La hidrólisis de celulosa a azúcares fermentables es una de las etapas clave que deben ser optimizadas para disminuir el costo de producción de bioetanol producido a partir de lignocelulosa, materia prima abundantemente disponible en Chile en desechos agrícolas y forestales. La hidrólisis de celulosa es catalizada por enzimas celulasas, pertenecientes al grupo de las glicosil hidrolasas. Este Trabajo de Memoria de Título tiene como objetivo la identificación y clonación de glicosil hidrolasas, con énfasis en enzimas potencialmente útiles en procesos de producción de bioetanol. La estrategia general de trabajo consistió en la identificación y selección de cepas capaces de degradar celulosa cristalina, a las cuales se dirigió un método de obtención de fragmentos de DNA codificantes de glicosil hidrolasas, enfocado a la actividad exoglucanasa. Un análisis in sílico de la secuencia de los fragmentos de DNA obtenidos indicó que se obtuvieron fragmentos de genes con actividades putativas β-1,3(4)-glucanasa y α-glucosidasa provenientes de cepas de Lentinula edodes y Peniophora gigantea, respectivamente. Estos resultados poseen altos niveles de confianza (con e-values del orden de 10-9 y 10-30, respectivamente). El fragmento correspondiente a la β-1,3(4)-glucanasa contiene el dominio catalítico conservado característico de este tipo de enzimas. Se estima que los fragmentos encontrados representan un 38% de una β-1,3(4)-glucanasa y un 12% de una α-glucosidasa. El método también produjo la obtención de fragmentos de DNA que codificarían enzimas con otras actividades no relacionadas con glicosil hidrolasas, específicamente una transcriptasa reversa y un transportador de urea. Las enzimas β-1,3(4)-glucanasas y α-glucosidasas son potencialmente aplicables en la etapa de pretratamiento de lignocelulosa en la producción de bioetanol de segunda generación y en la etapa de degradación de almidón en la producción de bioetanol de primera generación, respectivamente, entre otras aplicaciones industriales de menor interés para este trabajo. En conclusión, se logró clonar fragmentos de dos glicosil hidrolasas potencialmente aplicables en un proceso de producción de bioetanol. La estrategia utilizada deberá ser perfeccionada para hacerla más específica, logrando el diseño de partidores degenerados más específicos o bien considerando una estrategia global alternativa, tal como utilizar una genoteca de cDNA como templado del método en lugar de DNA genómico.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Los hongos filamentosos de ambientes extremos son fuentes promisorias de metabolitos secundarios de carácter novedoso. En particular, el género fúngico Pseudogymnoascus, que habita distintos ambientes fríos, entre ellos la Antártida, posee un metabolismo secundario poco explorado. En estudios previos de la cepa fúngica antártica Pseudogymnoascus sp. 131209-E2A-C5II-EB se identificaron los genes codificantes para enzimas policétido sintasa GymB, GymC, GymD y Gym722, de los cuales solo los dos primeros se expresaron fuertemente en las condiciones de cultivo ensayadas. El objetivo de este trabajo fue identificar nuevos genes codificantes para enzimas policétido sintasa en la cepa Pseudogymnoascus sp 131209-E2A-C5II-EB, e identificar las condiciones de cultivo en las cuales se induce su expresión. Para encontrar estas condiciones de cultivo adecuadas se emplearon distintos medios de cultivo (aproximación OSMAC) y el remodelador de cromatina 5-azacitidina. Por último, se realizaron las primeras actividades para, mediante la técnica de ARN de interferencia, identificar el metabolito sintetizado por la ruta de biosíntesis de la que forma parte el gen GymD. En resumen, en este trabajo se identificó un nuevo gen codificante para una enzima policétido sintasa, al cual se denominó Gym36. Por otro lado, mediante la aproximación OSMAC, se identificó que el medio PDB es donde se obtienen mayores niveles de inducción de manera generalizada de los genes estudiados (a excepción de Gym722 que se mantuvo sin expresión). La adición del remodelador de cromatina 5-azacitidina no logró inducir la expresión de los genes estudiados, pero si se observó que la adición de dimetilsulfóxido logró alterar positivamente los niveles de expresión de estos. Finalmente, por electroporación de conidias germinadas, se logró obtener una cepa transformante de la cepa en estudio con el gen GymD atenuado. Como trabajo futuro, se espera que al contar con un mayor número de cepas atenuantes se pueda identificar el metabolito sintetizado por la ruta de biosíntesis de la que forma parte el gen. / Filamentous fungi from extreme environments are a promising source of novel secondary metabolites. In particular, fungal genus Pseudogymnoascus, which inhabits different cold environments, including Antarctica, has a secondary metabolism that has been poorly explored. In previous studies of the Antarctic fungal strain Pseudogymnoascus sp. 131209-E2A-C5II-EB the genes coding for polyketide synthase enzymes GymB, GymC, GymD and Gym722 were identified, of which only the first two were strongly expressed in the tested culture conditions. The objective of this work was to identify new coding genes for polyketide synthase enzymes in the strain Pseudogymnoascus sp 131209-E2A-C5II-EB, and to identify the culture conditions in which their expression is induced. To find these suitable culture conditions, different culture media (OSMAC approach) and the 5-azacitidine chromatin remodeler were used. Finally, the first activities were carried out to identify, through the RNA interference technique, the metabolite synthesized by the biosynthesis pathway to which the GymD gene belongs. In summary, in this work it was identified a new gene coding for a polyketide synthase enzyme, named Gym36. On the other hand, through the OSMAC approach, it was found that the PDB medium is where the highest levels of induction are obtained in a generalized manner of the genes studied (with the exception of Gym722 that remained silent). The addition of the chromatin remodeler 5-azacitidine failed to induce the expression of the genes studied, but it was observed that the addition of dimethylsulfoxide was able to positively alter the expression levels of these. Finally, by electroporation of germinated conidia, it was possible to obtain a transformant strain of the studied strain with the GymD gene attenuated. As future work, it is expected that having a greater number of attenuating strains, will allow the identification of the metabolite synthesized by the biosynthesis pathway of which the gene belongs.

Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo, mención Sanidad Vegetal / Cylindrocarpon macrodidymum es uno de los fitopatógenos causantes de la enfermedad del pie negro en la vid. La reducción del cuidado sanitario, los cambios en los manejos culturales y la baja efectividad de algunos fungicidas químicos, ha obligado a buscar nuevas alternativas de control que no estén limitadas por las condiciones ambientales, ecológicas y económicas, abriendo una ventana para técnicas alternativas de control, tales como el control biológico. En el presente trabajo, se evaluó el efecto biocontrolador in vitro de 12 cepas fúngicas antagonistas y 9 cepas bacterianas antagonistas, sumado a dos productos comerciales, sobre tres cepas seleccionadas de Cylindrocarpon macrodidymum aisladas de los valles de Copiapó y Huasco. Estas fueron caracterizadas en función de su pH y temperatura óptima de crecimiento, determinando que el pH óptimo de crecimiento se encontraba entre 5,7 y 7,7, mientras que la temperatura óptima fue 25ºC. Estos valores se utilizaron para las evaluaciones realizadas. Para cada combinación antagonista-fitopatógeno, se realizaron ensayos de antagonismo directo, mediante cultivos duales y de metabolitos difusibles de los biocontroladores sobre las tres cepas de C. macrodidymum. Todos los antagonistas fungosos y bacterianos utilizados, ejercieron algún grado de inhibición del crecimiento radial de las cepas de C. macrodidymum evaluadas, tanto en los ensayos de antagonismo directo como en los de metabolitos difusibles. La cepa Trichoderma 84a, fue aquella que obtuvo un mayor porcentaje de ICR promedio en los ensayos de antagonismo directo con hongos (81.5%), mientras que el producto comercial en base a Streptomyces lydicus WYEC108, fue aquel que obtuvo el mayor porcentaje de ICR promedio en los ensayos de antagonismo directo con bacterias (96.1%). En los ensayos de metabolitos difusibles, no existieron diferencias en los porcentajes de ICR para ninguno de los antagonistas fungosos evaluados, mientras que en los ensayos de metabolitos difusibles con bacterias, nuevamente el producto comercial en base a Streptomyces lydicus WYEC108, fue el que obtuvo un mayor porcentaje de ICR promedio (100%). / Cylindrocarpon macrodidymum is a phytopathogen fungi that has been associated with black foot disease of grape vines in Chile. Lack of sanitary measures, changes of cultural methods and low agrochemical efficacy, are forcing to seek out for new control alternatives that are not limited by enviromental, ecological or economic conditions, thus leading to new ways of fungi disease management, such as biological control. The in vitro biocontrol efficacy of 12 antagonic fungi strains, 9 antagonic bacterial strains and two commercial biological control products were tested against three previously selected C. macrodidymum strains. These strains, isolated from Copiapó and Huasco valleys, were characterised by their optimal growth pH and temperature, establishing their optimal growth pH between 5,7 and 7,7 and their optimal growth temperatura at 25ºC. These values were used for the antagonistic trials. For each antagonist-pathogenic variant, antagonistic capacity of each antagonist was tested on dual cultures and diffusible metabolite efficacy trials against the pathogenic strains. Commercial biological control products, bacterial strains and fungi strains were all capable of inhnibiting the radial growth of the three C. macrodidymum strains. In dual culture trials, Trichoderma 84a strain had the highest average inhibitory effect (81.5%). Commercial biocontrol product, based on Streptomyces lydicus WYEC108 bacterial strain, had the highest inhibitory control in bacterial trials (96.1%). No significant differences were shown in the fungi trials for diffusible metabolites efficacy. Commercial biocontrol product, based on Streptomyces lydicus WYEC108 had the highest inhibitory effect in diffusible metabolite trials (100%).

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo / Las enfermedades de la madera de la vid son cada vez más recurrentes en los viñedos y parrales de Chile y del mundo, infectando y mermando de manera considerable la producción. Se sabe que son enfermedades muy agresivas y que pueden provocar la muerte de la planta. Las investigaciones realizadas han demostrado la efectividad de agentes biológicos para prevenir y controlar plagas y enfermedades. En este estudio se determinó la eficacia de diferentes biocontroladores de distinto origen frente a Neofusicoccum australe, hongo asociado a la enfermedad del brazo muerto descrita como “Black dead arm”. Los ensayos se realizaron bajo condiciones de laboratorio y se usaron sarmientos provenientes de plantas sanas de uva de mesa cv. Thompson Seedless. Los sarmientos fueron inoculados con micelio del patógeno sobre una herida realizada en el centro de la estaca.

Señala que los microorganismos ofrecen una alternativa potencial y rentable en la biotecnología ambiental, como los hongos capaces de crecer en relaves mineros en condiciones extremas, altas concentraciones de metales pesados, temperaturas bajas y pH ácidos. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar la resistencia y la biosorción de Cd II y Cr VI por los hongos filamentosos aislados de los cuerpos de agua de las Regiones Altoandinas de la Sierra Central de Perú (Lima, Junín y Pasco). Las muestras de agua analizadas procedieron del río San Juan, relaveras Yanamate, Carhuacayan, Huarón, Milpo, y laguna Santa Catalina, usadas en la actualidad como depósitos de relaves mineros. Los hongos fueron aislados en agar YPG, y seleccionados según su capacidad de resistencia a Cr VI y Cd II, posteriormente fueron identificados fenotípicamente y molecularmente mediante los marcadores ITS 1 e ITS 4. Así mismo se estudiaron el crecimiento de las cepas a diferentes pH y temperaturas, también se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) para estos metales, finalmente se realizaron las pruebas de biosorción de Cr VI y Cd II, con cepas de Trichoderma asperellum (MRYP4) y Trichoderma sp (MRMP1). Se identificaron 20 hongos filamentosos de lagunas contaminadas con relaves mineros, las cepas Trichoderma asperellum (MRYP4), Trichoderma sp (MRMP1) y Trichoderma koningiopsis (MSCJ3) presentaron una mayor tolerancia a Cr+2 y Cd+2, entre 200 y 800 ppm. Se obtuvo el 73 % de biosorción de Cd II con la cepa Trichoderma asperellum (MRYP4) y un 47 % de biosorción de Cr VI con la cepa Trichoderma sp (MRMP1), además una biosorción de Cd II de 1.18 mg del metal/g de biomasa en solución acuosa, realizado por la cepa Trichoderma asperellum (MRYP4). / Tesis

El Perú ocupa un lugar importante en Latinoamérica y el mundo en la producción de minerales. La región Junín es una zona con gran actividad minera polimetálica pero también con una excesiva descarga de aguas ácidas que contaminan el ambiente. Ante este problema, el proceso de biosorción es propuesto como una alternativa prometedora para la eliminación de contaminantes. En el presente trabajo, se aislaron y seleccionaron hongos resistentes a Cr (VI) y Zn (II) de ambientes mineros cercanos al río Yauli-Junín, y se determinó su capacidad de bioadsorción por el método de la difenilcarbazida y espectrofotometría de absorción atómica (EAA). De un total de 46 cepas aisladas, los hongos Penicillium sp (M2S2) y Paecilomyces sp (M6A3), alcanzaron valores máximos de CMI de 1200mg/L y 4000mg/L para los metales Cr (VI) y Zn (II) respectivamente, mostrando una eficiente capacidad de bioadsorción en soluciones mono y bimetálicas. En soluciones monometálicas, se determinó una eficiencia de bioadsorción máxima de 88.89% para el metal Cr (VI) por el hongo Paecilomyces sp y 75.14% para el metal Zn (II) por el hongo Penicillium sp. La eficiencia de bioadsorción por el hongo Paecilomyces sp en soluciones bimetálicas fue mayor al 65% para ambos metales, siendo superior para el metal Zn (II) con un valor de 72.82%. La máxima eficiencia de bioadsorción para los metales Cr (VI) y Zn (II) fue alcanzada a las 48 horas, y en los tres tiempos evaluados se obtuvieron diferencias significativas (p<0.05). / Tesis

Menciona que el eugenol es un fenilpropanoide derivado de plantas medicinales y con actividad antifúngica. El estrés oxidativo es uno de los mecanismos que explican su actividad anti-Candida. Este estudio determinó las propiedades fisicoquímicas y la reactividad in silico del eugenol, epóxido de eugenol y quinona metilada; se encontró que el eugenol y derivados poseen la capacidad para atravesar membranas biológicas y que el eugenol puede ser metabolizado hasta epóxido de eugenol. Además, se determinaron las propiedades fisicoquímicas y reactividad, in silico, de aductos de epóxido de eugenol y quinona metilada con glutatión, aminoácidos, espermidina y espermina. Se encontró que la formación de aductos de epóxido de eugenol-glutatión y quinona metilada-glutatión es termodinámicamente favorable, por lo que, podría ser un mecanismo que explique la disminución de la concentración de glutatión reducido en Candida albicans tratada con eugenol. Además, se halló que los aductos de epóxido de eugenol con cisteína, lisina y arginina, son termodinámicamente favorables, igualmente, los aductos de quinona metilada con cisteína y lisina. Asimismo, la formación de los aductos de epóxido de eugenol y quinona metilada con espermina y espermidina, es un proceso termodinámicamente no favorable. Por último, se determinó in silico las reacciones metabólicas de cada aducto en microorganismos aeróbicos, siendo los aductos de epóxido de eugenol-glutatión y quinona metilada-glutatión susceptibles a la desaminación oxidativa y desalquilación oxidativa. / Tesis

La presente tesis describe una propuesta de plan de negocios para determinar la viabilidad en la producción y comercialización de harina de hongos comestibles, como producto innovador dirigido a la industria de panificación. Siendo el mercado objetivo las principales panaderías de la ciudad. Estudios aplicados al consumidor de pan, revelaron que el 50% de los chiclayanos piensa que el pan no aporta valor nutricional a su dieta, sin embargo consumen entre 4 a 6 panes diarios, sus compras oscilan entre S/. 1.50 a S/. 3.00 y paga por cada unidad entre S/. 0.10 a S/. 0.20. Se halló también un 17% de consumidores que prefieren productos elaborados con ingredientes naturales, estos resultados reflejan las necesidades y atributos valorados por el consumidor chiclayano. La idea de negocio se centra en dos aspectos importantes: primero en los cambios de hábito de consumo saludable los que están transformando el mercado con las nuevas demandas y exigencias. El segundo identifica a los gastos familiares centrados en la alimentación. Frente a estos dos aspectos los productos de panadería son alimentos básicos y forman parte de nuestra dieta tradicional y cultura gastronómica. Un peruano consume en promedio 32 kilos de pan al año, que equivale 2 kilos 700 gr al mes y a 90 gr diario. Considerando estos hechos, el sector panadero se muestra atractivo para la comercialización de harina de hongo comestible (HHC), la misma que tiene como objetivo el desarrollo social, económico y sustentable de las comunidades Altoandinas de la Región de Lambayeque a través de sus productos elaborados bajo estándares de calidad definidos para cumplir con los requerimientos del empresario panadero.

Los hongos conforman uno de los grupos de organismos más diversos y abundantes que existen sobre la tierra. Junto con otros microorganismos, son los encargados de mediar procesos vitales para el medio ambiente. En el suelo desempeñan un rol central, tanto en el mantenimiento de su estructura como en procesos ecológicos clave como el ciclado de nutrientes y la descomposición de materia orgánica. La composición de la comunidad fúngica del suelo puede variar de un lugar a otro en respuesta a diversos factores. En los suelos agrícolas, los agroquímicos y sus residuos pueden producir cambios en las comunidades fúngicas. Hasta el momento, no se han realizado estudios que analicen de manera integrada el impacto de los herbicidas glifosato y 2,4-D sobre las comunidades fúngicas de suelos agrícolas en el sudoeste de la provincia de Buenos Aires. En esta tesis se investigó el efecto de estos herbicidas sobre las comunidades fúngicas aplicando distintas dosis y combinaciones de glifosato y 2,4-D en parcelas de un suelo de esta región y analizando cambios mediante diferentes metodologías. En el capítulo 1 se presentan los resultados de la aplicación de una metodología cultivo-dependiente para estimar la biomasa y la composición taxonómica de la comunidad. Se observaron patrones de cambio en la biomasa fúngica entre las parcelas tratadas y el control, pero estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Taxonómicamente, los hongos aislados eran representantes de géneros comunes en los suelos agrícolas y habían sido previamente citados para nuestro país. Los máximos recuentos de levaduras fueron registrados en el tratamiento control, lo cual podría atribuirse a un efecto inhibidor del glifosato sobre las levaduras del suelo. En el capítulo 2, la biomasa fúngica se estimó con una metodología cultivo-independiente (tinción con Calcoflúor). Se encontró que la aplicación de dosis elevadas de glifosato, solo o en combinación con 2,4-D, produjo un estímulo temporal en la biomasa luego de una semana de aplicados los herbicidas. Con la tinción directa con Calcoflúor se detectaron diferencias estadísticamente significativas que no fueron evidenciadas con la técnica cultivo-dependiente. En el capítulo 3, las comunidades fueron analizadas utilizando EGGD (electroforesis en geles con gradiente desnaturalizante). El nivel de polimorfismo detectado en el análisis de EGGD evidenció que para períodos prolongados de exposición al glifosato en dosis dobles a la recomendada o en combinación con 2,4-D, las comunidades fúngicas del suelo adquirieron una estructura polimórfica característica muy diferente a la de los suelos control o a la de aquellos suelos tratados con la dosis de glifosato recomendada. Según los resultados obtenidos en el presente estudio, no se hallaron cambios evidentes en las comunidades fúngicas de las parcelas tratadas, siendo los atributos estimados similares a los del tratamiento control. Sin embargo, se hallaron evidencias de que en dosis mayores, ya sea solo o en combinación con 2,4-D, la aplicación del glifosato indujo cambios tanto en la biomasa como en la estructura de la comunidad fúngica del suelo. / Fungi are among the most abundant and diverse organisms on earth. Togheter with other microorganisms, fungi are responsible for many important processes in the environment. They play a central role in soils, mainly in the manteinance of soil structure and in ecological processes like nutrient cycling and decomposition of organic matter. Soil fungal community composition may change in response to diverse factors. In agricultural soils, the agrochemicals and their residues can produce changes in fungal communities. The impact of the herbicides glyphosate and 2,4-D on the soil fungal communities has not been studied in agricultural soils from southwestern Buenos Aires province, until now. To assess the effect of these herbicides on the soil fugal communities in the region, soil plots were treated with different doses and combinations of these herbicides, and different methods were used to investigate changes in fungal communities. In chapter 1, a culture-dependent technique was used to estimate biomass and taxonomic structure. These results show changes in the fungal biomass between treated and control plots, but these differences were not statistically significant. All the isolated fungal strains were common soil fungi and were previously cited for Argentina. Higher counts of yeast were registered in control samples indicating a potential negative effect of glyphosate on soil yeast. In chapter 2, fungal biomass was estimated using a culture-independent technique (Calcofluor stain). A positive short-term effect of glyphosate on soil fungal biomass was observed when doses higher than the recommended or combination with 2,4-D, were applied to soil. Using Calcofluor stain, several significant differences were found between treatments, compared to culture dependent method. In the chapter 3, the communities were analyzed using DGGE (denaturalization gradient gel electrophoresis). The continuous application of glyphosate in doses double than the recommended or in combination with 2,4-D, may cause changes in community structure, compared to control or treated soils with recommended field doses. We conclude that recommended field doses of glyphosate showed no effect on soil fungal communities. However higher doses of glyphosate, as sole herbicide or in combination with 2,4-D, induce changes both on biomass and structure of soil fungal community.

El pie negro de la vid está causado por las especies fúngicas Cylindrocarpon liriodendri y C. macrodidymum. Estos patógenos afectan a las plantas de vid en los viveros y en las plantaciones jóvenes, principalmente de menos de cinco años de edad. En esta Tesis se ha caracterizado una colección de 82 aislados de Cylindrocarpon españoles, obtenidos de plantas de vid con síntomas de pie negro procedentes de viveros y de viñedos jóvenes. Los aislados fueron identificados mediante el estudio de las secuencias de las regiones BT1 del gen de la ß-tubulina e ITS del ADN ribosómico; y el análisis estadístico multivariante de las variables fenotípicas: morfología de las colonias, producción de conidios y crecimiento miceliar a diferentes temperaturas. Así, 26 de los aislados correspondieron a la especie C. liriodendri y 56 a C. macrodidymum. Barbados enraizados del portainjerto cultivar R 110 se inocularon con aislados representativos de C. liriodendri o C. macrodidymum. Todas las plantas inoculadas desarrollaron los síntomas típicos del pie negro confirmando la patogenicidad de ambas especies a vid. La técnica de análisis "Inter-Simple Sequence Repeat" se utilizó para estudiar la diversidad genética en C. liriodendri y C. macrodidymum. Los resultados mostraron diversidad genética en ambos patógenos siendo ésta mucho mayor en la especie C. macrodidymum. A su vez, los ensayos de patogenicidad efectuados con aislados seleccionados de ambas especies en plántulas de semillas obtenidas del cultivar Tempranillo, demostraron que C. macrodidymum presenta también variabilidad en virulencia. Todos los aislados de C. liriodendri y C. macrodidymum fueron caracterizados para determinar la posible presencia de micovirus. Sin embargo, con el método de extracción utilizado, que se basa en cromatografía en celulosa, no se detectó ARN de doble cadena en ninguno de ellos. Respecto al control, los ensayos efectuados in vitro demostraron que tanto los tratamientos con f / Alaniz Ferro, SM. (2008). Caracterización y control de Cylindrocarpon SPP.agente causal del pie negro de la vid [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2422