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Hyaluronan (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, welches in der dermalen Extrazellularmatrix eine große Rolle als wasserspeicherndes Molekül spielt. Nach aktuellem Forschungsstand wird dem HA auch eine entscheidende Bedeutung u.a. in der Zellkommunikation und der Gewebehomöostase zugesprochen. Auswirkungen eines deutlich verminderten HA-Gehalts auf die Dermis im Ruhezustand wurden bisher wenig beleuchtet. Klinisch führen die Applikation von Glucocorticoiden und Exposition mit ultraviolettem Licht zu diesem Zustand. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Teiluntersuchung der Folgen nach HA-Suppression auf die ECM der ruhenden Dermis und ihrer Zellen. Wir analysierten ebendiese am Mausmodell auf mRNA-, Protein- und mikroskopischer Ebene. Wir nahmen an, dass durch HA-Reduktion eine Reorganisation der ECM mit Induktion anderer ECM-Komponenten zur Kompensation des HA-Verlusts stattfindet. Mithilfe eines konditionalen Knockout-(KO)-Modells der murinen HA-Synthase Has2 konnten wir eine suffiziente HA-Reduktion im murinen in vivo-Gewebe erreichen. Histologisch wiesen wir bei diesen Mäusen eine erhöhte Ablagerung an Kollagenen verglichen mit Kontrolltieren nach. In vivo-Genexpressionsanalysen zeigten eine signifikant erhöhte Induktion der Kollagene Typ I und III, den häufigsten Kollagentypen der Dermis. Auf Proteinebene wurde zudem ein erhöhter Gehalt der Kollagen-spezifischen Aminosäure Hydroxyprolin nachgewiesen. Diese Resultate unterstützten die Hypothese der ECM-Reorganisation. Im nächsten Schritt untersuchten wir an Fibroblasten (Fb) und gewebeständigen M2-Makrophagen (Mφ) in vitro eine konkrete Zellkommunikation, die für die Kollagenvermehrung in vivo ursächlich sein könnte. Beide Zellarten kommen in vivo in hoher Zahl in der ruhenden Dermis vor. Fb produzieren den Großteil der ECM, insb. Kollagene und andere fibrilläre Proteine. Aus der Literatur ist bekannt, dass gewebeständige Mφ sowohl mit HA als auch mit Fb komplex interagieren. Zudem sezernieren M2-Mφ zahlreiche profibrotische Zytokine und Wachstumsfaktoren (insb. TGF-β1), welche Einfluss auf den Differenzierungszustand und die Kollagensynthese bei Fb nehmen. Wir stellten die Hypothese auf, dass M2-Mφ im veränderten Microenvironment bei vermindertem HA die Fb hinsichtlich Differenzierungszustand und Matrixsynthese beeinflussen. Aufgrund verringerter Effektivität des Has2-KO im Arbeitsverlauf wurde das HA-Suppressionsmodell für die in vitro-Versuche umgestellt. Die HA-Suppression erfolgte nun mithilfe des etablierten 4- Methylumbelliferon (4MU), welches auf die Zellkulturen appliziert wurde. 4MU wirkt via Depletion eines HA-Vorläuferbausteins suffizient bei Fb. In eigenen Untersuchungen an Fb- und Mφ-Monokulturen in vitro verifizierten wir Effizienz, Reversibilität und Nicht-Toxizität der 4MU-Wirkung auf die Zellen unserer Population erfolgreich. Darauf aufbauend legten wir in vitro-Ko-Kulturen mit murinen Fb und M2-Mφ an. Der residente M2-Status der Mφ wurde durch vorherige IL-4-Applikation über mehrere Tage erreicht. 4MU-beeinflusste Ko-Kulturen wurden gegen nicht beeinflusste Ko-Kulturen verglichen. Zudem variierten wir die Kultivierungsdauer (48 h; 72 h) und das Zellzahlverhältnis der Ko-Kulturen: Eine Ko-Kulturkondition umfasste zehn Anteile Fb und einen Anteil Mφ (10:1-Ko-Kultur); die andere Kondition umfasste einen Anteil Fb und zehn Anteile Mφ (1:10-Ko-Kultur). Nach Ko-Kultivierung trennten wir Fb und Mφ mittels Magnetismus-basierter Separation anhand der CD11b-Oberflächenpräsentation in CD11b-positive Fraktion (murine Mφ) und CD11b-negative Fraktion (murine Fb). Die Reinheit der Separation wurde mittels Durchflusszytometrie verifiziert. Anschließend analysierten wir in Mφ die Expression von Genen, welche die Schlüsselkomponenten eines profibrotischen Signalwegs mit folgender Sekretion von TGF-β1 darstellen (Tlr2, Tlr4, Myd88, Tgfb1). Zudem wurde der bedeutendste HA-Transmembranrezeptor CD44 auf mRNA- und Zelloberflächenebene untersucht. Hinsichtlich der Fb analysierten wir die Genexpression der Kollagene Typ I und III (Col1a1, Col3a1), des fibrillären Matrixproteins ED-A-FN1, sowie verschiedener Gene, die mit dem verstärkten Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren (Tgfb1, Tgfbr1, Ccn2, Cox2). Durch Genexpressionsanalyse des Myofibroblastenmarkers αSMA wurde ein möglicher Differenzierungsprozess der Fb durch Wirkung von TGF-β1 untersucht. In Mφ- und Fb-Monokulturen, die als Kontrollen angelegt wurden, konnte im Wesentlichen keine signifikante Wirkung des 4MU auf die untersuchten Gene festgestellt werden. Mögliche Unterschiede auf mRNA-Ebene innerhalb ko-kultivierter Zellen wurden dadurch aussagekräftig. Durch Fb-Monokulturen, welche mit TGF-β1 im Überschuss versetzt wurden, verifizierten wir die Stimulierbarkeit unserer Fb-Population. Die genannten Gene sollten nach TGF-β1-Gabe in Fb vermehrt induziert werden; hier zeigten sich mehrheitlich adäquate Resultate. Wir konnten in Mφ aus 4MU-behandelten Ko-Kulturen eine tendenziell erhöhte Genexpression der Toll-like-Rezeptoren (Tlr2, Tlr4) sowie des Tlr-assoziierten Myd88 feststellen. Zudem wurde mithilfe einer durchflusszytometrischen Analyse gezeigt, dass Mφ nach 4MU-Applikation insgesamt weniger CD44 auf der Zelloberfläche präsentieren. Dies ist ein Indiz dafür, dass Mφ ihre extrazelluläre Umgebung wahrnehmen und ihre Rezeptorexpression ab-hängig vom HA-Gehalt verändern. In ko-kultivierten Fb wurde nach 4MU-Applikation eine signifikant verstärkte Genexpression der Kollagene Typ I und III gemessen; dieses Ergebnis war konkludent zu den erläuterten in vivo-Daten. Ebenfalls wurde bei Untersuchungen des Myofibroblastenmarkers αSMA sowie von Genen, die mit dem Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren, eine höhere Geninduktion bei HA-supprimierter Kultur nachgewiesen. Diese Daten aus ko-kultivierten Fb liefern Hinweise dafür, dass nach HA-Suppression durch Anwesenheit von Mφ eine Zellkommunikation mit profibrotischem Effekt bei Fb ablaufen könnte. Tendenziell schwache Unterschiede zwischen 4MU-behandelten und 4MU-unbehandelten Ko-Kulturen sind vor dem Hintergrund einer mäßigen 4MU-Wirkung zu sehen: Nach ELISA-Messung fiel die HA-Suppression in den Ko-Kulturen schwächer aus als in vorherigen Mono-kultur-Versuchen und Vergleichsstudien. Als Gründe für diese schwächere HA-Reduktion sind Interaktionen mit dem Medium und ko-kultivierenden Mφ zu vermuten – die 4MU-Wirkung auf Immunzellen und ko-kultivierende Zellen in vitro ist in der Literatur nur unzureichend untersucht. Zudem sind einige Sekundär-Effekte von 4MU bekannt, die sich auf die Proliferation der Fb, die Synthese und Aktivierung verschiedener ECM-Komponenten neben dem HA sowie auf den allgemeinen Zellmetabolismus auswirken. Diese Effekte könnten potenziell Einfluss auf unsere Resultate nehmen. Insgesamt konnten wir Hinweise dafür gewinnen, dass HA-Suppression direkte Folgen für den Umbau der ECM hat. Ebenfalls konnten wir Hinweise dafür sammeln, dass unter HA-Suppression eine profibrogene Zellkommunikation zwischen Mφ und Fb besteht. Diese Kommunikation resultierte bei Fb in erhöhter Transkription von Komponenten des TGF-β1-Signalwegs, von Kollagenen und Markern eines profibrotischen Differenzierungsstatus. Da sich diese erhöhten Genexpressionen zumeist erst nach 72 h zeigten, wäre eine Betrachtung der Ko-Kulturen mit längeren Kultivierungszeiten sinnvoll. Ebenso könnten eine Genexpressionsanalyse zusätzlicher profibrotischer Zytokine und Mediatoren, die von Mφ sezerniert werden (bspw. IL-6) sowie ein TGF-β1-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen angeschlossen werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt neue Ergebnisse bezüglich des Forschungsfeldes zu vermindertem HA-Gehalt. Hinsichtlich des zuvor wenig charakterisierten Has2-KO-Modells konnte eine signifikante Vermehrung von Kollagenen bei HA-Suppression beschrieben wer-den. Ebenso wurde erstmals in vitro eine spezifische Rolle von vermindertem HA innerhalb der mannigfaltigen Beziehungen zwischen Fb und M2-Mφ untersucht. Hierbei konnten wir Indizien für einen Mφ-vermittelten Signalweg bei HA-Verminderung gewinnen. Diese Arbeit bildet somit eine Grundlage für sich anschließende in vivo- und in vitro-Studien zum Komplex der HA-Suppression in der Haut.:INHALTSVERZEICHNIS I ABBILDUNGSVERZEICHNIS V TABELLENVERZEICHNIS VII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX 1. EINLEITUNG 1 1.1. Funktion und Aufbau der menschlichen Haut 1 1.2. Zelluläre und Extrazelluläre Bestandteile der Dermis 3 1.2.1. Allgemeine Zelluläre Bestandteile 3 1.2.2. Myofibroblasten – Funktion und Charakterisierung 5 1.2.3. Extrazelluläre Matrix (ECM) 6 1.3. Hyaluronan als zentraler Bestandteil der ECM 8 1.3.1. Aufbau, biochemische Eigenschaften, Funktionen und Vorkommen 8 1.3.2. Metabolismus 10 1.3.3. Rezeptoren und Signalwege 11 1.4. Ziel der Dissertation 14 2. MATERIALIEN 17 2.1. Mausstämme 17 2.2. Puffer, Lösungen und Medien 17 2.3. Chemikalien, Enzyme und Reagenzien 18 2.4. DNA-Primer 20 2.5. Kits 21 2.6. Antikörper für Durchflusszytometrie 21 2.7. Geräte 22 2.8. Verbrauchsmaterialien 24 2.9. Software 25 3. METHODEN 27 3.1. Arbeiten am Tiermodell 27 3.2. Induzierbarer Has2-KO in Versuchstieren 27 3.2.1. Das Cre/loxP-System 27 3.2.2. Induktion des Has2-KO in vivo 29 3.3. In vitro-Versuche 30 3.3.1. Zellkulturen 30 3.3.2. Isolation muriner Fb und Kulturerhalt 30 3.3.3. Trypsinieren und definiertes Aussäen der Fb 31 3.3.4. Isolation muriner Mφ und Kulturerhalt 31 3.3.5. Durchführung der Ko-Kultur-Versuche 32 3.4. Molekularbiologische Untersuchungen 33 3.4.1. RNA-Isolation aus Zellkulturen 33 3.4.2. RNA-Isolation aus Hautgewebe 33 3.4.3. RNA-Konzentrationsbestimmung und Analyse der Reinheit 34 3.4.4. cDNA-Synthese durch reverse Transkription 34 3.4.5. Herstellung von Standard-Plasmiden für RT-PCR 35 3.4.6. Quantitative RT-PCR 37 3.4.7. HA-ELISA 39 3.4.8. Hydroxyprolin-Assay 40 3.5. Analyse spezifischer Zellpopulationen 41 3.5.1. Separation von CD11b-positiven Zellen aus Ko-Kulturen 41 3.5.2. Durchflusszytometrie 42 3.6. Histologische Analysen 44 3.6.1. Anfertigen von Paraffinschnitten sowie Entparaffinierung 44 3.6.2. Histochemische Masson-Trichrom-Färbung 45 3.7. Statistische Methoden 46 4. ERGEBNISSE 47 4.1. Histologische Analyse des Has2-KO-Phänotyps in ruhender Haut 47 4.2. mRNA-Analyse am Has2-KO-Modell in vivo 48 4.3. Proteinanalysen am Has2-KO-Modell in vivo 49 4.4. Umstellung der HA-Suppression auf 4MU-Modell 50 4.4.1. Pharmakologische Unterdrückung der HA-Synthese durch 4MU sowie Evaluierung der Dosis 51 4.4.2. Untersuchungen zu Effizienz und Reversibilität der 4MU-Wirkung 52 4.4.2.1. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 96 h 53 4.4.2.2. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 15 Tage 54 4.4.2.3. Kultivierung von murinen Mφ mit 4MU 56 4.5. Fb-Mφ-Kokultur-Versuche 59 4.5.1. Etablierung des Ko-Kultur-Settings 59 4.5.2. HA-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen 62 4.5.3. Genexpressionsanalysen in Mφ aus Ko-Kulturen 63 4.5.3.1. Analyse von Tlr2 63 4.5.3.2. Analyse von Tlr4 65 4.5.3.3. Analyse von Myd88 66 4.5.3.4. Analyse von Tgfb1 67 4.5.3.5. Analyse von Cd44 69 4.5.4. Genexpressionsanalysen in Fb aus Ko-Kulturen 71 4.5.4.1. Analyse von αSMA 71 4.5.4.2. Analyse von Col1a1 73 4.5.4.3. Analyse von Col3a1 75 4.5.4.4. Analyse von ED-A-FN1 76 4.5.4.5. Analyse von Tgfbr1 78 4.5.4.6. Analyse von Ccn2 79 4.5.4.7. Analyse von Cox2 81 4.5.4.8. Analyse von Tgfb1 82 4.5.5. Zusammenfassung der Genexpressionsanalysen aus Ko-Kulturen 84 4.5.6. Durchflusszytometrische Untersuchungen 85 4.5.6.1. Evaluierung der Reinheit von Fb- und Mφ-Separation 85 4.5.6.2. Analyse von CD44 auf der Zellmembran von Mφ 86 5. DISKUSSION 89 5.1. Grundlage der Arbeitsidee 89 5.2. Betrachtung der in vivo-Ergebnisse (Has2-KO) 90 5.3. Effizienz und Einflüsse der verwendeten HA-Suppressionsmodelle 94 5.4. Betrachtung der in vitro-Ergebnisse (4MU-Applikation) 97 5.5. Fazit und Ausblick auf zusätzliche in vitro-Untersuchungen 106 6. ZUSAMMENFASSUNG 109 LITERATURVERZEICHNIS 115 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT i ANERKENNUNG DER PROMOTIONSORDNUNG iii LEBENSLAUF v DANKSAGUNG vii

Οι καρκίνοι του γαστρεντερικού συστήματος είναι από τους πιο συνηθισμένους τύπους καρκίνου στον αναπτυγμένο κόσμο. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι εκείνος με τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης, αλλά αντιμετωπίζεται με αρκετά καλή πρόγνωση. Αντίθετα, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι εκείνος με τη χειρότερη πρόγνωση και πολλές φορές δεν αντιμετωπίζεται. Τα τελευταία χρόνια αναπτύσσεται εκτεταμένη έρευνα στα εξωκυττάρια μακρομόρια των καρκινικών ιστών και στο ρόλο τους στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, όπως επίσης και στις δυνατότητες επηρεασμού των παραγόντων αυτών φαρμακευτικά. Η παρούσα Διατριβή έχει δύο στόχους, ο πρώτος σχετίζεται με τη μελέτη των εξωκυττάριων πρωτεογλυκανών στον καρκίνο του παγκρέατος και ο δεύτερος με τη μελέτη του μεταβολισμού του υαλουρονικού οξέος στον καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της μελέτης των βιοσυνθετικών και καταβολικών του ενζύμων. Ο πρώτος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό βιοχημικών και ανοσοϊστοχημικών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε ότι μόνο δύο πρωτεογλυκανικά μόρια ανευρίσκονται στο παγκρεατικό καρκίνωμα, η versican και η decorin. Και οι δύο πρωτεογλυκάνες εντοπίστηκαν στο στρώμα και απουσίαζαν πλήρως από τα καρκινικά κύτταρα, γεγονός που υποστηρίζει ότι παράγονται από τις ινοβλάστες του στρώματος. Ήταν σημαντική η αύξηση των ποσοτήτων των δύο πρωτεογλυκανών στο παγκρεατικό καρκίνωμα, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας και μεγάλη η διαφορά που εμφάνιζαν μεταξύ τους. Η versican αυξήθηκε 27 φορές και η decorin 7 φορές, σε σχέση με το φυσιολογικό πάγκρεας. Η μεγαλύτερη αύξηση της versican σχετίζεται με τις ιδιότητες της πρωτεογλυκάνης, τόσο δομικές, ενυδατικές, χωροπληρωτικές, όσο και λειτουργικές, εφ’ όσον πρόκειται για πολυλειτουργικό μόριο. Επί πλέον, η versican συμβάλλει στην κατακόρυφη αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ παράλληλα συμβάλλει και στις αντι-προσκολλητικές ιδιότητες των κυττάρων, παρέχοντας τη δυνατότητα για υπέρμετρη, και πολλές φορές ανεξέλεκτη, κυτταρική ανάπτυξη σε τοπικό επίπεδο. Το γεγονός της χαμηλότερης αύξησης της συγκέντρωσης της decorin, σε σχέση με εκείνη της versican, θα μπορούσε να αποτελεί ένα μέτρο της επιθετικότητας του καρκίνου ή ακόμα, ένα μέτρο της κακοήθειας. Η αύξηση των πρωτεογλυκανών συνοδευόταν από σημαντικότατες αλλαγές στη βιοχημική δομή τους σε επίπεδο υδροδυναμικού μεγέθους, βαθμού και προτύπου θείωσης, όπως επίσης και επιμερίωσης του γλυκουρονικού σε ιδουρονικό. Οι αλλαγές αυτές θα μπορούσε να οφείλονται σε πολλαπλές αλλοιώσεις των βιοσυνθετικών μονοπατιών τους. Ο δεύτερος στόχος διερευνήθηκε με συνδυασμό ενζυμολογικών, ανοσοενζυμικών και μοριακών τεχνικών, από τα αποτελέσματα των οποίων διαπιστώθηκε σε όλα τα δείγματα η παρουσία των ισομορφών υαλουρονιδάσης Hyal1 και ΡΗ20, και σε πολλαπλές μορφές, αλλά και των Hyal2 και Hyal3, όμως μόνο σε προχωρημένο στάδιο, ως επίσης και η παρουσία των τριών συνθασών του υαλουρονικού. Παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή της έκφρασης με το καρκινικό στάδιο. Η Hyal1 εκφραζόταν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα παχέος εντέρου με καρκίνο σταδίου Α, όμως η έκφρασή της ήταν πάνω από δέκα φορές μεγαλύτερη στα αντίστοιχα καρκινικά, υποστηρίζοντας ότι η Hyal1 παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα. Το γεγονός ότι η έκφραση της Hyal1 στα καρκινικά δείγματα εμφάνιζε σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, σε συνδυασμό με το δεδομένο ότι η δράση της οδηγεί στην παραγωγή αγγειογενετικών θραυσμάτων υαλουρονικού, έρχεται σε συμφωνία με το δεδομένο ότι η διαδικασία της αγγειογένεσης απαιτείται κυρίως στα αρχικά στάδια της καρκινικής εξαλλαγής. Από την άλλη πλευρά, η ΡΗ20 εμφάνιζε υψηλότερη έκφραση, σε σχέση με την Hyal1, στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Α, η οποία όμως αυξανόταν τέσσερις φορές στα αντίστοιχα καρκινικά, υποδεικνύοντας και τη δική της συμμετοχή στη 10 διαδικασία της αγγειογένεσης. Στα επόμενα στάδια υπήρχε μεν αύξηση στην έκφραση της ΡΗ20, αυτή όμως ήταν μικρή, και πιθανόν να λειτουργεί με σκοπό την ακόμα μεγαλύτερη αποικοδόμηση του υαλουρονικού ώστε να χαλαρώσει η δομή του εξωκυττάριου χώρου και να δοθεί η δυνατότητα ανάπτυξης του καρκίνου ή μετάστασης των καρκινικών κυττάρων. Παράλληλα, διαπιστώθηκε μικρή αύξηση της έκφρασης της ΡΗ20 στα μακροσκοπικώς φυσιολογικά δείγματα σταδίου Β και πολύ μεγαλύτερη σε εκείνα σταδίου C. Από τον έλεγχο της έκφρασης των συνθασών του υαλουρονικού διαπιστώθηκε ότι υπάρχει σημαντική σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση της HAS1, η οποία οδηγεί στη βιοσύνθεση υαλουρονικού μεγάλου μοριακού μεγέθους, υποστηρίζοντας ότι ο καρκίνος συντονίζει την παραγωγή υαλουρονικού με μέγεθος τέτοιο που, σύμφωνα με τις χωροπληρωτικές και ενυδατικές του ιδιότητες, μπορεί να βοηθήσει την ενυδάτωση του εξωκυττάριου χώρου και την κυτταρική ανάπτυξη. Από την άλλη πλευρά, η HAS2 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη αύξηση, μόνο στα καρκινικά δείγματα, η οποία μπορεί να οδηγήσει στη βιοσύνθεση μεγαλομοριακού υαλουρονικού, που απαιτείται για τη σωστή και οργανωμένη ανάπτυξη του καρκινικού όγκου. Τέλος, η HAS3 εμφάνιζε μικρή σταδιο-εξαρτώμενη μείωση, υποδηλώνοντας ότι η παρουσία της είναι απαραίτητη σε σχεδόν σταθερό βαθμό για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου και τούτο γιατί το προϊόν της είναι μικρότερου μοριακού μεγέθους σε σχέση με τις υπόλοιπες συνθάσες. Αυτό εξ άλλου υποστηρίζεται και από το γεγονός ότι η HAS3 εμφανίζει τη μεγαλύτερη έκφραση σε σχέση με τις άλλες συνθάσες σε δείγματα σταδίου Α, στάδιο που είναι κρίσιμο για την αγγειογένεση και την υποβοήθηση της διατροφής των καρκινικών κυττάρων. Συμπερασματικά, γίνεται φανερό ότι τα καρκινικά κύτταρα συνδυάζουν πολλούς μηχανισμούς για την ανάπτυξη, τη διήθηση και την επέκταση του καρκίνου και τα εξωκυττάρια μακρομόρια μπορεί να έχουν κομβικό ρόλο σ’ αυτούς. Οι μηχανισμοί αυτοί, όπως μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή, είναι: ελεγχόμενη αύξηση της συγκέντρωσης των πρωτεογλυκανών versican και decorin, εξειδικευμένες τροποποιήσεις στη βιοχημική δομή των γλυκοζαμινογλυκανών, ελεγχόμενη έκφραση των βιοσυνθετικών και καταβολικών ενζύμων του υαλουρονικού. Όλες αυτές οι μεταβολές συντονίζονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να εξυπηρετήσουν τις απαιτήσεις του καρκίνου είτε στο επίπεδο της αγγειογένεσης είτε στο επίπεδο της οργάνωσης του εξωκυττάριου χώρου. Οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να προσανατολιστούν ακόμα περισσότερο στη συσχέτιση χημικής δομής και λειτουργικότητας των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης/δερματάνης, ώστε να γίνουν πλήρως αντιληπτοί οι ρόλοι αυτών των μακρομορίων, όπως επίσης στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν την έκφραση των ενζύμων του μεταβολισμού του υαλουρονικού, με απώτερο στόχο την ειδικότερη και πληρέστερη φαρμακευτική αντιμετώπιση του καρκίνου. / Cancers of gastrointestinal tract are the most common type of cancers in developed world. Colorectal cancer has the highest incidence, however it is treated with rather good prognosis. On the other hand, pancreatic cancer has very bad prognosis and in most cases it cannot be treated. The last years extended research focused to the extracellular macromolecules of cancer, their role in cancer progression and their possible use as drug targets. The present Thesis aimed to study the extracellular proteoglycans structure in pancreatic cancer and the hyaluronan metabolism in colorectal cancer. The first was investigated by using a combination of biochemical and immunohistochemical techniques, and from their results it was found that two extracellular proteoglycans were present in pancreatic carcinoma, versican and decorin. Both proteoglycans were detected in the stroma and were absent from cancer cells, suggesting their biosynthesis from normal fibroblasts. In addition, their amounts were highly increased in pancreatic carcinoma, as compared with normal pancreas. Their increase in cancer was disproportional. Versican was increased 27 times and decorin 7 times, as compared with normal pancreas. Versican increase is related to its structural, hydration and space-filling properties, as well as to its function, since it is a multifunctional macromolecule. Versican enhances cell proliferation, and together with its anti-adhesive properties, allows mainly uncontrolled cellular growth locally. The lower increase of decorin, as compared with that of versican, could explain aggressiveness and malignancy of pancreatic cancer. Proteoglycans increase was followed by extensive alterations in their biochemical structure, namely, hydrodynamic size, sulphation pattern, and epimerization of glucuronate to iduronate. These should be attributed to multiple alterations of their biosynthetic pathways. The second was investigated by using a combination of enzymatic, immunoenzymatic and molecular techniques, and from their results it was found that multiple forms of Hyal1 and PH20 were present in all samples, as well as all hyaluronan synthases (HASs). Hyal2 and Hyal3 were present in some samples of advanced stage of cancer. Changes in expression with cancer stage were observed. Hyal1 expressed in low levels in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 10 times greater in the respective cancerous. This finding suggested that Hyal1 is produced from cancer cells. Hyal1 expresssion showed a stage-related decrease and since its activity results to hyaluronan fragments of angiogenetic size, it could be concluded that Hyal1 is required at early stage of cancer. PH20 expressed in a higher rate than Hyal1 in apparently macroscopically normal parts of stage A samples, and its expression was 4 times greater in the respective cancerous, suggesting its participation in angiogenesis. In advanced stages, PH20 expression was slightly increased, suggesting its participation in extracellular matrix disorganization to permit cancer growth and progression, as well as metastasis. This was also observed in apparently macroscopically normal parts of samples of advanced stages. From the examination of the expression of the various HASs, a great and stage-related increase of HAS1 was found. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of very high molecular size and thus it could be suggested that cancer regulates hyaluronan biosynthesis in such a way to fulfill cancer requirements in matrix hydration. HAS2 expression was also increased in a stage-related order only in cancerous samples, but the increase was lower than that of HAS1. This enzyme is responsible for the biosynthesis of hyaluronan of high molecular size which might be required for well-organized cancer growth. HAS3 expression was slightly decreased in a stage-related order, suggesting that its presence is stably required for the correct cancer growth and progression, since its biosynthetic product is of lower hydrodynamic size, as compared with that of HAS1 and 12 HAS2. Moreover, HAS3 expression was higher than that of both other HASs in samples of stage A, a stage very critical for angiogenesis. From the results obtained, it could be concluded that cancer cells combine a variety of multiple mechanisms for cancer growth, progression and invasion, and that extracellular macromolecules might play a very critical role. The mechanisms, as studied in the present Thesis, are: selective and highly regulated increase of the proteoglycans versican and decorin, selective modifications of glycosaminoglycans biochemical structure, selective and highly regulated expression of biosynthetic and catabolic enzymes related to hyaluronan. All these changes coordinate to fulfill cancer requirements for either angiogenesis or extracellular matrix organization, depending on its stage. Future studies will be oriented to chondroitin/dermatan sulphate structure/function relationship for better understanding of the role of these macromolecules in cancer, and of the regulatory mechanisms implicated in the expression of the enzymes involved in hyaluronan metabolism, aiming at the cancer treatment.

Hyaluronan is a chemical, which can be qualified as essential for vertebrates. It is a part of the extracellular matrix in most of tissues and also a major component of some other tissues. Besides of the mechanical functions this compound is important for many biological processes such as growth of tumor cells. The objective of this thesis was development of carrier systems containing native hyaluronan and hydrophobic drugs. For purposes of this work fluorescence probes (pyrene, prodan, perylene, DPH, mereocynine 540) instead of drugs were used. By using further mentioned sophisticated methods the properties of these systems were studied. The systems were prepared by freeze-drying. The effect of freeze-drying on support of interactions was observed by fluorescence spectrometry (steady-state and time-resolved). The stability of freeze-dried systems was determined by zeta potential, which was measured by electrophoretic light scattering. Cakes obtained by freeze-drying were analyzed by several methods. First one was effluence gas chromatography connected with FT-IR spectrometry. In this method the present of tertiary butyl alcohol in product was observed. The cakes were also analyzed by scanning electron microscopy, which can provide the information about the surface and elemental constitution of the material. The results of this work can shed light on the area of developing of drugs with targeted distribution of active compound.

This work deals with the transmittance of a family of non-steroidal anti-inflammatory drugs across biological membranes in combination with the use of hyaluronan. Hyaluronic acid (hyaluronan, HYA) is a linear polysaccharide formed from disacharide units containing N-acetyl-D-glucosamine and glucuronic acid. HYA is present in almost all biological fluids and tissues, so there is an assumption that could affect the penetration of substances through the skin. Standards were prepared by anti-inflammatory drugs in admixture with various concentrations hyaluronan and subsequently measured transmittance of such substances through the skin. Standards were applied to the skin obtained from pig auricle. The drug content was determined by HPLC.

Tato práce se zabývá studiem fluorescenčně značeného hyaluronanu, konkrétně rhodaminylamino hyaluronátu sodného (Hya-Rh, 40 kDa), pomocí dvouohniskové fluorescenční korelační spektroskopie (2f-FCS). Nejdříve byla prostudována literatura týkající se využití FCS techniky v koloidní chemii a při studiu polymerů, přičemž následně byly shrnuty veškeré poznatky o využití 2f-FCS metody. Na základě prvotních měření byl zjištěn vhodný postup přípravy a způsob uchovávání vzorku Hya-Rh používaném pro následující experimenty. Záhy byly prostudovány možné vlivy koncentrace Hya-Rh na jeho difúzní charakteristiky jak ve vodě, tak ve fyziologickém roztoku. Následně bylo studováno chování Hya-Rh a vliv koncentrace solí alkalických kovů ve vodných roztocích těchto solí a fluorescenčně značeného hyaluronanu. Poté bylo sledováno chování Hya-Rh v závislosti na koncentraci velmi nízkomolekulárního hyaluronanu (VLMW HA, 404 kDa) v čisté vodě i ve fyziologickém roztoku, přičemž získané výsledky byly mezi sebou porovnány. Nakonec bylo využití 2f-FCS metody celkově zhodnoceno a popsáno z hlediska studia chování fluorescenčně značeného hyaluronanu v roztocích.

Hyaluronan (HA) is a substance that is commonly used in biomedical applications in the form of hydrogels. One of these biomedical applications is dermatological fillers where HA is cross-linked with 1,4-Butanediol diglycidyl ether (BDDE) to reduce its rapid turnover within tissue. The filler gives a volumetric effect that can fill out wrinkles. This literature study was conducted in collaboration with Galderma to determine if there is research that explores additives to HA hydrogels that give both volumetric and biological effects when applied as filler. Biological effects that improve the skin's appearance and complexion such as a rejuvenation of the skin was preferable. Both polynucleotides and mannitol show great potential to act as additives in injectable hyaluronan hydrogels.  The main effect of polynucleotides (PN) added in hydrogels is that it is collagen stimulating and provides a more natural tissue regeneration. Rheological properties of the filler change with the addition of PN, where elasticity, viscosity and viscoelasticity have been shown to increase. PNs show no toxicity and are considered safe to inject. The study of mannitol has shown that it does not give a volumetric effect after the injected hydrogel has been broken down. What mannitol can help with, is to prolong the life of the hydrogel and reduce the swelling that is a common side effect after an injection. In addition to this, mannitol is a safe substance to inject.

The objective of this thesis was to advance understanding in the field of biolubrication, finding inspiration from the human synovial joints. This was addressed by investigating the association of key biolubricants and the resulting lubrication performance. Techniques employed during the course of this work were Atomic force microscopy (AFM), Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), X-ray reflectivity (XRR). Key synovial fluid and cartilage components like dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), hyaluronan (HA), lubricin, and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) have been used in the investigations. Focus was towards two lubrication couples; DPPC-hyaluronan and COMP-lubricin. DPPC-hyaluronan mixtures were probed on hydrophilic silica surfaces and COMP-lubricin association structures were explored on weakly hydrophobic poly (methyl methacrylate) (PMMA) surfaces. Investigations of the COMP-lubricin pair revealed that individually these components are unable to reach desired lubrication. However in combination, COMP facilitates firm attachment of lubricin to the PMMA surface in a favourable confirmation that imparts low friction coefficient. DPPC and hyaluronan combined impart lubrication advantage over lone DPPC bilayers. Hyaluronan provides a reservoir of DPPC on the surface and consequently self-healing ability. Other factors like temperature, presence of calcium ions, molecular weight of hyaluronan, and pressure were also explored. DPPC bilayers at higher temperature had higher load bearing capacity. Association between DPPC Langmuir layers and hyaluronan was enhanced in the presence of calcium ions, and lower molecular weight hyaluronan had a stronger tendency to bind to DPPC. At high pressures, DPPC-hyaluronan layers were more stable compared to lone DPPC bilayers. / <p>QC 20170210</p>

Background Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patients have the poorest 5-year survival rates of all cancer forms. It is difficult to diagnose at early disease stages, tumour relapse after surgery is common, and current chemotherapies are ineffective. Carbohydrate antigen 19-9 (Ca 19-9), the only clinically implemented PDAC biomarker, is insufficient for diagnostic and screening purposes. PDAC tumours are characterised by a voluminous stroma that is rich in extracellular matrix (ECM) molecules such as collagens, hyaluronan (HA) and matricellular proteins. These stromal components have been suggested to promote PDAC cell migration, proliferation, evasion of apoptosis and chemotherapy resistance. Those events are mediated via interactions with adhesion receptors, such as integrins and CD44 receptors expressed on cancer cell surfaces. Micro-RNAs (miRNA) post-transcriptionally regulate gene expression in health and disease. At the time of PDAC diagnosis, miRNA levels are altered both in plasma and tumour tissue. Before PDAC diagnosis, tissue miRNA levels are altered in precursor lesions, raising the possibility that plasma miRNAs might aid in early detection. In this thesis, it is hypothesised that stromal components and miRNAs can serve as tissue or blood based biomarkers in PDAC. The aims are: (1) to characterise the expression of stromal components and their receptors in normal and cancerous tissue; (2) to find potential stroma-associated tissue and blood-based biomarkers for diagnosis and prognosis estimates; (3) to determine the cellular effects of type IV collagen (Col IV) in PDAC; (4) to determine if plasma miRNAs that are altered in manifest PDAC can be used to diagnose PDAC earlier. Methods The expression patterns of Col IV, Col IV-binding integrin subunits (α1, α2, β1), Endostatin, Osteopontin (OPN) and Tenascin C (TNC) were analysed in frozen PDAC and normal pancreatic tissue. A tissue microarray (TMA) was constructed using formalin-fixed, paraffin-embedded primary tumours and lymph node metastases. The TMA was used to study the expression levels and associations with survival of the standard CD44 receptor (CD44s), its variant isoform 6 (CD44v6), HA, OPN and Col IV. Circulating levels of HA, Col IV, Endostatin, OPN and TNC were measured in PDAC patients and healthy individuals, and compared with conventional tumour markers (Ca 19-9, CEA, Ca 125 and TPS). The functional roles of Col IV were studied in PDAC cell lines by: (1) growth on different matrices (2) blocking Col IV binding integrin subunits, (3) blocking the Col IV domains 7s, CB3 and NC1, and (4) by down regulation of PDAC cell synthesis of Col IV using siRNA transfection. Plasma miRNAs alterations were screened for in samples from patients with manifest disease, using real-time quantitative PCR (RT-qPCR). To find early miRNA alterations, levels of those miRNAs that were altered at diagnosis were measured in prediagnostic plasma samples. Results High tissue expression of both the standard CD44 receptor (CD44s) and its variant isoform CD44v6 as well as low expression of stromal OPN were associated with poor survival. In addition, high CD44s and low OPN predicted poor survival independent of established prognostic factors. Circulating Col IV, Endostatin, OPN, TNC and HA were increased in preoperative samples from PDAC patients. Preoperatively, higher levels of serum-HA and plasma-Endostatin were associated with shorter survival. Postoperatively, higher levels of Col IV, Endostatin and OPN were associated with shorter survival. On the contrary, only one of the conventional tumour markers was associated with survival (Ca 125). Col IV stimulated PDAC cell proliferation and migration and inhibited apoptosis in vitro, dependent on the collagenous domain (CB3) of Col IV and the Col IV binding integrin subunit β1. Reduced endogenous Col IV synthesis inhibited these effects, suggesting that PDAC cells synthesise Col IV to stimulate tumour-promoting events via a newly discovered autocrine loop. 15 miRNAs were altered in early stage PDAC patients and the combination of these markers outperformed Ca 19-9 in discriminating patients from healthy individuals. However, none of the miRNAs were altered in prediagnostic samples, suggesting that plasma miRNA alterations appear late in the disease course. Conclusions Up regulated stromal components in PDAC tumours are detectable in blood samples and are potential diagnostic and prognostic biomarkers in PDAC. High circulating levels of Col IV, Endostatin, OPN and HA predict poor survival, as well as high expression of CD44s and CD44v6 and low expression of OPN in tumour tissue. PDAC cells synthesise Col IV, which forms BM-like structures close to cancer cells and promote tumour progression in vitro via an autocrine loop. Several plasma-miRNAs are altered in PDAC, but are not useful for early discovery.