Mac-1 (do inglês macrophage differentiation antigen 1) ou CR3 (do inglês complement receptor 3) ou CD11bCD18; x, formando x2, CD11cCD18, gp150, 95 ou CR4 (do inglês complement receptor 4) e a cadeia d, formando d2, CD11dCD18. Neste trabalho, investigamos o papel da molécula CD18 em macrófagos alveolares (MAs) e macrófagos peritoneais (MPs) nas funções efetoras contra H. capsulatum e a relação do leucotrieno B4 (LTB4) nestas respostas. Inicialmente confirmamos que MAs e MPs provenientes dos animais CD18low, expressam baixa porcentagem de CD11bCD18 (CR3). Demonstramos que, como esperado, MAs e MPs de ambos os grupos fagocitam mais leveduras opsonizadas com complemento do que não opsonizadas. Surpreendentemente, MAs de animais CD18low fagocitam 136% mais leveduras opsonizadas do que MAs de C57BL/6. Também, MPs destes animais fagocitam aproximadamente 240% mais leveduras quando infectados com H. capsulatum e opsonizados, quando comparados aos MPs de C57BL/6. A adição de LTB4 aumenta a atividade fagocítica em 520% por MAs de animais C57BL/6 e 200% por MAs de CD18low, enquanto que a adição de LTB4 aumentou a fagocitose dos MPs de animais C57BL/6 em 600% vezes quando comparado aos MPs de CD18low. Este fenômeno foi inibido pela pré-incubação destas células com antagonista específico do receptor BLT1 apenas em animais C57BL/6. A adição de LTB4 na cultura de MPs reduziu a porcentagem de morte das leveduras apenas nos animais C57BL/6. Os animais CD18low produzem espontaneamente mais LTB4 e apresentaram um grande aumento na produção de óxido nítrico quando comparados aos animais C57BL/6. Pacientes acometidos pela Doença Granulomatosa Crônica (DGC) possuem deficiência congênita da molécula CD18. Células fagocíticas isoladas do sangue periférico de pacientes com DGC foram incubadas com leveduras opsonizadas e assim como macrófagos de animais deficientes de CD18, fagocitam mais leveduras opsonizadas (900%) ou não (300%), quando comparado com células de indivíduos sadios. Sugerimos que a molécula CD18 tem importante participação nos mecanismos efetores da imunidade inata, por mecanismo dependente de mediadores lipídicos, como o LTB4, no controle dos mecanismos de defesa contra H. capsulatum. / Histoplasma capsulatum (H. capsulatum) is a pathogenic dimorphic fungus and its infection is characterized by accumulation of leukocytes and granuloma formation. Infection occurs mainly by fungal inhalation that reaches the alveoli, which became yeast (the pathogenic form). in the immune response of host, integrins participate in phagocytic mechanisms, fundamental in the response against histoplasmosis.,8^2-integrin has a 02 chain known as CD18, usual to many adhesion molecules, and a variable a chain. Until the moment, it was identified four variable a chains: aL, that constitutes the dimer aL,82, also known as LFA-1 (leukocyte function antigen) or CD11aCD18; am forming the a^m,B^2 or Mac-1 (macrophage differentiation antigen 1) and CR3 (complement receptor 3) and CD11bCD18; ax, constituting the dimer Able CD11cCD18, gp150, 95 or CR4 (complement receptor 4) and ad chain, that constitutes a^d,8^2, CD11dCD18. In the present study, we sought to investigate the effect of CD18 in alveolar (AMs) and peritoneal macrophages (PMs) effecter functions against H. capsulatum and the relation of LTB^4 in those responses. We confirm that AMs and PMs of CD18\'°^W mice have low expression of ,32-integrin compared to wild type mice (WT). We demonstrate that, as expected, AMs and PMs from WT and CD18\'°^W, phagocytosed more complement (C)-opsonized yeasts than the unopsonized yeasts. Surprisingly, AMs from CD18\'°^Wmice phagocytosed 136% more (C)-opsonized yeasts than AMs obtained from WT. Also, PMs of CD18^b°^W mice phagocytosed 240% more (C)-opsonized yeasts than PMs of WT. The addition of LTB^4, increases the phagocytic activity by AMs of WT mice in 520% and by AMs from CD18\'°^W mice in 200%, while the addition of LTB^4 only increased the phagocytosis of C-opsonized H. capsulatum by PMs of C57BL/6 mice in 600%, when compaired with PMs from CD18\'°^W mice. This phenomenon was inhibited by pretreatment of these cells with an especific BLT1 receptor antagonist only in PMs from C57BU6 mice. The addition of LTB^4 in the culture of MPs reduced the percentage of death of yeasts in animals C57BL/6. CD18\'°^W mice, spontaneously produce more LTB^4 and showed a large increase in the production of nitric oxide when compared to C57BU6. Patients affected by Chronic Granulomatous Disease (DGC) have congenital deficiency of the CD18 molecule. Phagocytic cells isolated from peripheral blood of patients with DGC were incubated with C-opsonized yeasts and as well as macrophages from CD18\'°^W, phagocytosed more C-opsonized yeasts (900%) or not (300%) when compared with cells from healthy individuals.Therefore, we suggest that the CD18 molecule has important participation in the effector mechanisms of innate immunity, a mechanism dependent on lipid mediators such as LTB^4, to control these mechanisms in defense against H. capsulatum.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-10-30T12:35:30Z No. of bitstreams: 1 TESE MESTRE BEATRIZ ELENA PORRAS PEDROZA PARA O CD.pdf: 1521319 bytes, checksum: b04314ba0b6ed87024348ea0795b1014 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T12:35:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE MESTRE BEATRIZ ELENA PORRAS PEDROZA PARA O CD.pdf: 1521319 bytes, checksum: b04314ba0b6ed87024348ea0795b1014 (MD5) Previous issue date: 2003 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Foi feito estudo descritivo, retrospectivo de uma série de casos de histoplasmose associada à HIV/AIDS no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC) no período de Janeiro de 1987 a Setembro de 2002, mediante a revisão de prontuários. Em 2020 casos de HIV+ foram diagnosticados 35 casos da micose, dos quais 32 desenvolveram histoplasmose disseminada oportunista e 3 apresentaram infecção por Histoplasma capsulatum demonstrada laboratorialmente. A maioria dos casos de histoplasmose era procedente do estado do Rio de Janeiro (97,14%), principalmente da cidade do Rio de Janeiro (80%), sendo a maioria natural do mesmo estado (71,42%). Como perfil predominante da casuística tivemos: sexo masculino (87%), comportamento heterossexual predominante (40%), seguindo-se bissexual (17,1%); escolaridade: primeiro grau (42,9%) e profissão de diferentes categorias de nível técnico ou serviços primários. Desemprego foi observado em 17,1%, tabagismo em 45,71% e etilismo em 60%. Atividades de risco não foram relacionadas aos casos de histoplasmose, excetuando-se um caso em que se identificou viagem recente para outra área endêmica com soroconversão. A histoplasmose disseminada oportunista ocorreu em 1,58% (32/2020) dos pacientes HIV+ na série estudada. Com 1,99% (27/1352) no sexo masculino e 0,74% (5/668) no sexo feminino.. A associação de histoplasmose disseminada em AIDS nesta mesma série foi de 3,21% (32/996) sem evidente variação de freqüência ao longo do período de estudo. Houve predomínio do sexo masculino 3,92% (27/668) sobre o feminino 1,62% (5/308), na associação histoplasmose disseminada oportunista em AIDS nesta mesma série, sugerindo que homens com AIDS apresentem mais chances de adoecer por histoplasmose do que mulheres. No entanto esta possibilidade depende de futuros estudos. O principal conjunto de manifestações clínicas da histoplasmose disseminada oportunista foi de caráter sistêmico (febre, perda de peso), seguindo-se manifestações respiratórias e do sistema reticuloendotelial. No raio X de tórax predominou o padrão intersticial microondular, retículo nodular ou misto, com ou sem linfonodomegalia em 37,5% (6/16). Chamou a atenção a freqüência da menigoencefalite por H. capsulatum nas formas disseminadas da histoplasmose em AIDS 12,5% (4/32). A presentação cutâneo mucosa ocorreu em 3 casos (9,37%) 3/32. A histoplasmose disseminada oportunista ocorreu como doença definidora de AIDS em 23 casos, sendo que, como causa única definidora de AIDS em 12,5% (4/32) e como causa associada a outras infecções oportunistas em 59,37% (19/32). Nos demais (28,12%) a histoplasmose apresentou-se em pacientes que já tinham AIDS (9/32). Diferentes co-morbidades infecciosas foram observadas nos casos de histoplasmose disseminada oportunista em 84,37% (27/32) chamando a atenção à tuberculose com 12,5% (4/32).. O diagnóstico micológico através do cultivo foi o principal meio de diagnóstico, sendo que o exame direto de espécimes clínicos para histoplasma foi de baixo rendimento. A imunodifusão dupla foi negativa em 68,5% (22/32), sendo que naqueles positivos somente a banda M foi detectada. O CD4 presentou níveis baixoa (10 cel/mm³ a 288 cel/mm³) em 12 casos de histoplasmose disseminada oportunista analisados. Dos pacientes que foram para óbito 59,37% (19/32), 4 encontravam-se em uso de monoterapia ARV e o restante era virgem de tratamento. Quando consideramos óbito segundo disponibilidade de esquema ARV no Brasil, em três períodos distintos 1897-1990, 1991-1995, 1996-2002, na série analisada no IPEC o óbito foi significativamente reduzido nos casos de histoplasmoses disseminada oportunista no período do uso de HHART. A associação da histoplasmose à AIDS não mudou significativamente sua freqüência de ocorrência na série analisada, mas é possível que esquema HAART esteja implicando melhor evolução dos casos e redução da letalidade por recuperação parcial da imunidade celular

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcos_almeida_ini_mest_2014.pdf: 14714832 bytes, checksum: be975491bb39d63940e3b535442ff649 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é uma micose cosmopolita causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, cujo habitat é o solo rico em excretas de aves e morcegos. Esta infecção ocorre a partir da inalação de propágulos de H. capsulatum e apresenta um amplo espectro clínico, variando de formas leves a disseminadas, a depender do inóculo infectante, do status imunológico do hospedeiro e da virulência da cepa. O diagnóstico da histoplasmose é baseado em aspectos clínicos, epidemiológicos, radiológicos e laboratoriais, embora alguns sintomas possam ser confundidos com outras doenças, tais como a tuberculose e outras micoses. O teste de referência para a confirmação do diagnóstico é o isolamento e identificação de H. capsulatum em cultivo. Entretanto, na ausência dos mesmos, a sorologia tem sido utilizada para o diagnóstico presuntivo da histoplasmose através da detecção de anticorpos. O principal complexo antigênico utilizado para a detecção de anticorpos anti-H. capsulatum é a histoplasmina, constituída principalmente pelos antígenos C, H e M. Estes últimos, em sua forma nativa, são glicoproteínas contendo epítopos protéicos específicos e glicosídicos inespecíficos. Deglicosilações químicas pelo metaperiodato de sódio (NaIO4) provaram aumentar a sensibilidade e especificidade em métodos imunoenzimáticos, tais como Western blot e ELISA, reduzindo a reatividade cruzada com outros fungos O principal objetivo do presente estudo foi validar o método imunoenzimático (Western blot) para a detecção de anticorpos no diagnóstico da histoplasmose. Desta forma, foi realizado um estudo casocontrole, utilizando 118 amostras de soro de pacientes com histoplasmose e 118 amostras de soro de indivíduos com história clínico-epidemiológica compatível com micose sistêmica, saudáveis ou acometidos por outra micose ou tuberculose, residentes no estado do Rio de Janeiro. As amostras foram coletadas no período de 2000 a 2013 e encaminhadas ao Laboratório de Micologia do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Os parâmetros de validação diagnóstica foram calculados considerando a categorização dos resultados obtidos em uma tabela 2 X 2 e analisados pelo SPSS 17.0. O Western blot demonstrou uma sensibilidade de 94,9%, especificidade de 94,1%, acurácia de 94,5% e uma precisão quase perfeita. As fitas demonstraram-se viáveis para utilização por até cinco anos após a sensibilização com o antígeno HMIN-PT. Estes resultados comprovam a validade do ensaio imunoenzimático (Western blot) para detecção de anticorpos anti-H. capsulatum utilizando HMIN-PT como uma ferramenta de boa acurácia no diagnóstico da histoplasmose e reprodutível. Desta forma, contribuindo para o melhoramento do diagnóstico desta micose, uma vez que esta técnica permitirá a obtenção de resultados em menos de 24 horas, o que supõe um grande avanço a despeito das técnicas existentes na atualidade e poderá vir a ser implantada e disponibilizada para outros centros do Sistema Único de Saúde. / Histoplasmosis is a worldwide systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. The fungus lives in soil that contains large amounts of birds or bats droppings. This infection occurs through inhalation of spores of H. capsulatum and has a wide clinical spectrum, ranging from mild to disseminated forms that depend on the infecting inoculum, the immune status of the host and the virulence of the strain. The diagnosis of histoplasmosis is based on clinical, epidemiological, radiological and laboratory aspects; however, some symptoms may be confused with other diseases, such as tuberculosis and other mycoses. The reference test for the confirmation of the diagnosis of histoplasmosis is the isolation and identification of H. capsulatum in culture. However, in the absence of it, serology has been used for the presumptive diagnosis of histoplasmosis through antibody detection. The principal antigenic complex used to detect antibodies anti-H. capsulatum is the histoplasmin, consisting mainly of antigens C, H and M. These antigens, in their native forms, are glycoproteins containing specie-specific protein epitopes and non-specific glycosides. Chemical deglycosylations by sodium metaperiodate (NaIO4) have shown to increase the sensitivity and specificity of immunoenzymatic methods, such as Western blot and ELISA, reducing cross-reactivity with other fungi. The aim of this study was to validate the immunoassay method (Western blot) to detect antibodies in the diagnosis of histoplasmosis Therefore, a case-control study was conducted using 118 serum samples from patients with histoplasmosis, and 118 serum samples from individuals with clinical and epidemiological history compatible with systemic mycosis, either healthy or suffering from other mycosis or tuberculosis. These patients were residents in the state of Rio de Janeiro and the samples, collected from 2000 to 2013, were sent to the Mycology Laboratory of the Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Diagnostic validation parameters were calculated based on the categorization of results obtained in a 2 x 2 table and analyzed using SPSS Statistics 17.0. The Western blot was shown sensitivity of 94.9%, specificity of 94.1%, accuracy of 94.5% and also almost perfect precision. Besides, the strips have been proved to be viable for use or at least five years after the sensitization with antigen HMIN-PT. These results prove the validity of the enzyme immunoassay (Western blot) for the detection of antibodies anti-H. capsulatum, using HMIN-PT as a good accuracy tool in the diagnosis of histoplasmosis and reproducible, contributing to improve the diagnosis of this mycosis, since this technique allows obtaining results in less than 24 hours which implies a breakthrough despite existing at present and will eventually be deployed and made available to other centers belonging to the Public Health System

O Histoplasma capsulatum (H.capsulatum) é um fungo dimórfico patogênico e responsável por graves lesões pulmonares, as quais se caracterizam pelo acúmulo de leucócitos ao redor do fungo, resultando na formação de granulomas. A infecção ocorre principalmente pela inalação de conídios ou pequenos fragmentos de micélio que alcançam os alvéolos, onde se transformam em leveduras, que é a forma patogênica do fungo. Na resposta imune do hospedeiro, as integrinas participam nos mecanismos fagocíticos, essenciais na resposta à histoplasmose. As 2integrinas contêm uma cadeia 2, também conhecida como CD18, comum a várias moléculas de adesão, e uma cadeia variável. Até o momento foram identificadas quatro cadeias distintas: L, a qual forma o dímero L2, também conhecido como LFA-1 (do inglês leukocyte function antigen-1) ou CD11aCD18; m, formando m2, chamado Mac-1 (do inglês macrophage differentiation antigen 1) ou CR3 (do inglês complement receptor 3) ou CD11bCD18; x, formando x2, CD11cCD18, gp150, 95 ou CR4 (do inglês complement receptor 4) e a cadeia d, formando d2, CD11dCD18. Neste trabalho, investigamos o papel da molécula CD18 em macrófagos alveolares (MAs) e macrófagos peritoneais (MPs) nas funções efetoras contra H. capsulatum e a relação do leucotrieno B4 (LTB4) nestas respostas. Inicialmente confirmamos que MAs e MPs provenientes dos animais CD18low, expressam baixa porcentagem de CD11bCD18 (CR3). Demonstramos que, como esperado, MAs e MPs de ambos os grupos fagocitam mais leveduras opsonizadas com complemento do que não opsonizadas. Surpreendentemente, MAs de animais CD18low fagocitam 136% mais leveduras opsonizadas do que MAs de C57BL/6. Também, MPs destes animais fagocitam aproximadamente 240% mais leveduras quando infectados com H. capsulatum e opsonizados, quando comparados aos MPs de C57BL/6. A adição de LTB4 aumenta a atividade fagocítica em 520% por MAs de animais C57BL/6 e 200% por MAs de CD18low, enquanto que a adição de LTB4 aumentou a fagocitose dos MPs de animais C57BL/6 em 600% vezes quando comparado aos MPs de CD18low. Este fenômeno foi inibido pela pré-incubação destas células com antagonista específico do receptor BLT1 apenas em animais C57BL/6. A adição de LTB4 na cultura de MPs reduziu a porcentagem de morte das leveduras apenas nos animais C57BL/6. Os animais CD18low produzem espontaneamente mais LTB4 e apresentaram um grande aumento na produção de óxido nítrico quando comparados aos animais C57BL/6. Pacientes acometidos pela Doença Granulomatosa Crônica (DGC) possuem deficiência congênita da molécula CD18. Células fagocíticas isoladas do sangue periférico de pacientes com DGC foram incubadas com leveduras opsonizadas e assim como macrófagos de animais deficientes de CD18, fagocitam mais leveduras opsonizadas (900%) ou não (300%), quando comparado com células de indivíduos sadios. Sugerimos que a molécula CD18 tem importante participação nos mecanismos efetores da imunidade inata, por mecanismo dependente de mediadores lipídicos, como o LTB4, no controle dos mecanismos de defesa contra H. capsulatum. / Histoplasma capsulatum (H. capsulatum) is a pathogenic dimorphic fungus and its infection is characterized by accumulation of leukocytes and granuloma formation. Infection occurs mainly by fungal inhalation that reaches the alveoli, which became yeast (the pathogenic form). in the immune response of host, integrins participate in phagocytic mechanisms, fundamental in the response against histoplasmosis.,8^2-integrin has a 02 chain known as CD18, usual to many adhesion molecules, and a variable a chain. Until the moment, it was identified four variable a chains: aL, that constitutes the dimer aL,82, also known as LFA-1 (leukocyte function antigen) or CD11aCD18; am forming the a^m,B^2 or Mac-1 (macrophage differentiation antigen 1) and CR3 (complement receptor 3) and CD11bCD18; ax, constituting the dimer Able CD11cCD18, gp150, 95 or CR4 (complement receptor 4) and ad chain, that constitutes a^d,8^2, CD11dCD18. In the present study, we sought to investigate the effect of CD18 in alveolar (AMs) and peritoneal macrophages (PMs) effecter functions against H. capsulatum and the relation of LTB^4 in those responses. We confirm that AMs and PMs of CD18\'°^W mice have low expression of ,32-integrin compared to wild type mice (WT). We demonstrate that, as expected, AMs and PMs from WT and CD18\'°^W, phagocytosed more complement (C)-opsonized yeasts than the unopsonized yeasts. Surprisingly, AMs from CD18\'°^Wmice phagocytosed 136% more (C)-opsonized yeasts than AMs obtained from WT. Also, PMs of CD18^b°^W mice phagocytosed 240% more (C)-opsonized yeasts than PMs of WT. The addition of LTB^4, increases the phagocytic activity by AMs of WT mice in 520% and by AMs from CD18\'°^W mice in 200%, while the addition of LTB^4 only increased the phagocytosis of C-opsonized H. capsulatum by PMs of C57BL/6 mice in 600%, when compaired with PMs from CD18\'°^W mice. This phenomenon was inhibited by pretreatment of these cells with an especific BLT1 receptor antagonist only in PMs from C57BU6 mice. The addition of LTB^4 in the culture of MPs reduced the percentage of death of yeasts in animals C57BL/6. CD18\'°^W mice, spontaneously produce more LTB^4 and showed a large increase in the production of nitric oxide when compared to C57BU6. Patients affected by Chronic Granulomatous Disease (DGC) have congenital deficiency of the CD18 molecule. Phagocytic cells isolated from peripheral blood of patients with DGC were incubated with C-opsonized yeasts and as well as macrophages from CD18\'°^W, phagocytosed more C-opsonized yeasts (900%) or not (300%) when compared with cells from healthy individuals.Therefore, we suggest that the CD18 molecule has important participation in the effector mechanisms of innate immunity, a mechanism dependent on lipid mediators such as LTB^4, to control these mechanisms in defense against H. capsulatum.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-15T13:16:58Z No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T13:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 allan_j_guimaraes_ioc_bcm_0029_2006.pdf: 1714817 bytes, checksum: d2edc214a8508b65add7f8db0b664ce0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Microbiologia Paulo de Góes. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A histoplasmose é causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum. A infecção por este organismo é freqüentemente diagnosticada pela determinação da presence de anticorpos para a proteína M, imunodominante, mas o papel deste antígeno na patogênese da histoplasmose permanence obscuro. A função do antígeno M não é conhecida, mas geneticamente esta proteína é homologa catalases fúngicas. Em nosso estudo, nós procuramos determinar regiões imunodominantes do antígeno M, produzir um painel de anticorpos monoclonais contra esta proteína, caracterizá-los, usá-los para o mapeamento de epítopos, mostrar a localização do antígeno M na levedura do H. capsulatum, demonstrar a atividade de catalase desta proteína e desenvolver imunoensaios para a detecção de anticorpos contra esta proteína e entígeno M circulante nos fluidos corporais. Foi possível determinar peptídeos com maior atividade antigênica e suas localizações na molécula e caracterizá-los de acordo com as suas propriedades bioquímicas. Nós geramos três fragmentos que continham estes peptídeos e os utilizamos para avaliar a ligação dos anticorpos monoclonais e reconhecimento a cada fragmento separadamente. Um dos fragmentos, F3, mostrou maior ligação aos anticorpos monoclonais que os outros avaliados, entretanto estudos adicionais devem ser avaliados para um complete mapeamento. Para avaliar o papel do antígeno M na patogênese da histoplasmose, usando análise por imunoblot de um extrato de parede celular e membrana (CW/M) obtido de levedura, provamos que os mAbs gerados contra o antígeno M recombinante puderam reconhecer este antígeno no extrato utilizado. Estudos de imunofluorescencia também revelaram que os mAbs reconheciam proteínas na superfície da levedura. Adicionalmente, avaliamos a atividade de catalase usando diferentes frações celulares para sugerir a localização da enzima e confirmamos que a maior atividade de catalase estava presente nos extratos incluindo antígenos de superfície. A capacidade do antígeno M em funcionar como catalase sugere que esta enzima está provavelmente envolvida na proteção pelas leveduras contra o stress oxidativo na interior do fagolisossomo e escape dos mecanismos fungicidas nos macrófagos. A localização do antígeno M na superfície do Hc tem importantes implicações na antigenicidade da proteína já que está acessível ao sistema imunológico do hospedeiro e interações com os anticorpos. Adicionalmente, a ELISA para a detecção de anticorpos utilizando histoplasmina purificada e tratada (ptHMIN) mostrou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 96%, enquanto a ELISA para a detecção de antígenos mostrou uma sensibilidade de 80% e uma especificidade de 91%, provando que estas duas metodologias poderiam ser utilizadas no diagnóstico da histoplasmose. / Histoplasmosis is caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. Infection with this organism is often diagnosed by determining the presence of antibody to the immunodominant M antigen, but the role of the M antigen in the pathogenesis of histoplasmosis has previously not been elucidated. The function of the M protein is not known, but genetically it is homologous to fungal catalases. In our work, we sought to determine immunodominant regions of the M antigen, create a monoclonal antibodies panel, characterize them, use them for epitope mapping, show that the M antigen was located on the cell surface of H. capsulatum yeasts, demonstrate the catalase activity of the protein and developed an immunoassay to detect antibodies against this protein and another one to detect the circulating M antigen in body fluids. We could determine the peptides that have the most antigenic activity and their localization on the molecule, and characterize according to biochemical properties. We generated three fragments containing these peptides and used to evaluate the monoclonal antibodies binding and recognition to each fragment. We could see that one fragment, the F3, showed more binding to the mAbs than the other two, but additional studies have to be done to complete the epitope mapping. To evaluate the role of the M antigen on the pathognesis of histoplasmosis, using Western blot analysis of a detergent extract of cell walls and cell membranes (CW/M) from yeast cells, we found that mAbs generated to recombinant M antigen reacted with the CW/M preparations. Immunofluorescence studies also revealed that the mAbs to the M antigen labeled the yeast cell surface. Also, we assayed the catalase activity using different cell extract fractions for the localization of the enzyme and confirmed that the major activity was present in extracts including fungal surface antigens. The ability of the M antigen to function as a catalase suggests that this enzyme is probably involved in protecting the yeast cells against the oxidative stress within the phagolisossome and escaping of the fungicidal mechanisms in the macrophages. Localization of the M antigen to the cell surface of Hc has important implications for the antigenicity of the protein since it demonstrates that it is accessible to host immune cells and for antibody interactions. Also, the ELISA for antibody detection using purified and treated histoplasmin (ptHMIN) showed a sensitivity of 92% and a specificity of 96%, while the ELISA for antigen detection showed a sensitivity of 80% and a specificity of 91%, proving that these two methodologies could be used in the diagnosis of histoplasmosis.