Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T11:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_ElianaPereirade_M.pdf: 5130344 bytes, checksum: e073f749cf91df021a29deea28d18ceb (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As flutuações da secreção de insulina estimulada por glicose dependem de vários sinais neurais, hormonais e bioquímicos. O papel dos efeitos autócrinos e parácrinos da insulina sobre sua própria secreção é pouco conhecido em parte devido à restrita informação disponível a respeito dos fenômenos moleculares que participam da sinalização da insulina em ilhotas pancreáticas. No presente estudo, demonstra-se que há alta concentração do receptor de insulina (IR) e do substrato 1 do receptor de insulina (IRS1), localizados preferencialmente em células da periferia de ilhotas pancreáticas de rato, e que o bloqueio parcial da expressão da proteína IRS1 através do tratamento de ilhotas isoladas com oligonucleotídeo antisense, leva a um aumento da secreção de insulina induzida pela glicose, a qual é acompanhada pela inversão no padrão de secreção de glucagon e pela queda da expressão de RNAm de somatostatina. Estes dados reforçam o papel inibitório da insulina sobre sua própria secreção em ilhotas pancreáticas íntegras, e explora um novo conhecimento que pode ser empregado como método terapêutico para melhorar a secreção de insulina em diabetes mellitus tipo 2 / Abstract: Several neural, hormonal and biochemical inputs participate actively in the balance of insulin secretion induced by blood glucose fluctuations. The role of insulin as an autocrine and paracrine participant of the control of its own secretion has been understudied mostly due to the insufficient knowledge about the molecular phenomena that govern insulin signaling in pancreatic islets. In the present experiments we demonstrate that higher insulin receptor and insulin receptor substrate-1 (IRS1) concentrations are encountered in cells of the periphery of rat pancreatic islets, and that partia I blockade of IRS1 protein expression byantisense oligonucleotide treatment leads to improved insulin secretion induced by glucose overload, which is accompanied by lower steady-state glucagon secretion and blunted glucose-induced glucagon fali. These data reinforce the inhibitory role of insulin upon its own secretion in isolated, undisrupted pancreatic islets, and explores a novel approach that may be employed as therapeutic method for improving insulin secretion in type 2 diabetes mellitus / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amaral_MariaEsmeriaCorezolado_D.pdf: 3942946 bytes, checksum: 8e4dd04c438e05bd4b43ba8e9eda71c1 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Durante a prenhez, as ilhotas de Langerhans dos mamíferos passam por modificações estruturais e funcionais em resposta a uma demanda maior de insulina. Essas modificações são orquestradas por diferentes hormônios, incluindo GIl, lactogênios placentários e prolactina (pRL). Muitas das alterações observadas durante a prenhez podem ser reproduzidas in vitro, especialmente se forem usadas ilhotas de Langerhans de neonatos como modelo biológico. O tratamento prolongado de ilhotas de ratos neonatos in vitro com prolactina (pRL) aumenta a síntese de insulina, a expressão do GLUT2, a atividade da glicoquinase, o metabolismo da glicose, a formação de ATP, a atividade iônica (representada por maior habilidade da glicose em reter K+ e Ca2+ pelas células insulares) e, finalmente, a secreção de insulina. Desta forma, considerando a ação pleiotrófica da PRL sobre as ilhotas pancreáticas e levando-se em conta que os efeitos da PRL nos tecidos se manifestam predominantemente através da via JAK2/STATs, este trabalho visou estudar outras possíveis vias de estimulação da PRL em ilhotas isoladas de ratos neonatos e de ratas prenhes. Além disso, diante da importância da insulina na manutenção da massa e funcionalidade das células f3 pancreáticas, buscou-se a existência de um possível cross-talk entre as vias de sinalização desses dois hormônios. O tratamento de ilhotas de ratos neonatos com PRL por 7 dias potencializou a secreção de insulina induzida por glicose, sendo este efeito abolido pela wortmannin, um bloqueador da PI 3 quinase. O tratamento com PRL também reduziu a apoptose em ilhotas de ratos neonatos. Este efeito foi acompanhado por aumento da fosforilação da Bad em serina 112 e foi abolido pela wortmannin. O tratamento com PRL não alterou a expressão do mRNA de proteínas apoptóticas tais como Bax, Bad, Bcl-XL. A exemplo do observado para a insulina, a exposição de ilhotas de ratos neonatos à PRL por 5 e 15 mino aumentou, de maneira dose-dependente, a fosforilação do IRS 1/2, a associação destes com a PI 3-quinase e a atividade desta enzima. Contudo, esses efeitos não foram aditivos aos da insulina. A PRL também estimulou a fosforilação da JAK2, SHC e ERK1/2 em ilhotas de neonatos. Em ilhotas isoladas de ratas prenhes (15°-18° dias de prenhez) houve aumento da fosforilação em tiro sina do IRS 1/2, SHC e ERK, em serina da AKT e em serina-treonina da p70 S6-quinase, quando comparado a ilhotas de ratas-controle. A administração nas ratas prenhes de oligonucleotídeo antisense (mas não do sense) para o receptor de PRL (pRLR) reduziu a expressão do PRLR no útero e nas ilhotas, a fosforilação em tiro sina de proteínas insulares com peso molecular entre 250-160, 160-105 e 105-75 kDa, a fosforilação da p70 S6 quinase e, finalmente, a secreção de insulina. Concluindo, esses resultados indicam que a PRL pode estimular as vias da PI 3-quinase e da MAPK em ilhotas de ratos neonatos e que essas vias estão mais ativas nas ilhotas de ratas prenhes. O fato de a PRL ter induzido fosforilação da Bad serina 112, um substrato da via da MAPK, e este efeito ter sido abolido pela wortmannin, sugere a existência de um possível cross-talk entre as cascatas da PI 3-quinase e da MAPK em ilhotas de ratos neonatos / Abstract: During pregnancy, panereatie islets undergo a number of structural and functional changes in response to an increased demand for insulin. These changes are orchestrated by several hormones including GH, plaeental lactogens, and prolactin (pRL). Many ofthe alterations observed during pregnancy ean be reproduced in vitro, especially if one uses neonatal islets as a model. The treatment of neonatal islets with PRL inereases: insulin synthesis, GLUT2 expression, glueokinase activity, glucose metabolism, eAMP metabolism, ATP produetion, ionic activity (represented by higher ability of the glueose in retaining K+ and Ca2+ inside the islet eells), and finally insulin secretion. Thus, taking into aeeount the pleiotropie effects of PRL on panereatie islets and reconsidering that PRL acts mainly via the JAK2/STATs pathways in most of the target tissues, we have studied here if PRL stimulates also the PI 3 kinase and MAPK pathways in islets ITom neonatal and ITom pregnant rats. Sinee insulin is important for the maintenance of the mass and functionality of adult islets, we have also analyzed a possible eross-talk between the signaling pathways of these two hormones. PRL signifieantly potentiated glueose-induced insulin secretion in islets cultured for 7 days. This effect was bloeked by the speeifie PI 3-kinase inhibitor, wortmannin. PRL treatment also reduced apoptosis that was accompanied by an inerease in Bad Ser 112 phosphorylation. These effects were abolished by wortmannin. PRL did not affeet mRNA expression of apoptotie protein sueh as Bad, Bax, and Bcl-XL. Similar to what was observed for insulin, the exposure of neonatal islets for short period of time (5 and 15 min) to PRL inereased, in a dose-dependent manner, IRS 1/2 tyrosine phosphorylation, their association with, and activation of PI 3-kinase. However, these effects were not additive to the effects of insulin. PRL also increased JAK2, SHC, ERK1/2 phosphoryIation in neonatal isIets. In pregnant rats (17th -19th days of pregnancy) higher IeveIs of tyrosine (IRS1, IRS2, SHC, ERK), serine (AKT), and serine-threonine (p70 S6-kinase) phosphorylation were found, compared to controIs. The treatment of pregnant rats with PRL receptor antisense (pRLR), but not sense oligonucIeotides, significantly reduced the expression of PRLR in uterus and islets, the expression of islet tyrosine phosphorylated proteins with molecu1ar masses of 250-160, 160-105 and 105-75 kDa, phosphorylation of the p70 S6-kinase and, finally, the glucose-induced insulin secretion. In conclusion, PRL treatment activates PI 3-kinase and MAPK pathways in neonatal islets. These pathways seem to be more active in islets ITom pregnant than controI rats. Since PRL induced phosphoryIation of Bad Ser 112, a preferential target for MAPK, was abolished by wortmannin, some earIy cross talk between the PI 3-kinase and MAPK cascades may occur during stimulation with PRL / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Filiputti_Eliane_M.pdf: 3931644 bytes, checksum: 067460cd3f30591368f8a82bd8d1986f (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo estudar alguns dos possíveis determinantes da resposta pancreática deficiente à estimulação com leucina (L) e a associação com agente colinérgico carbacol (CCh), tendo os ratos submetidos à dieta hipoprotéica como modelo experimental. Os sinais de desnutrição tais como: baixo peso corporal, hipoalbuminemia, teores elevados de glicogênio e de gordura hepática, estiveram presentes nos animais que receberam dieta hipoprotéica. Esses animais apresentaram ainda menores níveis de insulina plasmática. A análise do aminograma mostrou que aminoácidos importantes com leucina, valina, arginina e taurina estão reduzidos neste modelo experimental, tanto no jejum como no alimentado. Por outro lado, os estudos "in vitro" demonstraram menor oxidação de leucina em ilhotas de rato hipoprotéicos. A monitorização do efluxo de cálcio mostrou aumentado em ilhotas LP em presença de L e CCh. Contudo a resposta secretória de insulina das ilhotas LP foi menor, comparada com a dos animais NP quando estimulada com leucina, potássio na ausência ou na presença de CCh. O mesmo resultado foi observado quando foram utilizados os agentes potencializadores tais como: gliceraldeído, cetoisocaproato, IBMX e PMA em presença de leucina. Com o uso da técnica de Westem Blotting observamos redução na quantidade de proteína p70S6K e AKT e por RT-PCR diminuição da quantidade de mRNA para a p70S6K. Diante disso o período de restrição protéica a que foram submetidos esses animais alterou em ilhotas pancreáticas a oxidação da leucina, o movimento de cálcio, e conseqüentemente a secreção de insulina frente à leucina, potássio, agentes potencializadores e CCh. Por fim, a associação destes resultados com a redução de proteínas como a p70S6K e AKT em ilhotas desses animais pode explicar, pelo menos em parte, a pobre secreção de insulina observada neste modelo experimental / Abstract: The aim of the present work was to study the effect of low protein diet (LP), m particular the role of reduced intake of the amino acid leucine (L) m the mechanism of pancreatic islet insulin secretion. Male Wistar rats submitted to LP (6% protem) were compared to age and gender matched controls maintamed with normal protein diet (NP) (17% protein). Pancreatic islets isolated from NL and LP groups were submitted to various glucose concentrations and stimulatory drugs to compare the amount of the insulin secretion. The insulin was measured by radioimunoassay. The level of leucine oxidation and 45Ca outflow were also compared by 14(:02 output and 45Ca efflux, respectively. Western Blottillg was applied to compare the levels of p70S6k.l and Akt and RT- PCR to evaluate the levels ofp70S6k.1 mRNA in both groups. LP rats presented with significantly lower body weight, serum protein and albumin, but higher glycogen and liver fat. No differences in serum glucose levels were observed. The aminogram analysis from serum demonstrated that LP groups either fasted or fed had significantly lower levels of leucine, valine, arginine, taurine compared to NP. In vitro insulin secretion in the LP group was significantly lower in the basal situation and in response to stimulation with carbachol, potassium, gliceraldeid, PMS, KIC, IBMX. The addition of the amino acids leucine in the media did not elevated the insulin secretion in the LP group to levels comparable to NP group. In addition, leucine oxidation and calcium out flow from pancreatic islets of LP group were significantly lower. The p70S6k-l and Akt protein expression and p70S6k-1 mRNA levels were lower in LP group as revealed by Westem Blotting and RT-PCR analysis, respectively. These findings indicate that LP diet let to pancreatic islets dysfunction and that correlated with reduced calcium outflow and decreased leucine oxidation in those cells. The mechanisms may involve lower systemic leucine levels, and lower expression of the signaling elements p70S6k.1 and Akt / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:16:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_DanielAndradeda_M.pdf: 2697533 bytes, checksum: d12b9062280cdcb4fda2b4e21d0f6529 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Muitas proteínas estão envolvidas no processo de extrusão de grânulos e fusão de membranas nas células ß pancreáticas, e entre estas se destacam as proteínas da família SNARE, composta pela sintaxina, VAMP, SNAP-25 e as sinaptotagminas. Durante a prenhez e o período pós-natal, a prolactina (PRL) e os lactogênios placentários induzem a maturação do processo secretório nas ilhotas pancreáticas por um mecanismo que não está totalmente conhecido. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar se o aumento na resposta secretória frente à glicose observado durante a prenhez envolve alterações na expressão das proteínas SNARE e das sinaptotagminas 1 e 4. Observamos aumento na expressão gênica e protéica da sintaxina 1A, SNAP-25, VAMP-2 e da sinaptotagmina 4 nas ilhotas de neonatos (1 ¿ 2 dias de vida) tratadas com PRL. Demonstramos também que ilhotas de ratas prenhes (17 ¿ 18 dias após cópula) apresentam maior expressão da sintaxina 1A, SNAP-25 e sinaptotagmina 4 que ilhotas controle. Além disso, a inibição das vias da PI3-cinase pela wortmanina ou da MAP-cinase pelo PD098059, não alterou a transcrição destes genes. Desta forma, podemos concluir que prolactina modula a expressão gênica e protéica de parte dos componentes ligados aos passos finais da extrusão dos grânulos de insulina e que este efeito não é mediado pelas vias da PI3- ou da MAPcinase / Abstract: The soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attached protein receptor (SNARE) molecules SNAP-25, syntaxin and VAMP-2 as well as synaptotagmins participate in the extrusion of insulin containing granules in pancreatic ß-cells. During pregnancy and the perinatal periods of life, prolactin (PRL) and other lactogenic substances induce maturation of the stimulus-secretion coupling in the pancreatic islets by a mechanism that is still unclear. In the present study, we investigated whether the improvement in the secretory response to glucose during those periods involves alteration in the expression of syntaxin 1A, SNAP-25, VAMP-2 and synaptotagmins 1 and 4. In islets from pregnant rats (17th ¿ 18th days of pregnancy) and islets from neonatal rats (1-2 days old) treated with PRL for five days, the expression of syntaxin, SNAP-25 and synaptotagmin 4 genes and their encoded proteins was increased compared with controls. VAMP-2 gene and protein was increased in PRL treated-islets from neonatal rats but not in islets from pregnants rats. Wortmannin, a PI3-kinase inhibitor, and PD098059 (PD), a MAP-kinase inhibitor, failed to abrogate the effect of treatment with PRL on the expression of the above proteins. In conclusion, these data indicate that PRL modulates the final steps of insulin secretion by increasing the expression of proteins involved in membrane fusion. These experiments also indicate that effects of PRL occur mainly through a signaling cascade distinct from the PI3-kinase or MAP-kinase pathways / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Bibliografia: f. [79]-110 / Made available in DSpace on 2018-07-24T12:25:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_LuisCarlos_M.pdf: 5758930 bytes, checksum: e1df9ef455ed05e6d86b81c90ee8b4c7 (MD5) Previous issue date: 1984 / Resumo: A proposição central do presente estudo, foi a análise dos efeitos da 4-AP, sobre a permeabilidade das células beta, ao 'K POT. +' e, conseqüentemente, avaliar a secreção de insulina por ilhotas de Langerhans isoladas. Por outro lado, o objetivo terminal, foi uma contribuição proliminar, para um melhor entendimento das múltiplas etapas do mecanismo de secreção de insulina. A execução da parte experimental, foi primeiramente constituída pela incubação ou perfusão de grupos de ilhotas pancreáticas de rato, submetido a diferentes protocolos. A incubação de ilhotas por períodos de 90 a 120 minutos, prestou-se para a avaliação da incorporação de 'ANTPOT. 45 Ca' ou da oxidação da glicose. Com a perfusão de ilhotas durante 70 a 90 minutos, efetuou-se a análise de efluxo fracionário do 'ANTPOT 86 Rb', e da dinâmica da secreção de insulina e do efluxo do 'ANTPOT 45 Ca'. Os resultados obtidos são resumidos a seguir: 1- Sob a análise da dinâmica da secreção da insulina, observaou-se que, em meio contendo concentrado limiar de glicose(6,0 mM), a taxa secretória média atingiu, repectivamente, 0,169 '+ OU -' 0,008 , 0,245 '+ OU -' 0,031 e 0,115 '+ OU -' 0,009 'mu"U/ilkhota/minuto, antes durante e após a introdução de 10,0 mM de 4-AP, ao sistema perfusor. O pico estimulatório de secreção foi rápido e passageiro, para a seguir retomar os níveis basais. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Fisiologia e Biofisica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nogueira_TatianeCristinadeAraujo_M.pdf: 6446233 bytes, checksum: b7dca032457cdd61b13fb51d4cca6714 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2) desempenham importante papel no metabolismo de lipídios de membrana e estão intimamente relacionadas com a liberação de ácido araquidônico (AA), derivado dos lisofosfolípideos e estão presentes em diversos venenos extraídos de animais peçonhentos. A crotoxina é um composto extraído de venenos de cascavel e é constituída pela crotapotina e pela PLA2. A homologia das PLA2 de venenos com as dos mamíferos têm sido de grande utilidade no estudo de identificação de proteínas alvo, classificação de receptores de PLA2 endógenas e estudos funcionais de diferentes tecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel da crotoxina-like, extraída do veneno da cascavel Crotalus durissus collilineatus, e suas subunidades sobre a secreção de insulina por ilhotas de Langerhans, visando elucidar os mecanismos que estariam envolvidos na modulação da secreção de insulina em presença de diferentes agentes. Em experimentos realizados em ilhotas de Langerhans de ratos Wistar verificou-se que a crotoxina potencializa a secreção de insulina estimulada por 16.7 mM de glicose e este efeito é devido à subunidade PLA2 presente nesta toxina,uma vez que a crotapotina não afetou a secreção de insulina estimulada por glicose. Além disso, a PLA2 do veneno induziu aumento da secreção de insulina de maneira dose-dependente. A adição de glicose marcada na ausência de PLA2 induziu um aumento de liberação de 14CO2 de 30 ± 0.6 pmol/ilhota/90 min que foi similar aos valores obtidos na presença de PLA2 (32 ±1. 7 pmol/ilhota/min) Nifedipina (10 mM), um bloqueador de canais de cálcio, reduziu a secreção de insulina estimulada por potássio, mas não afetou a potencialização da secreção de insulina pela PLA2. O bloqueador de canais de sódio, tetrodotoxina (TTX) na concentração de 10 mM não alterou o aumento da secreção de insulina induzido pela PLA2. A quelação de cálcio extracelular por EGT A (0,5 mM) também não afetou a potencialização da secreção de insulina nas ilhotas de Langerhans de ratos estimulada pela PLA2. Estes resultados mostram que os mecanismos pelos quais a PLA2 eleva a secreção de insulina em ilhotas de Langerhans de ratos não envolvem o metabolismo da glicose, a ativação de canais de cálcio e sódio e a participação direta dos íons cálcio do meio extracelular. No entanto, a secreção de insulina potencializada pela PLA2 foi significativamente atenuada tanto pela incubação prévia das ilhotas de Langerhans com heparina (5 UI/m1) quanto pela adição de dexametasona (5 e 10 mM). Paralelo a potencialização da secreção de insulina, um aumento significativo do efluxo de ácido araquidônico foi observado em ilhotas de Langerhans de ratos em presença de PLA2. Assim, estes achados sugerem que a potencialização da secreção de insulina induzida pela PLA2 em baixa concentração ou concentração supralimiar de glicose está possivelmente relacionada com a mobilização de ácido araquidônico / Abstract: The crotoxin results from phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin interaction. The PLA: acts in the membrane phospholipids generating arachidonic acid (AA). Venom PLA2 has been used as a pharmacological tool to identify target protein, mammalian receptor, and physiological cellular function. Therefore, the aim of this work was to study the role of crotoxin-like from Crotalus durissus colfjfjneatus and its subunits on the insulin secretion of the isolated rat Langerhans islets. Also, we investigated the underlying mechanisms by which the venom PLA2 would evoke insulin secretion in the presence of insulinotropic agents. Our experiments demonstrated that insulin secretion was potentialized by crotoxin in a dose-dependent manner in presence of low and high glucose concentration and this effect is related to PLA2. Neither glucose metabolism nor ionic channels (Ca+2 and Na+ channels) are involved in the enhancement of insulin secretion induced by PLA2 in isolated Langerhans islets since label glucose, nifedipine (10 mM) and tetrodotoxin (10 mM) did not affect this response. EGT A also did not interfere with the potentiation of insulin secretion induced PLA2 showing that extracellular calcium is not directly involved in this phenomenon. However, heparin and dexametasone significantly attenuated the increase of insulin secretion in response to PLA2.Moreover, the efflux of AA was markedly increased in parallel to enhancement of insulin secretion in isolated rat Langerhans islets. In conclusion, these findings show that the potentiation of insulin secretion induced by PLA2 in presence of glucose may be related to AA mobilization of Langerhans islets from rats / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Antonio Carlos Boschero, Antonio Ari Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T02:38:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_SilvanaAuxiliadoraBordinda_D.pdf: 7203388 bytes, checksum: c77a4e34c567f2a9f3b4744751eab31c (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: O presente trabalho teve como proposta caracterizar o subtipo funcional de mAChR na célula ß pancreática, bem como elucidar os mecanismos iônicos envolvidos na estimulação muscarínica. Para isto, foram utilizadas ilhotas de ratos e camundongos, isoladas por digestão enzimática ou microdissecção. A resposta celular frente a estimulação pelo agonista muscarínico OXO-M foi analisada sob diferentes aspectos: (1) secreção de insulina; (2) efluxo de radioisótopos (45Ca e 86Rb); (3) concentração citoplasmática de Ca2+ ([Ca2+]i); (4) atividade elétrica; e (5) expressão dos mAChRs. Os resultados mostram que OXO-M aumentou, de forma dose-dependente, a secreção de insulina por ilhotas de roedores. Na presença de alta concentração (50 µM), OXO-M induziu uma resposta bifásica da secreção, tanto na presença de 5,6 quanto de 16,7 mM de glicose. O aumento da secreção induzido pela OXO-M foi drasticamente reduzido pela retirada de Ca2+ do meio perfusor, e completamente abolido na ausência de glicose. Entretanto, na ausência de glicose mas na presença de K+ em concentração despolarizante (40 mM), OXO-M aumentou significativamente a secreção de insulina. O efeito potencializador da OXO-M foi inibido pelos antagonistas 4-DAMP (M3); p-F-HHSiD (M3>M1>M2) e pirenzepina (M1) com valores de IC50 para estes antagonistas de ~ 5, 20 e 340 nM, respectivamente. A análise molecular do subtipo de mAChR expresso nas ilhotas pancreáticas, realizada pela amplificação do cDNA por PCR, demonstrou a presença dos subtipos M1 e M3 no tecido. Entretanto, o estudo farmacológico indicou que o subtipo M3 representa o receptor muscarínico que medeia a estimulação da célula ß. Em outra série de experimentos, foram estudados os movimentos iônicos envolvidos na estimulação celular induzida pela OXO-M. Na presença de 5,6, 11,2 ou na ausência de glicose, OXO-M aumentou a [Ca2+]i de células ß isoladas. Este aumento foi parcialmente inibido pela adição de EGT A no meio de perfusão. OXO-M (50 µM) também aumentou o efluxo de 45Ca de ilhotas perfundidas, tanto na presença quanto na ausência de Ca2+ no meio extracelular. Entretanto, na ausência de Ca2+ (condição que representa o fluxo unidirecional provindo de compartimentos intracelulares), o aumento no efluxo foi transiente. A curva obtida pela diferença entre os efluxos normalizados, em ambas as condições experimentais, demonstrou a presença de um segundo componente, de aparecimento tardio e provavelmente decorrente da entrada de Ca2+ nas células. Tanto na presença quanto na ausência de glicose, OXO-M aumentou o efluxo do 86Rb. OXO-M também aumentou a atividade elétrica induzida pela glicose. Em 11,2 mM de glicose, OXO-M (0,1 e 10 µM) produziu diferentes efeitos sobre a atividade elétrica. Em ambas as concentrações, o agonista provocou o aumento na freqüência de bursts. Por outro lado, em presença de concentrações micromolares OXO-M induziu alterações multifásicas na atividade elétrica, caracterizada pela inibição transiente da atividade elétrica (i.e., polarização da membrana), seguida pelo aumento na freqüência de bursts e por uma pequena despolarização da membrana na fase silente. O efeito polarizante da OXO-M foi inibido pela ChTX, um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ (KCa). A permeabilidade ao K+, calculada a partir dos valores de efluxo do 86Rb e de potencial de membrana, aumentou durante a fase de polarização, mas não foi diferente do controle durante o estado estacionário. Concluindo, o efeito potencializador da OXO-M sobre a secreção de insulina induzida pela glicose depende da ativação dos receptores muscarínicos do subtipo M3, presentes na membrana da célula ß. Semelhante ao observado na estimulação por outros agonistas (p.e., ACh e CCh), o aumento na secreção depende da presença de glicose e Ca2+ no meio extracelular. A polarização transiente induzida por concentrações micromolares de OXO-M representa a ativação dos canais KCa. Por outro lado, a permeabilidade ao K+ no período estacionário indica que a despolarização da membrana não é conseqüência do bloqueio de canais de K+, mas provavelmente da ativação de uma corrente sensível aos níveis intracelulares de Ca2+ (CRAC). Assim, o balanço entre a ativação dos canais KCa e CRAC poderiam determinar o grau de despolarização induzi da por agonistas muscarínicos, mecanismo este provavelmente importante na modulação da secreção de insulina durante a estimulação colinérgica / Abstract: The effects of the muscarinic agonist oxotremorine-m (OXO-M) on insulin secretion, 45Ca and 86Rb fluxes, cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i), and electrical activity in pancreatic rodent ß-cells were studied. ln the presence of glucose, OXO-M produced a dose-dependent potentiation of insulin secretion from rat and mouse islets. Higher doses of OXO-M (50 µM) induced a biphasic insulin response, both at low (5.6 mM) or high (16.7 mM) glucose concentration. ln a Ca2+-deficient medium containing glucose (5.6 mM), OXO-M evoked only a reduced first phase of insulin secretion. ln the absence of glucose, OXO-M (up to 200 µM) did not effected basal secretion. However, in the absence of glucose, but at a depolarizing K+ concentration (40 mM), OXO-M significantly increased insulin release from incubated islets. The potentiating effects of OXO-M were inhibited by the muscarinic receptor antagonists 4-DAMP (M3), p-F-HHSiD (M3> M1>M2), and pirenzepine (M1) in a dose-dependent manner; half maximal inhibitory concentration values were ~ 5, 20, and 340 nM, respectively. cDNAs encoding for M1 and M3 muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) were detected in rat pancreatic islet cells by polimerase chain reaction (PCR) amplification techniques. The PCR products showed bands with the expected base pair number corresponding to M1 and M3 selected sequences. ln other series of experiments, we studied the ionic movements under muscarinic stimulation. At zero, 5.6 or 11.2 mM glucose, OXO-M increased the [Ca2+]i in isolated ß-cells. The increment in the [Ca2+]i was partially inhibited by the addition of EGTA in the perifusion medium. OXO-M (50 µM) also increased 45Ca efflux from islets perifused either in the presence or in the absence of Ca2+. However, under the latter condition, the efllux (which reflects intracellular Ca2+ mobilization) was transient. The normalized difference between emuxes revealed the presence of a delayed and sustained second component, originating from the extracellular space. Either in presence or absence of glucose, OXO-M increased 86Rb efflux. OXO-M also produced a dose-dependent increase on the glucoseinduced electrical activity. At 11.2 mM glucose, OXO-M (0.1 and 10 µM) had two distinct effects: both concentrations increased the steady-state burst frequency; however, micromolar concentrations of OXO-M induced a multiphasic change in the pattern of electrical activity, including a transient inhibition of electrical activity and then a phase of high burst frequency, which was accompanied by a small depolarization in the membrane during the silent phase. The polarizing effect of OXO-M was almost completely suppressed by charibdotoxin (ChTX), a blocker of the large conductance [Ca2+ ]i ¿ activated potassium channel (KCa). K+-permeability values, calculated from 86Rb efflux and electrical measurements, increased during the polarizing phase, but was not different from control values (no OXO-M) during the steady state period. In conclusion, the potentiation of glucose-induced insulin secretion by OXO-M depends on the activation of a muscarinic M3 receptor subtype, present in the ß-cell plasma membrane. As already observed for others muscarinic agonists, such as ACh and CCh, OXO-M potentiated-insulin secretion depends on the presence of suitable amount of glucose and Ca2+ in the extracellular medium. The rapid and transient polarization induced by OXO-M (over 1 µM) represents the activation of the maxi K+-channel. As OXO-M did not changed K+ permeability during the steady-state period, the depolarizing effect of OXO-M does not reflects a decrease in K+-permeability. Instead, it may be the consequence of activation of a current sensitive to the depletion of intracellular Ca2+ stores (CRAC). Thus, the balance between the activation of KCa channel and CRAC could dictate the degree of depolarization induced by muscarinic agonists. Finally, although the KCa channel was not implicated in the repolarization of glucose-induced electrical activity in ß-cells, our results support the idea that the maxi K+-channel could play a role in the cholinergic modulation of insulin secretion / Doutorado / Fisiologia e Biofisica / Doutor em Ciências

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T09:57:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_AnaCristinadosSantos_M.pdf: 2984469 bytes, checksum: 05ad25856a10ccc3e82024835a6de424 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Este trabalho objetivou avaliar a maturação do sistema secretor de insulina em ratos, através de um estudo, temporal da resposta secretória frente a diferentes estímulos. Para isso, fragmentos de pâncreas - (0,5 à 1 mm3) de fetos e neonatos e ilhotas adultas, foram incubados por 1 hora à ¿37 GRAUS C¿ em atmosfera de 95% 'O IND. 2¿ /5% 'C¿O IND. 2¿. As incubações foram realizadas em. solução de Krebs-Ringer contendo diferentes concentrações de glicose,potássio, teofilina e carbamilcolina. Após o período de incubação, a insulina secretada no meio, bem como, a extraída dos fragmentos de pâncreas ou de ilhotas isoladas, foram medidas por radioimunoensaio, sendo a secreção expressa como percentagem do conteúdo total de insulina ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The aim of this work was to study, in rats, the maturation process of the secretory response of insulin following several stimuli. For that, pieces of pancreas (0,5-1 mm3) from rat fetuses and newborns or isolated adults islets, were incubated for 1 .hour at ¿37 GRAUS C¿ in 95% 'O IND. 2¿ /5% 'C¿O IND. 2¿ atmosphere with differents concentrations of glucose, potassium;. theophylline and carbamylcholine. Following the incubation,. the insulin secreted into the medium and extracted from the tissues, were measured hy radioimmunoassay,and were expressed as percentage of total insulin content ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores : Carla Beatriz Collares-Buzato, Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T12:06:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leite_AdrianaRibeiro_M.pdf: 8822503 bytes, checksum: 3e64b2ae27c71f15b7a6adbac9bf6fa3 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: As junções comunicantes (JCs) ou gap junctions são canais intercelulares formados pela união de dois hemicanais ou conexons, os quais são formados por proteínas integrais pertencentes à família das conexinas (Cx). Estudos em ilhotas pancreáticas têm demonstrado que a comunicação intercelular, via junções comunicantes, é fundamental para adequada biossíntese, estoque e liberação de insulina pelas células b pancreáticas. Condições que promovem a formação de JCs aumentam a secreção e biossíntese deste hormônio. Por outro lado, o bloqueio dos canais ou ruptura das JCs na célula 13 resultam em comprometimento do processo secretório. Ilhotas pancreáticas de fetos e recém-nascidos de ratos exibem uma resposta secretória de insulina reduzida em comparação às ilhotas de animais adultos. Cultivo prolongado de ilhotas pancreáticas, bem como o tratamento in vitro com hormônios somatotróficos, como a prolactina, induzem maturação deste processo de acoplamento estímulo-secreção. Esta tese teve como objetivo investigar os possíveis mecanismos intracelulares de regulação das JCs pela cultura prolongada e pelo tratamento in vitro com prolactina em ilhotas pancreáticas de ratos recém-nascidos. Para tal, foi avaliada a localização, o grau de expressão gênica e o conteúdo celular das proteínas integrantes das JCs, as conexinas 43 e 36, bem como o grau de adesão celular pela expressão da b -catenina nas ilhotas nestas condições experimentais. Foram executados os seguintes protocolos: 1) tratamento in vitro com prolactina (2mg/mL/dia) durante 7 dias, 2) cultivo das ilhotas por períodos variando de 1 a 7 dias e 3) cultivo por 3 dias em concentrações variáveis de glicose no meio de cultura. Foi detectado um aumento significativo da secreção de insulina após o tratamento com prolactina, tempo prolongado de cultivo e concentração crescente de glicose no meio. Este resultado indica que tais condições experimentais induzem maturação do processo de secreção de insulina em ilhotas pancreáticas de ratos recém-nascidos. O tratamento crônico com prolactina também induziu um aumento na expressão de Cx43 e b -catenina, como demonstrado por Westem Blot. Ambas proteínas juncionais foram detectadas por imunocitoquímica na região de contato intercelular nas células das ilhotas. Quanto ao efeito da cultura per se, foi observada uma correlação entre o tempo de cultivo e o aumento na expressão celular de Cx43, Cx36 e b -catenina. No caso das conexinas, a cultura prolongada também resultou em aumento da transcrição gênica, como detectado pelo método de RT-PCR. Quando foram analisadas as variações de expressão das conexinas em resposta à glicose, somente a Cx36 pareceu ser regulada por concentrações crescentes deste secretagogo no meio de cultura. Esses resultados, tomados em conjunto, sugerem que a regulação das conexinas nas ilhotas pancreáticas pela prolactina, glicose e outros fatores contidos no meio de cultura podem ser importantes no processo de maturação das células 13 em condições de cultivo / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Glicose e oxigênio desempenham um importante papel na regulação do metabolismo celular. Dada a importância de ambos no metabolismo - o primeiro como fonte de carbono preferencial da maior parte das células, e o segundo como aceptor final de elétrons na cadeia respiratória, em diversos organismos desenvolveram-se métodos adequados para detectar sua presença de modo a ajustar o metabolismo em função de sua disponibilidade. Neste trabalho foi realizado o estudo da expressão, no nível transcricional, dos genes envolvidos nas vias metabólicas primárias e genes envolvidos em morte celular, em células humanas, com o intuito de determinar as alterações no metabolismo energético em resposta a condições de hipóxia e anóxia, por meio da técnica de microarrays de cDNA. Utilizamos, inicialmente, células normais de fibroblasto humano ASl98 e células de fibroblasto humano MRC-5 imortalizadas por transfecção por SV40, e por fim células provenientes de ilhotas pancreáticas humanas, para a elaboração de um protocolo de cultura celular em que as mesmas crescessem aderidas a microcarregadores Cytodex I. Numa segunda etapa, células de ilhotas pancreáticas humanas foram cultivadas em suspensão, aderidas aos microcarregadores, num biorreator, sendo então realizada a análise do perfil transcricional dos genes escolhidos, frente às condições de baixa tensão de oxigênio. É apresentada a análise da expressão gênica de aproximadamente 160 genes na qual foram verificados um comportamento de indução daqueles envolvidos no metabolismo de lipídios e alguns na morte celular e um comportamento inicial de indução, e posterior inibição, do metabolismo primário como um todo. Em vista dos dados obtidos é de interesse ressaltar que essas células deveriam ser mantidas em saturações de oxigênio acima de 5% para evitar o efeito deletério observado na baixa concentração de oxigênio sobre a viabilidade celular, em termos da indução de alguns genes envolvidos na morte celular e da repressão geral dos relacionados ao metabolismo energético. Também foi verificado que, em saturações de oxigênio de até 10%, as células adotaram um padrão transcricional que indicou uma resposta ao estresse por falta de oxigênio, este por sua vez reflete-se na viabilidade celular, característica crucial para o sucesso do transplante clínico de ilhotas. / Glucose and oxygen have important roles on the regulation of cellular metabolism. Due to their importance in metabolism, the former as the preferential carbon source and the later as the final electron acceptor of the respiratory chain, many organisms have developed suitable processes to detect their presence in order to adjust the cellular metabolism to their availability. In this work, we have studied, in human cells and at the transcriptional level, the expression of genes involved in primary metabolism pathways and some of those related to cell death, aiming to resolve alterations in the energetic metabolism as a response to hypoxic and anoxic conditions, by means of cDNA microarrays. We initially used AS198 human fibroblastic normal cells and MRC-5 human fibroblastic cells immortalized by SV40, and later on cells from human pancreatic islets, to develop a cell culture protocol in which they would grow on the surface of Cytodex 1 microcarriers. As a second step, cells from human pancreatic islets were cultured on microcarriers in suspension inside a bioreactor. This culture was then used to carry out the transcriptional profile analysis of selected genes in response to low levels of oxygen. This work presents the analysis of gene expression of approximately 160 genes that can be divided into two distinct groups. The first group, the expression of which is induced, comprises genes involved in lipid metabolism and some of those related to cell death. The expression of the second group, consisting of diverse genes of the primary metabolism, suffers an initial induction followed by repression. Given the data acquired it is interesting to note that the human pancreatic islets should be maintained under at least 5% dissolved oxygen to avoid the deleterious effects on cell viability observed at lower oxygen concentrations, resulting in the induction of some genes involved in cell death and the repression of those related to energetic metabolism. It was also verified that, under oxygen saturation of at least 10%, these cells adopted a transcriptional profile that indicated a response to the stress created by the lack of oxygen, which would in turn reflect on cell viability, a crucial characteristic for success in clinical islet transplantation.