Hintergrund und Fragestellung: Seit der Zulassung des Tyrosinkinase-Inhibitors (TKI) Imatinib im Jahre 2001 hat sich die Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) grundlegend verändert. Imatinib inhibiert die konstitutiv aktive Tyrosinkinase BCR-ABL, welche die verstärkte Proliferation der leukämischen Zellen und die Entwicklung der CML bedingt. Das sehr gute klinische Ansprechen auf eine Imatinib-Behandlung resultierte in einer beschleunigten Zulassung dieses TKI auch bei pädiatrischen Patienten im Jahre 2003. Aufgrund von Punktmutationen und/oder strukturellen Änderungen innerhalb des BCR-ABL Fusionsproteins können sich Resistenzen gegenüber Imatinib entwickeln. Deshalb wurden Zweit- und Drittgenerations TKI wie Dasatinib und Bosutinib entwickelt. Imatinib wirkt nicht hoch spezifisch und hemmt neben BCR-ABL auch weitere Tyrosinkinasen, wie z.B. c-KIT, PDGF-R und c-FMS, welche am Knochenstoffwechsel beteiligt sind. Die Stimulation des Rezeptors c-FMS bewirkt die Differenzierung monozytärer Vorläuferzellen in knochenabbauende Osteoklasten. Zusätzlich unterliegt die Entwicklung der knochenaufbauenden Osteoblasten spezifischen Signalkaskaden an denen PDGF-R und c-Abl beteiligt sind. Als Nebenwirkung einer TKI-Therapie beeinträchtigt die Inhibition dieser Signaltransduktionswege somit das Knochen-“Remodelling“, indem die Entwicklung und funktionelle Aktivität von Osteoklasten reduziert wird. Gleichzeitig wird die Aktivität von Osteoblasten gestärkt, aber deren Proliferation inhibiert. Diese Dysbalance von Knochenaufbau und -abbau mit gestörter Kalziumhomöostase bedingt bei erwachsenen CML-Patienten veränderte endokrinologische Parameter des Kalziumhaushaltes, eine vermehrte Knochenmineralisation und eine erhöhte trabekuläre Knochendichte. Dagegen wurden bei pädiatrischen CML-Patienten unter Imatinib-Therapie Längenwachstumsstörungen beobachtet, welche bezüglich des Wirkmechanismuses von Imatinib auf den wachsenden Knochen bis heute noch nicht im Detail geklärt sind. Spekulativ ist auch, ob Zweit- und Drittgenerations-TKI ebenso wie Imatinib den Knochenstoffwechsel bei pädiatrischen Patienten stören. Angelehnt an ein erfolgreiches Applikationsschema bei erwachsenen CML-Patienten steht zusätzlich die Frage im Raum, ob eine intermittierende Gabe von TKIs (einen Monat Therapie, einen Monat Pause) eine Minderung der Nebenwirkung auf den Knochen bewirken könnte, ohne die Wirkung auf die CML-Behandlung zu beeinträchtigen. Vor diesem Hintergrund wurde ein Nagermodel etabliert, um Nebenwirkungen auf den Knochenstoffwechsel unter TKI-Exposition zu analysieren. Junge, wachsende Ratten wurden hierzu vom präpubertären Alter bis zur Adoleszenz kontinuierlich oder intermittierend mit den TKIs Imatinib, Dasatinib und Bosutinib exponiert und die Wirkung auf das wachsende Skelettsystem untersucht. Methoden: 4 Wochen alte männliche Wistar Ratten wurden über einen Zeitraum von 10 Wochen chronisch mit jeweils einem der drei im Trinkwasser gelösten TKIs exponiert. Neben einer unbehandelten Kontrollkohorte erhielt eine Gruppe jeweils eine Standarddosis und eine hohe Dosis (entsprechend der doppelten Standarddosis) des entsprechenden TKIs kontinuierlich. Eine weitere Gruppe erhielt die hohe Dosis intermittierend (an drei aufeinanderfolgenden Tagen TKI, danach vier Tage nur Wasser). Die Konzentrationen im Trinkwasser betrugen für Imatinib 1 mM und 2 mM und für Dasatinib und Bosutinib jeweils 50 µM und 100 µM. Nach zweiwöchiger (präpubertär), vierwöchiger (pubertäres Stadium) und zehnwöchiger Exposition (postpubertär) wurden die Tiere aller Gruppen nekropsiert und Röhrenknochen, Lendenwirbel und Blut asserviert. Zur Beurteilung des Knochenmetabolismus wurden folgende Parameter erhoben: Knochenlängen, Knochendichten mittels pQCT, trabekuläre Strukturen mittels µCT, Knochenfestigkeit mittels des 3-Punkt-Biege-Test und endokrinologische Parameter im Serum mittels ELISA. Zusätzlich wurde der jeweilige TKI Serum-Spiegel bestimmt. Ergebnisse: Die Gewichtsentwicklung, körperliche Entwicklung und das Sozialverhalten zeigten keine Unterschiede beim Vergleich von Kontrollkohorten mit exponierten Tieren. Die kontinuierliche Exposition mit Imatinib und Dasatinib bewirkte dosisabhängig eine Reduktion der Knochenlängen der Femura und der Tibiae. Bosutinib zeigte diesen Effekt nicht. Die intermittierende Exposition mit hoher Dosis resultierte in einer Knochenlängenreduktion, welche exakt dem Effekt der Standarddosis entsprach. Weiterhin resultierte aus der Exposition mit Imatinib oder Dasatinib eine Verminderung der trabekulären Knochendichten der Femura und Tibiae im präpubertären Stadium. Ratten, welche hoch dosiert Imatinib erhielten, zeigten diese Reduktion ebenfalls im pubertären Stadium, nicht jedoch unter Dasatinib- und Bosutinib-Exposition. Postpubertär unterschieden sich die trabekulären Dichten von Femura und Tibiae der exponierten Gruppen nicht von den Kontrollkohorten. Auf die kortikale Knochendichte und die kortikale Dicke dieser Röhrenknochen zeigte sich kein messbarer Effekt der TKI. Dennoch trat - nur nach Exposition der hohen Imatinibdosis - eine signifikant verminderte femorale Bruchfestigkeit postpubertär auf. Am Lendenwirbelkörper war pubertär und postpubertär die Höhe unter Imatinib-Exposition vermindert, während die Gesamt- und kortikale Knochendichte präpubertär erhöht war bei tendenziell erniedrigter trabekulärer Knochendichte. Die kortikale Dicke wurde durch alle TKI nicht beeinflusst. Dasatinib und Bosutinib bewirkten keinen Effekt auf die Wirbelhöhe, aber eine tendenzielle Minderung der trabekulären Knochendichte. Der serologisch erfassbare Knochenresorptionsmarker „tatrate resistant acidic phosphatase“ (TRAP) war unter kontinuierlicher Exposition mit hoher Dosis von Imatinib zu allen Zeitpunkten erniedrigt. Postpubertär zeigte sich dieser Effekt auch unter Standard- und Hochdosis von Bosutinib. Der Knochenformationsmarker Osteocalcin war unter Imatinib bei allen Kohorten zu allen Analysezeitpunkten erniedrigt, während Dasatinib und Bosutinib keinen Effekt auf diesen Parameter zeigten. Die erfassten Serum-Hormonparameter (Wachstumshormon, Parathormon) lagen unter der Exposition mit Imatinib als erhöhte Wachstumshormonspiegel pubertär und als verminderte Parathormonspiegel prä- und pubertär vor. Unter der Exposition mit Dasatinib kam es ebenfalls pubertär zu einer Erhöhung der Wachstumshormonspiegel und präpubertär zu einer tendenziellen Erhöhung der Parathormonspiegel. Postpubertär normalisierten sich beide Parameter unter der Exposition mit Imatinib und Dasatinib wieder. Unter Bosutinib konnte nur postpubertär erniedrigte Parathormonspiegel ermittelt werden. Eine intermittierende TKI-Exposition resultierte in einem Aufholwachstum und einer teilweise Normalisierung der knochenspezifischen Serumparameter. Als wichtige unerwartete Nebenwirkung zeigte sich unter Langzeitexposition mit Imatinib und Dasatinib eine Zunahme des Herzgewichtes. Unter Imatinib resultierten daraus keine klinischen Auffälligkeiten, während unter Dasatinib eine Herzinsuffizienz zum Tod eines Tieres führte. Bosutinib zeigte keine weiteren makropathologisch erfassbaren Nebenwirkungen. Bis heute sind keine kardialen Nebenwirkungen bei pädiatrischen Patienten nach mehrjähriger TKI-Therapie publiziert. Schlussfolgerung: Das etablierte juvenile Nagertiermodell ist gut geeignet, um die Nebenwirkungen einer Langzeitexposition von TKI auf den wachsenden Knochen zu erfassen. Bei Kindern und Adoleszenten klinisch beschriebene Wachstumsretardierungen unter Imatinib ließen sich zweifelsfrei bei Ratten verifizieren. Bei fehlenden klinischen Daten von Kindern zu Dasatinib präjudiziert das Modell, dass Dasatinib so wie Imatinib den gleichen, Bosutinib hingegen kaum einen Effekt auf den Knochen ausübt. Eine intermittierende Gabe der TKI scheint die Nebenwirkungen auf den Knochen abzumildern und könnte eine neue Möglichkeit der TKI-Therapie für pädiatrische Patienten darstellen. Aus dem Tiermodell der Langzeit-exponierten juvenilen Ratte lässt sich ableiten, dass beim wachsenden Kind unter jahrelanger TKI-Therapie klinisch sorgfältig der Knochenstoffwechsel und das Längenwachstum überwacht und unter Dasatinib zusätzlich kardiale Nebenwirkungen beachten werden sollten. / Background: Since its approval in 2001 the tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib has revolutionized the therapy of chronic myeloid leukaemia (CML). Imatinib inhibits the constitutively active tyrosine kinase (TK) BCR-ABL causing the increased proliferation of the leukemic cells and the progress of CML. According to improved survival rates imatinib has been licensed as frontline therapy also for paediatric CML in 2003. However, due to point mutations or structural changes within the BCR-ABL fusion protein resistance to imatinib occurs. Therefore 2nd and 3rd generation TKI like dasatinib and bosutinib have been developed. Beside BCR-ABL, Imatinib exerts also off-target effects on further TKs like c-KIT, PDGF-R, c-FMS which are involved in bone metabolism. Stimulation of the receptor c-FMS leads to the differentiation of monocytic progenitors to bone resorbing osteoclasts. In addition, the development of bone forming osteoblasts underlies specific signalling cascades involving PDGF-R and c-Abl. As a side effect of TKI therapy these specific signalling cascades are inhibited impairing bone remodelling by reducing the development and functional activity of osteoclasts. Simultaneously osteoblasts’ differentiation is promoted while their proliferation is inhibited. This dysbalance of bone formation and resorption results in altered endocrinological serum markers of the calcium homeostasis, increased bone mineralization, and increased trabecular bone density in adult CML patients. In contrast paediatric CML patients show longitudinal growth retardations under imatinib therapy, however, the detailed action of imatinib on the growing bone is not clarified yet. Additionally, it is unclear if 2nd and 3rd generation TKI will also disturb bone metabolism in paediatric CML patients. Based on an effective treatment strategy in adult CML patients, it is also questioned if intermittent TKI treatment (one month “on”, one month “off”) could minimise side effects on the bone without impairing CML therapy. On this background a rodent model was established to study side effects of TKI treatment on bone metabolism. Juvenile growing rats where exposed from prepubertal age till adolescence continuously or intermittently to imatinib, dasatinib, and bosutinib and the effects on the growing skeleton were analysed. Methods: Four weeks old male Wistar rats were chronically exposed to varying concentrations of one of the three TKIs via the drinking water for 10 weeks. Besides untreated controls a standard dosage group and a high dosage group (equalling the twofold standard dose) received every TKI continuously, while an additional group received the high dosage TKI in an intermittent fashion (3 days per week: “on” TKI; 4 days water without TKI). The concentrations applied were 1 mM and 2 mM for imatinib and 50 µM and 100 µM each for dasatinib and bosutinib, respectively. After 2 weeks (prepubertal), 4 weeks (pubertal stage), and 10 weeks (postpubertal) of exposure, respectively, animals were sacrificed and long bones, lumbar vertebra and blood were isolated. To evaluate bone metabolism the following parameters were analysed: bone length, bone mineral density (BMD) by pQCT, trabecular structure by µCT, bone strength by 3-point bending test, and endocrinological parameters by ELISA. Additionally, serum levels of TKIs were investigated. Results: In comparison to controls no alterations of exposed animals’ bodyweight, overall development and social behaviour were observed. Continuous exposure of imatinib and dasatinib led dose dependently to reduced femoral and tibial length. No such effect was observed under bosutinib. Intermitted exposure of high-dose TKIs resulted in reduced effects on femoral and tibial length identical to the effect observed in groups receiving just standard dose. Furthermore, exposure of imatinib and dasatinib lowered femoral and tibial trabecular BMD prepubertally. Rats receiving high dose imatinib showed reduced femoral and tibial trabecular BMD at pubertal stage, while this effect was not observed under dasatinib and bosutinib exposure. Postpubertally, femoral and tibial trabecular BMD of all exposed groups did not differ from controls. Femoral and tibial cortical BMD and cortical thickness were not affected by TKI exposure. However, under high dose imatinib exposure femoral mechanical breaking strength was reduced postpubertally. In vertebra the height was reduced under imatinib exposure pubertally and postpubertally, while the total and cortical BMD were increased prepubertally and trabecular BMD tended to be reduced. Cortical thickness was not affected by any TKI tested. Dasatinib and bosutinib exhibited no effect on the height of the vertebra but trabecular BMD tended to be reduced. The serum bone resorption marker ‘tartrate resistant acidic phosphatase’ (TRAP) was found reduced under continuous exposure of high dose of imatinib at all time points tested. Postpubertally, the same effect was detected after standard and high dosage of bosutinib. The bone formation marker osteocalcin was reduced in all groups and at all time points tested under imatinib exposure, whereas no such effect was observed for dasatinib and bosutinib. Serum bone related hormone markers (growth hormone (GH) and parathyroid hormone (PTH)) revealed under imatinib exposure increased GH levels pubertally whereas PTH was reduced pre- und pubertally. During dasatinib exposure GH levels were elevated pubertally and PTH levels were increased prepubertally. Postpubertally, both parameters normalised again under imatinib and dasatinib exposure. During bosutinib exposure reduced PTH levels were detected postpubertally only. Intermitted TKI exposure resulted in catch-up growth and partial normalisation of bone specific serum parameters. As major unexpected side effect during exposure increasing heart weights could be observed under long-time imatinib and dasatinib exposure. No clinical changes were observed under imatinib, whereas dasatinib led to cardiac insufficiency leading to death of one animal. Bosutinib showed no additional macrospathologic assessable side effects. To date no cardiac side effects were published in paediatric patients under prolonged TKI therapy. Conclusion: The established juvenile rat model is appropriate to examine side effects of long-term TKI exposure on the growing bone. Published longitudinal growth retardation in children and adolescents under imatinib treatment could be unequivocally mimicked in this rat model. Due to not yet available clinical experience with dasatinib in paediatric patients, this model predicts that dasatinib alters bone metabolism like imatinib whereas bosutinib shows less detectable effects. Intermitted TKI treatment may reduce side effects on the growing bone and therefore could represent a new opportunity of TKI therapy for paediatric patients. Summing up, TKI long-term exposure in this juvenile rat model challenges physicians to diligently monitor bone metabolism in not outgrown paediatric patients during long-term TKI treatment and additionally assess cardiac side effects under dasatinib exposure.

Les traitements actuels de la leucémie myéloïde chronique (LMC) ne permettent pas d’éliminer la totalité des cellules leucémiques. Dans le but de développer un traitement curatif, il est donc nécessaire de parvenir à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents des réponses partielles aux traitements, Dans ce travail, nous avons postulé qu’il existe des mécanismes de contrôle extrinsèques de la LMC pouvant influencer l’efficacité des différents traitements. Nous avons choisi d’étudier le rôle potentiel dans la LMC des lymphocytes iNKT, cellules T de type « inné » auxquelles la littérature attribue de nombreuses fonctions antitumorales et des facteurs moléculaires, la cytokine/alarmine IL-33, produite dans la niche hématopoïétique, et son récepteur ST2 à la surface des cellules hématopoïétiques comme cibles de l’IL-33.La première partie de notre travail a ainsi permis de mettre en évidence de profondes altérations fonctionnelles des lymphocytes iNKT chez les patients atteints de LMC ainsi qu’une correction partielle de ces défauts après traitement par l’Imatinib (IM) ou l’IFN-. L’ensemble de ces résultats permet de proposer que l’altération des fonctions des cellules iNKT au cours du développement de la LMC pourrait participer aux mécanismes d’échappement de la tumeur au contrôle par le système immunitaire. La deuxième partie de notre travail a permis de mettre en évidence une expression de la molécule ST2, chaîne spécifique du récepteur à l’IL-33, à la surface des cellules CD34+ de patients atteints de LMC, expression non décelée chez les sujets sains et les patients en rémission après traitement par l’IM. De plus, contrairement aux cellules CD34+ de sujets sains, les cellules progénititrices de patients en phase chronique prolifèrent en réponse à l’IL-33. Enfin, nous avons montré que l’IL-33 est capable de contrecarrer in vitro les effets antiprolifératifs de l’IM. Ainsi nous pouvons émettre l’hypothèse selon laquelle l’IL-33, une cytokine/alarmine, puisse participer aux phénomènes conduisant à la persistance de progéniteurs hématopoïétiques leucémiques chez les patients sous traitement par IM. / To date, treatment of Chronic Myeloid Leukaemia (CML) is not sufficient to completely eradicate leukaemia cells. Hence, in order to develop a curative treatment, it is necessary to have a better understanding of the underlying mechanisms explaining why response to treatment is only partial..We therefore addressed the question whether the extrinsic mechanisms of CML control can affect the effectiveness of different treatments. We first provided evidence of profound functional impairments of iNKT cells in patients with CML. Interestingly these impairments were partially corrected after treatment with Imatinib (IM) or IFN-. Consequently our results suggest that altered functions of iNKT cells during the development of CML could facilitate tumour escape from immune destruction. . The second part of our work revealed that CD34+ progenitors from CML patients upregulate their cell surface expression of the IL-33-specific receptor chain ST2, proliferate and produce cytokines in response to IL-33, conversely to CD34+ cells from healthy individuals. Moreover, ST2 overexpression is normalized following IM therapy, while IL-33 counteracts in vitro IM-induced growth arrest in CML CD34+ progenitors. From these findings, it can be surmised that IL-33, a cytokine/alarmin likely expressed in the hematopoietic niche, facilitates the development of CML and IM resistance.

Chef de file des inhibiteurs de tyrosines kinase, l’Imatinib Mesylate (IM) a révolutionné la prise en charge de la leucémie myéloïde chronique et des tumeurs stromales gastro-intestiales. En plus de son action directe sur les cellules tumorales, une partie de l’efficacité thérapeutique de l’IM a été attribuée à son aptitude à moduler la réponse immunitaire. Cette propriété soulève la possibilité que les résultats cliniques de l’IM pourraient être améliorés en le combinant efficacement à une immunothérapie. A cet effet, nous avons montré dans un modèle préclinique que l’interleukine-2 (IL-2) – adjuvant des cellules NK – augmente l’efficacité de l’IM. Nous avons également démontré une efficacité supérieure de l’IM en association au cyclophosphamide (CTX) du fait de l’inhibition des lymphocytes T régulateurs. Nous avons donc entrepris un essai clinique de phase 1 associant l’IM, l’IL-2 et le CTX chez des patients ayant une tumeur solide métastatique ou localement avancée. Les objectifs de cet essai sont (i) de déterminer la dose maximale tolérée d’IL-2 associée à l’IM et au CTX ; (ii) d’étudier les paramètres pharmacocinétiques de l’association ; (iii) d’évaluer l’efficacité de l’association et (iv) son effet sur les effecteurs de l’immunité. Au total, 17 patients ont été inclus dans cette étude. La DMT d’IL-2 associée à la dose fixe de 400 mg d’IM correspond à 6 MUI/j. A ce niveau de dose, tous les patients ont présenté au moins un effet indésirable imputable au traitement : principalement fièvre et frissons, augmentation des enzymes hépatiques, asthénie et nausée mais sans que ne soit observée de toxicité limitante. L’étude des paramètres pharmacocinétiques révèle une augmentation significative de l’exposition systémique à l’IM en fin de cycle et qui semble être imputable à l’IL-2. La pharmacocinétique de l’IL-2 n’est par contre pas modifiée par l’administration concomitante d’IM. Sur le plan des effecteurs de l’immunité, l’association IM, IL-2 et CTX diminue le taux de lymphocytes B, lymphocytes T (LT) CD4+ et LT CD8+ mais active les cellules NK puisqu’on observe une augmentation des marqueurs CD56bright, HLA-DR et TRAIL. De manière intéressante, la sous-population de cellules NK HLA-DR+ possède des capacités de dégranulation plus importante après exposition à cette association et son expansion est associée à une meilleure survie. Cette association pourrait donc s’avérer particulièrement intéressante dans le traitement de tumeurs sensibles d’une part à l’IM et d’autre part à la lyse par les cellules NK. Les GIST étant particulièrement sensibles à l’IM, nous avons étudié l’infiltrat tumoral présent au niveau de ses tumeurs. Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle pronostique de l’infiltrat en LT et NK sur la survie sans progression des GIST. En vue d’une étude de phase 2, les GIST apparaissent donc être un modèle tumoral particulièrement pertinent pour évaluer les bénéfices de l’association IM, IL-2 et CTX. / Imatinib mesylate (IM) was the first tyrosine kinase inhibitor to be successfully used in clinical practice and its introduction has revolutionized the management of chronic myeloid leukemia and gastrointestinal stromal tumors. In addition to its direct effects on malignant cells, IM appears to exert immunological off-target effects that contribute to its anticancer effects. Thus, combining IM with immunotherapy might improve patients’ clinical outcome. Indeed, IM combined to Interleukin-2 (IL-2) - a cytokine that enhances natural killer (NK) cells functions - improved antitumor responses in preclinical models. We also observed synergistic effects of cyclophosphamide (CTX) and IM as a result of the inhibition of regulatory T lymphocytes. Based on the promising results of these preclinical studies, we developed a phase 1 clinical trial which combines metronomic CTX, IM and escalating doses of IL-2 in patients affected by refractory solid tumors. The goals of this study were (i) to determine the maximum tolerated dose of IL-2 combined with IM and CTX ; (ii) to study the pharmacokinetics of IM and IL-2 ; (iii) to evaluate clinical efficacy of the combined therapy and (iv) effects of the association on immune parameters. A total of 17 patients were enrolled in the study. The maximum tolerated dose of IL-2 combined with IM, given at a constant dose of 400 mg was determined to be 6 MIU/day. At this dose level, all patients experienced at least one treatment-related adverse event: fevers and chills, transaminase elevation, fatigue and nausea but no dose-limiting toxicities were observed. Pharmacokinetic studies revealed that the co-administration of IL-2 increases the systemic exposure of patients to IM. In contrast, the pharmacokinetics of IL-2 was not modified by IM. The combined therapy markedly reduced the absolute numbers of B lymphocytes, CD4+ T cells and CD8+ T cells in a IL-2 dose-dependant manner. The NK cell compartment was activated, exhibiting a significant upregulation of CD56bright, HLA-DR and TRAIL. Interinstingly, the abundance of HLA-DR+ NK cells after one course of combined therapy positively correlated with both progression free- and overall survival. Thus, it could be of interest to evaluate this immunotherapeutic regimen in a tumor model sensitive to IM and to lysis by NK cells and evaluate whether the adjunction of IL-2 can boost the efficacy of IM. GIST are particularly sensitive to IM, thus we performed a retrospective study of the immune infiltrates and their prognostic value in these tumors. We found that both LT and NK cell infiltrates were independent prognostic factors for progression-free survival. For a phase 2 clinical trial, gastrointestinal stromal tumors appear to be a particularly relevant to evaluate the benefits of the association IM, IL-2 and CTX.

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Les fibromatoses agressives sont des tumeurs conjonctives rares, pouvant envahir les structures adjacentes parfois de manière très agressive et responsables de fréquentes récidives loco-régionales mais dépourvues de potentiel métastatique. Leur évolution est imprévisible. Actuellement, la stratégie de leur prise en charge est remise en cause et ces tumeurs sont de plus en plus souvent surveillées à leur diagnostic. En cas de tumeur évolutive, les traitements systémiques disponibles sont multiples mais d'efficacité variable. Aucun facteur pronostique de récidive ou d'évolutivité spontanée et aucun facteur prédictif d'efficacité des traitements médicaux n'a aujourd'hui été identifié. Les travaux de 2 premières publications ont étudié les facteurs cliniques de récidive après exérèse chirurgicale, et ont retenu le jeune âge du patient, la grande taille tumorale et sa localisation extra-abdominale comme étant de mauvais pronostic. Dans une 3ème publication, nous avons recherché si le sous-type moléculaire de mutation de CTNNB1 observé dans les fibromatoses sporadiques pouvait influencer la récidive: la mutation S45F est de moins bon pronostic que les autres. Un autre article rapporte les résultats de l'analyse des profils d'expression des miRNAs des fibromatoses qui semblent se corréler à leur pronostic mais cela doit être confirmé. Les 3 articles suivant présentent des travaux recherchant des facteurs prédictifs de réponse des fibromatoses à l'imatinib : l'expression d'aucune des cibles connues de l'imatinib n'a été retrouvée comme influençant significativement la réponse au traitement. Le rôle des variants M541L et V530I de l'exon 10 de KIT reste à déterminer / Aggressive fibromatoses is rare mesenchymal tumors, which could invade the neighboring structures sometimes in a very aggressive way and responsible of frequent locoregional recurrences but devoid of metastatic potential. Their evolution is unpredictable. At present, the strategy of their management is questioned and these tumors are more and more often watched after their diagnosis. In case of evolutionary tumor, the available systematic treatments are multiple but of variable efficiency. Any prognostic factor of recurrence or spontaneous evolution capacities and no predictive factor of efficiency of the medical treatments was identified today. The works of first 2 publications studied the prognostic clinical factors of recurrence after surgical excision, and held the young age of the patient, the big tumoral size and its extra-abdominal location as being of bad forecast. In a 3rd publication, we looked for if the molecular subcategory of CTNNB1 mutation observed in the sporadic fibromatoses could influence the recurrence: the S45F mutation is of less good forecast than the others. Another article reports the results of the analysis of the miRNAs expression profiles of the fibromatoses which seem to correlate in their forecast but this must be confirmed. The three following articles present works looking for predictive factors of response of fibromatoses to the imatinib: the expression of none of the known targets for the imatinib was not found as influencing significantly the response to the treatment. The role of the M541L and V530I variants of the exon 10 of KIT remains to determine

Le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) par imatinib est un succès de thérapie ciblée en oncologie. Le principe de cette thérapie est de bloquer les processus biochimiques à l'origine du développement de la maladie, et de permettre à une majorité de patients de réduire leurs risques de progression mais aussi d'éviter des traitements lourds et risqués comme la greffe de cellules souches hématopoïétiques.Cependant, même si l'efficacité de l'imatinib à été prouvée dans un contexte clinique, il n'en demeure pas moins qu'une proportion non négligeable de patients n'obtient par de niveaux de réponse moléculaire jugés optimale. Le but de cette thèse est de tester l'hypothèse d'un lien entre des polymorphismes de gènes impliqués dans l'absorption des médicaments et de leurs métabolisme, et la réponse moléculaire dans la leucémie myéloïde chronique en phase chronique traitée par imatinib.Dans le but d'évaluer la réponse moléculaire des patients, des prélèvements sanguins sont réalisés tout les 3 mois afin de pratiquer le dosage d'un biomarqueur. Ce type particulier de suivi produit des données censurées par intervalles. Comme par ailleurs, les patients demeurent à risque de progression ou sont susceptible d'interrompre leurs traitements pour cause d'intolérance, il est possible que la réponse d'intérêt ne soit plus observable sous le traitement étudié. Les données ainsi produites sont censurées par intervalles dans un contexte de compétition (risques compétitifs).Afin de tenir compte de la nature particulière des données collectées, une méthode basée sur l'imputation multiple est proposée. L'idée est de transformer les données censurées par intervalles en de multiples jeux de données potentiellement censurées à droite et d'utiliser les méthodes disponibles pour l'analyser de ces données. Finalement les résultats sont assemblés en suivant les règles de l'imputation multiple. / Imatinib in the treatment of chronic myeloid leukemia is a success of targeted therapy in oncology. The aim of this therapy is to block the biochemical processes leading to disease development. This strategy results in a reduction of the risk of disease progression and allows patients to avoid extensive and hazardous treatments such as hematologic stem cell transplantation.However, even if imatinib efficacy has been demonstrated in a clinical setting, a significant part of patients do not achieve suitable levels of molecular response. The objective of this thesis, is to test the hypothesis of a correlation between polymorphisms of genes implied in drug absorption an metabolism and the molecular response in chronic myeloid leukemia in chronic phase treated by imatinib.In order to evaluate patients molecular response, blood biomarker assessments are performed every 3 months. This type of follow up produces interval censored data. As patients remain at risk of disease progression, or may interrupt their treatments due to poor tolerance, the response of interest may not be observable in a given setting. This situation produces interval censored competing risks data.To properly handle such data, we propose a multiple imputation based method.The main idea is to convert interval censored data into multiple sets of potentially right censored data that are then analysed using multiple imputation rules.

Hintergrund und Fragestellung: Seit der Zulassung des Tyrosinkinase-Inhibitors (TKI) Imatinib im Jahre 2001 hat sich die Therapie der chronisch myeloischen Leukämie (CML) grundlegend verändert. Imatinib inhibiert die konstitutiv aktive Tyrosinkinase BCR-ABL, welche die verstärkte Proliferation der leukämischen Zellen und die Entwicklung der CML bedingt. Das sehr gute klinische Ansprechen auf eine Imatinib-Behandlung resultierte in einer beschleunigten Zulassung dieses TKI auch bei pädiatrischen Patienten im Jahre 2003. Aufgrund von Punktmutationen und/oder strukturellen Änderungen innerhalb des BCR-ABL Fusionsproteins können sich Resistenzen gegenüber Imatinib entwickeln. Deshalb wurden Zweit- und Drittgenerations TKI wie Dasatinib und Bosutinib entwickelt. Imatinib wirkt nicht hoch spezifisch und hemmt neben BCR-ABL auch weitere Tyrosinkinasen, wie z.B. c-KIT, PDGF-R und c-FMS, welche am Knochenstoffwechsel beteiligt sind. Die Stimulation des Rezeptors c-FMS bewirkt die Differenzierung monozytärer Vorläuferzellen in knochenabbauende Osteoklasten. Zusätzlich unterliegt die Entwicklung der knochenaufbauenden Osteoblasten spezifischen Signalkaskaden an denen PDGF-R und c-Abl beteiligt sind. Als Nebenwirkung einer TKI-Therapie beeinträchtigt die Inhibition dieser Signaltransduktionswege somit das Knochen-“Remodelling“, indem die Entwicklung und funktionelle Aktivität von Osteoklasten reduziert wird. Gleichzeitig wird die Aktivität von Osteoblasten gestärkt, aber deren Proliferation inhibiert. Diese Dysbalance von Knochenaufbau und -abbau mit gestörter Kalziumhomöostase bedingt bei erwachsenen CML-Patienten veränderte endokrinologische Parameter des Kalziumhaushaltes, eine vermehrte Knochenmineralisation und eine erhöhte trabekuläre Knochendichte. Dagegen wurden bei pädiatrischen CML-Patienten unter Imatinib-Therapie Längenwachstumsstörungen beobachtet, welche bezüglich des Wirkmechanismuses von Imatinib auf den wachsenden Knochen bis heute noch nicht im Detail geklärt sind. Spekulativ ist auch, ob Zweit- und Drittgenerations-TKI ebenso wie Imatinib den Knochenstoffwechsel bei pädiatrischen Patienten stören. Angelehnt an ein erfolgreiches Applikationsschema bei erwachsenen CML-Patienten steht zusätzlich die Frage im Raum, ob eine intermittierende Gabe von TKIs (einen Monat Therapie, einen Monat Pause) eine Minderung der Nebenwirkung auf den Knochen bewirken könnte, ohne die Wirkung auf die CML-Behandlung zu beeinträchtigen. Vor diesem Hintergrund wurde ein Nagermodel etabliert, um Nebenwirkungen auf den Knochenstoffwechsel unter TKI-Exposition zu analysieren. Junge, wachsende Ratten wurden hierzu vom präpubertären Alter bis zur Adoleszenz kontinuierlich oder intermittierend mit den TKIs Imatinib, Dasatinib und Bosutinib exponiert und die Wirkung auf das wachsende Skelettsystem untersucht. Methoden: 4 Wochen alte männliche Wistar Ratten wurden über einen Zeitraum von 10 Wochen chronisch mit jeweils einem der drei im Trinkwasser gelösten TKIs exponiert. Neben einer unbehandelten Kontrollkohorte erhielt eine Gruppe jeweils eine Standarddosis und eine hohe Dosis (entsprechend der doppelten Standarddosis) des entsprechenden TKIs kontinuierlich. Eine weitere Gruppe erhielt die hohe Dosis intermittierend (an drei aufeinanderfolgenden Tagen TKI, danach vier Tage nur Wasser). Die Konzentrationen im Trinkwasser betrugen für Imatinib 1 mM und 2 mM und für Dasatinib und Bosutinib jeweils 50 µM und 100 µM. Nach zweiwöchiger (präpubertär), vierwöchiger (pubertäres Stadium) und zehnwöchiger Exposition (postpubertär) wurden die Tiere aller Gruppen nekropsiert und Röhrenknochen, Lendenwirbel und Blut asserviert. Zur Beurteilung des Knochenmetabolismus wurden folgende Parameter erhoben: Knochenlängen, Knochendichten mittels pQCT, trabekuläre Strukturen mittels µCT, Knochenfestigkeit mittels des 3-Punkt-Biege-Test und endokrinologische Parameter im Serum mittels ELISA. Zusätzlich wurde der jeweilige TKI Serum-Spiegel bestimmt. Ergebnisse: Die Gewichtsentwicklung, körperliche Entwicklung und das Sozialverhalten zeigten keine Unterschiede beim Vergleich von Kontrollkohorten mit exponierten Tieren. Die kontinuierliche Exposition mit Imatinib und Dasatinib bewirkte dosisabhängig eine Reduktion der Knochenlängen der Femura und der Tibiae. Bosutinib zeigte diesen Effekt nicht. Die intermittierende Exposition mit hoher Dosis resultierte in einer Knochenlängenreduktion, welche exakt dem Effekt der Standarddosis entsprach. Weiterhin resultierte aus der Exposition mit Imatinib oder Dasatinib eine Verminderung der trabekulären Knochendichten der Femura und Tibiae im präpubertären Stadium. Ratten, welche hoch dosiert Imatinib erhielten, zeigten diese Reduktion ebenfalls im pubertären Stadium, nicht jedoch unter Dasatinib- und Bosutinib-Exposition. Postpubertär unterschieden sich die trabekulären Dichten von Femura und Tibiae der exponierten Gruppen nicht von den Kontrollkohorten. Auf die kortikale Knochendichte und die kortikale Dicke dieser Röhrenknochen zeigte sich kein messbarer Effekt der TKI. Dennoch trat - nur nach Exposition der hohen Imatinibdosis - eine signifikant verminderte femorale Bruchfestigkeit postpubertär auf. Am Lendenwirbelkörper war pubertär und postpubertär die Höhe unter Imatinib-Exposition vermindert, während die Gesamt- und kortikale Knochendichte präpubertär erhöht war bei tendenziell erniedrigter trabekulärer Knochendichte. Die kortikale Dicke wurde durch alle TKI nicht beeinflusst. Dasatinib und Bosutinib bewirkten keinen Effekt auf die Wirbelhöhe, aber eine tendenzielle Minderung der trabekulären Knochendichte. Der serologisch erfassbare Knochenresorptionsmarker „tatrate resistant acidic phosphatase“ (TRAP) war unter kontinuierlicher Exposition mit hoher Dosis von Imatinib zu allen Zeitpunkten erniedrigt. Postpubertär zeigte sich dieser Effekt auch unter Standard- und Hochdosis von Bosutinib. Der Knochenformationsmarker Osteocalcin war unter Imatinib bei allen Kohorten zu allen Analysezeitpunkten erniedrigt, während Dasatinib und Bosutinib keinen Effekt auf diesen Parameter zeigten. Die erfassten Serum-Hormonparameter (Wachstumshormon, Parathormon) lagen unter der Exposition mit Imatinib als erhöhte Wachstumshormonspiegel pubertär und als verminderte Parathormonspiegel prä- und pubertär vor. Unter der Exposition mit Dasatinib kam es ebenfalls pubertär zu einer Erhöhung der Wachstumshormonspiegel und präpubertär zu einer tendenziellen Erhöhung der Parathormonspiegel. Postpubertär normalisierten sich beide Parameter unter der Exposition mit Imatinib und Dasatinib wieder. Unter Bosutinib konnte nur postpubertär erniedrigte Parathormonspiegel ermittelt werden. Eine intermittierende TKI-Exposition resultierte in einem Aufholwachstum und einer teilweise Normalisierung der knochenspezifischen Serumparameter. Als wichtige unerwartete Nebenwirkung zeigte sich unter Langzeitexposition mit Imatinib und Dasatinib eine Zunahme des Herzgewichtes. Unter Imatinib resultierten daraus keine klinischen Auffälligkeiten, während unter Dasatinib eine Herzinsuffizienz zum Tod eines Tieres führte. Bosutinib zeigte keine weiteren makropathologisch erfassbaren Nebenwirkungen. Bis heute sind keine kardialen Nebenwirkungen bei pädiatrischen Patienten nach mehrjähriger TKI-Therapie publiziert. Schlussfolgerung: Das etablierte juvenile Nagertiermodell ist gut geeignet, um die Nebenwirkungen einer Langzeitexposition von TKI auf den wachsenden Knochen zu erfassen. Bei Kindern und Adoleszenten klinisch beschriebene Wachstumsretardierungen unter Imatinib ließen sich zweifelsfrei bei Ratten verifizieren. Bei fehlenden klinischen Daten von Kindern zu Dasatinib präjudiziert das Modell, dass Dasatinib so wie Imatinib den gleichen, Bosutinib hingegen kaum einen Effekt auf den Knochen ausübt. Eine intermittierende Gabe der TKI scheint die Nebenwirkungen auf den Knochen abzumildern und könnte eine neue Möglichkeit der TKI-Therapie für pädiatrische Patienten darstellen. Aus dem Tiermodell der Langzeit-exponierten juvenilen Ratte lässt sich ableiten, dass beim wachsenden Kind unter jahrelanger TKI-Therapie klinisch sorgfältig der Knochenstoffwechsel und das Längenwachstum überwacht und unter Dasatinib zusätzlich kardiale Nebenwirkungen beachten werden sollten.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung / Background: Since its approval in 2001 the tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib has revolutionized the therapy of chronic myeloid leukaemia (CML). Imatinib inhibits the constitutively active tyrosine kinase (TK) BCR-ABL causing the increased proliferation of the leukemic cells and the progress of CML. According to improved survival rates imatinib has been licensed as frontline therapy also for paediatric CML in 2003. However, due to point mutations or structural changes within the BCR-ABL fusion protein resistance to imatinib occurs. Therefore 2nd and 3rd generation TKI like dasatinib and bosutinib have been developed. Beside BCR-ABL, Imatinib exerts also off-target effects on further TKs like c-KIT, PDGF-R, c-FMS which are involved in bone metabolism. Stimulation of the receptor c-FMS leads to the differentiation of monocytic progenitors to bone resorbing osteoclasts. In addition, the development of bone forming osteoblasts underlies specific signalling cascades involving PDGF-R and c-Abl. As a side effect of TKI therapy these specific signalling cascades are inhibited impairing bone remodelling by reducing the development and functional activity of osteoclasts. Simultaneously osteoblasts’ differentiation is promoted while their proliferation is inhibited. This dysbalance of bone formation and resorption results in altered endocrinological serum markers of the calcium homeostasis, increased bone mineralization, and increased trabecular bone density in adult CML patients. In contrast paediatric CML patients show longitudinal growth retardations under imatinib therapy, however, the detailed action of imatinib on the growing bone is not clarified yet. Additionally, it is unclear if 2nd and 3rd generation TKI will also disturb bone metabolism in paediatric CML patients. Based on an effective treatment strategy in adult CML patients, it is also questioned if intermittent TKI treatment (one month “on”, one month “off”) could minimise side effects on the bone without impairing CML therapy. On this background a rodent model was established to study side effects of TKI treatment on bone metabolism. Juvenile growing rats where exposed from prepubertal age till adolescence continuously or intermittently to imatinib, dasatinib, and bosutinib and the effects on the growing skeleton were analysed. Methods: Four weeks old male Wistar rats were chronically exposed to varying concentrations of one of the three TKIs via the drinking water for 10 weeks. Besides untreated controls a standard dosage group and a high dosage group (equalling the twofold standard dose) received every TKI continuously, while an additional group received the high dosage TKI in an intermittent fashion (3 days per week: “on” TKI; 4 days water without TKI). The concentrations applied were 1 mM and 2 mM for imatinib and 50 µM and 100 µM each for dasatinib and bosutinib, respectively. After 2 weeks (prepubertal), 4 weeks (pubertal stage), and 10 weeks (postpubertal) of exposure, respectively, animals were sacrificed and long bones, lumbar vertebra and blood were isolated. To evaluate bone metabolism the following parameters were analysed: bone length, bone mineral density (BMD) by pQCT, trabecular structure by µCT, bone strength by 3-point bending test, and endocrinological parameters by ELISA. Additionally, serum levels of TKIs were investigated. Results: In comparison to controls no alterations of exposed animals’ bodyweight, overall development and social behaviour were observed. Continuous exposure of imatinib and dasatinib led dose dependently to reduced femoral and tibial length. No such effect was observed under bosutinib. Intermitted exposure of high-dose TKIs resulted in reduced effects on femoral and tibial length identical to the effect observed in groups receiving just standard dose. Furthermore, exposure of imatinib and dasatinib lowered femoral and tibial trabecular BMD prepubertally. Rats receiving high dose imatinib showed reduced femoral and tibial trabecular BMD at pubertal stage, while this effect was not observed under dasatinib and bosutinib exposure. Postpubertally, femoral and tibial trabecular BMD of all exposed groups did not differ from controls. Femoral and tibial cortical BMD and cortical thickness were not affected by TKI exposure. However, under high dose imatinib exposure femoral mechanical breaking strength was reduced postpubertally. In vertebra the height was reduced under imatinib exposure pubertally and postpubertally, while the total and cortical BMD were increased prepubertally and trabecular BMD tended to be reduced. Cortical thickness was not affected by any TKI tested. Dasatinib and bosutinib exhibited no effect on the height of the vertebra but trabecular BMD tended to be reduced. The serum bone resorption marker ‘tartrate resistant acidic phosphatase’ (TRAP) was found reduced under continuous exposure of high dose of imatinib at all time points tested. Postpubertally, the same effect was detected after standard and high dosage of bosutinib. The bone formation marker osteocalcin was reduced in all groups and at all time points tested under imatinib exposure, whereas no such effect was observed for dasatinib and bosutinib. Serum bone related hormone markers (growth hormone (GH) and parathyroid hormone (PTH)) revealed under imatinib exposure increased GH levels pubertally whereas PTH was reduced pre- und pubertally. During dasatinib exposure GH levels were elevated pubertally and PTH levels were increased prepubertally. Postpubertally, both parameters normalised again under imatinib and dasatinib exposure. During bosutinib exposure reduced PTH levels were detected postpubertally only. Intermitted TKI exposure resulted in catch-up growth and partial normalisation of bone specific serum parameters. As major unexpected side effect during exposure increasing heart weights could be observed under long-time imatinib and dasatinib exposure. No clinical changes were observed under imatinib, whereas dasatinib led to cardiac insufficiency leading to death of one animal. Bosutinib showed no additional macrospathologic assessable side effects. To date no cardiac side effects were published in paediatric patients under prolonged TKI therapy. Conclusion: The established juvenile rat model is appropriate to examine side effects of long-term TKI exposure on the growing bone. Published longitudinal growth retardation in children and adolescents under imatinib treatment could be unequivocally mimicked in this rat model. Due to not yet available clinical experience with dasatinib in paediatric patients, this model predicts that dasatinib alters bone metabolism like imatinib whereas bosutinib shows less detectable effects. Intermitted TKI treatment may reduce side effects on the growing bone and therefore could represent a new opportunity of TKI therapy for paediatric patients. Summing up, TKI long-term exposure in this juvenile rat model challenges physicians to diligently monitor bone metabolism in not outgrown paediatric patients during long-term TKI treatment and additionally assess cardiac side effects under dasatinib exposure.:I. Abkürzungsverzeichnis II. Abbildungsverzeichnis III. Tabellenverzeichnis IV. Tabellenverzeichnis des Anhangs 1. Einleitung 1.1 Die chronisch myeloische Leukämie 1.1.1 Pathogenese 1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der chronisch myeloischen Leukämie 1.1.3 Die chronisch myeloische Leukämie im Erwachsenenalter 1.1.4 Die chronisch myeloische Leukämie im Kindes- und Jugendalter 1.1.5 Entwicklung der Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2 Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie 1.2.1 Wirkmechanismus von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.2.2 Tyrosinkinase-Inhibitoren der nächsten Generation 1.2.3 „Off-target“ Effekte von Tyrosinkinase-Inhibitoren 1.3 Das menschliche Skelett 1.3.1 „Remodelling“ des Knochens 1.3.2 Knochenstoffwechselparameter 1.3.2.1 Anabole Parameter des Knochenaufbaus Osteocalcin und Amino-terminales-Propeptid des Typ-I-Kollagens 1.3.2.2 Katabole Parameter des Knochenabbaus Carboxy-terminales Telopeptid des Typ-I-Kollagens und Tatrat-resistente saure Phosphatase 1.3.2.3 Endokrine Parameter des Knochenstoffwechsels Wachstumshormon und Parathormon 1.4 Einfluss von Tyrosinkinase Inhibitoren auf das Knochen-„Remodelling“ 2. Zielsetzung und Fragestellung 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Versuchstiere 3.1.2 Tierversuchsaufbau 3.1.3 Herstellung der Trinklösungen 3.2 Methoden 3.2.1 Lösungen und Arbeitsmaterialien 3.2.2 Geräte 3.2.3 Knochen-/Organpräparation und Verwendung 3.2.4 Serumgewinnung 3.2.5 Serumspiegelbestimmung der Tyrosinkinase-Inhibitoren 3.2.5.1 Imatinib 3.2.5.2 Dasatinib 3.2.5.3 Bosutinib 3.2.6 Bestimmungen von Knochenstoffwechselmarkern im Serum 3.2.7 Bestimmungen der Längen der Röhrenknochen und der Höhen der Lendenwirbelkörper 3.2.8 Computertomographisch gestützte Untersuchungen der Knochen 3.2.8.1 Knochendichtemessungen der unentkalkten Knochen mittels.. peripherer quantitativer Computertomographie 3.2.8.2 Messungen der unentkalkten Knochen mittels mikro-Computertomographie 3.2.9 Biomechanik am unentkalkten Knochen 3.2.10 Statistik 4. Ergebnisse 4.1 Entwicklung und Sozialverhalten der Versuchstiere unter Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.2 Todesfälle unter 10-wöchiger Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.3 Gewichtsentwicklungen der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.4 Trinkverhalten der Versuchstiere während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.5 Aufgenommene Mengen an Tyrosinkinase-Inhibitoren und Serumspiegel 4.6 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 4.6.1 Knochenlängen der Femura und Tibiae 4.6.2 Breiten der Epiphysenfugen der Femura und Tibiae 4.6.3 Dichte und Geometrie der unentkalkten Femura und Tibiae 4.6.4 Trabekelstrukturanalyse der unentkalkten Femura 4.6.5 Biomechanik der unentkalkten Femura 4.7 Auswirkungen einer chronischen und intermittierenden Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel L2 4.7.1 Höhen der Lendenwirbelkörper 4.7.2 Dichte und Geometrie der unentkalkten Lendenwirbelkörper 4.8 Serumparameter des Knochenstoffwechsels während der Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 4.8.1 Parameter des Knochenaufbaus 4.8.2 Parameter des Knochenabbaus 4.9 Längenwachstumsbezogene Serumparameter des Hormonhaushaltes 4.10 Weitere beobachtete Nebenwirkungen während einer 10-wöchigen Exposition mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5. Diskussion 5.1 Das Tiermodell der Ratte 5.2 Chronische Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren über das Trinkwasser..… 5.2.1 Trinkmengen und Entwicklungen der Versuchstiere 5.2.2 Zugeführte Dosis an Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.2.3 Serumkonzentrationen der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.3 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Röhrenknochen 5.3.1 Längen der Röhrenknochen und Breiten der Epiphysenfugen 5.3.2 Knochendichten und trabekuläre Strukturen der Röhrenknochen 5.3.3 Biomechanik der Femura 5.4 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf die Lendenwirbel 5.5 Einfluss der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren auf den Knochenstoffwechsel 5.5.1 Veränderungen bei der Knochenresorption 5.5.2 Veränderungen bei der Knochenformation 5.5.3 Spezifische Effekte der Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.6 Hormonelle Regulationen des Knochen-„Remodelling“ während der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.7 Nicht skelettbezogene Nebenwirkungen der Expositionen mit Tyrosinkinase-Inhibitoren 5.8 Klinischer Bezug zur Therapie der chronisch myeloischen Leukämie im Kindes-und Jugendalter 6. Zusammenfassung 7. Literaturverzeichnis 8. Anhang 9. Danksagung

Les bisphosphonates (BPs) sont des outils thérapeutiques de choix pour le traitement de l'ostéolyse maligne. Toutefois, ils n'ont pas d'effet anti-tumoral et n'améliorent pas la survie des patients. C'est pourquoi nous avons testé leur efficacité en association avec de nouveaux agents pharmacologiques ciblant les cellules responsables de la résorption osseuse, les ostéoclastes.<br />Nous avons ainsi démontré qu'un inhibiteur de cathepsine K (CKI) réduit l'activité des ostéoclastes in vitro, et de ce fait, le développement des métastases osseuses in vivo en agissant indirectement sur les cellules tumorales. De plus, un inhibiteur de tyrosine kinase (Imatinib) ralentit la formation et la progression des métastases osseuses in vivo, en ayant une activité anti-ostéoclastique et anti-tumorale. Toutefois, bien qu'une polythérapie puisse favoriser une synergie d'action entre les médicaments, nos résultats montrent que dans nos conditions d'utilisation, aucune synergie significative entre le CKI, l'Imatinib et le BP zolédronate n'a lieu.

Nos últimos anos têm crescido cada vez mais o número de pesquisas envolvendo nanotecnologia para obtenção de medicamentos com liberação controlada, pois esses sistemas podem: proteger o fármaco de incompatibilidades tanto biológicas quanto físico-químicas assim como controlar a biodisponibilidade do fármaco. Embora com todas essas vantagens não existem métodos in vitro realmente capazes de prever com precisão a liberação dos fármacos por esses sistemas, por esse motivo, é muito importante o desenvolvimento de métodos de liberação in vitro para determinar a cinética de liberação desses sistemas.O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar os métodos de eletroforese capilar (CE) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para determinar a eficiência de encapsulação do fármaco imatinibe em nanopartículaspreviamente elaboradas e caracterizadas, assim como estudar sua liberação in vitro por CE. As nanopartículas foramdesenvolvidas pelo método de nanoprecipitaçãoe caracterizadas quanto ao tamanho, potencial zeta, morfologia e eficiência de encapsulação. A eletroforese capilar é uma técnica alternativa muito promissora em relação ao HPLC devido ao seu baixo custo, menor tempo de corrida e menos poluente ao meio ambiente. Os métodos de quantificação por CE e HPLCforam desenvolvidose validadossegundo as diretrizes do ICH, Farmacopeia Americana e ANVISA, permitindo desenvolver um estudo de liberação.As nanoesferas desenvolvidas apresentaram diâmetro médio próximo a 150nm, com índice de polidispersão menor que 0,1 e aproximadamente 90% de eficiência de encapsulação. Ambos métodos se mostraram lineares com coeficientes de determinação superiores a 0,99, os métodos se mostraram precisos (%DPR< 2), exatos(101,0±4,2% e 98,0±2,5% para HPLC e CE, respectivamente)e seletivos.O método de CE permitiu desenvolver um método de estudo de liberação independente das membranas de diálise. / In recent years, there has been a growing number of researches involving nanotechnology to obtain controlled release drugs, these systems can: protect the drug against biological and physico-chemical incompatibilities; controlling the bioavailability of the drug. Although with all these advantages there are no in vitro methods really capable of accurately predicting drugs release by such systems, therefore, the development of in vitro release methods to determine the release kinetics of such systems is very important. The objective of the present work was to develop and validate capillary electrophoresis (CE) and HPLC methods to determine the encapsulation efficiency of the imatinib drug in previously elaborated and characterized nanoparticles, as well as to study its release in vitro by CE method. The nanoparticles were synthesized using the nanoprecipitation method and characterized by size, zeta potential, morphology and encapsulation efficiency. Capillary electrophoresis is a very promising alternative to HPLC because of its low cost, less runtime and less polluting environment. The CE and HPLC methodswere developed and validated according ICH, American Pharmacopoeia and ANVISA guidelines.Developed nanospheres had an average diameter close to 150nm, with polydispersity index less than 0.1 and approximately 90% encapsulation efficiency. Both methods were linear with determination coefficients higher than 0.99, the methods were precise (%RSD < 2), accurate (101.0±4,2% and 98.0±2,5% for HPLC and CE, respectively) and selective. Capillary electrophoresis method allowed to develop a drug release study independent of dialysis membranes.

Bakgrund: Vid kronisk myeolid leukemi (KML) överproducerar blodstamceller omogna granulocyter som kan öka risken för infektioner, anemi och lätta blödningar. Ifall sjukdomen inte åtgärdas i tidigt skede så kan cancercellerna konkrurera ut friska blodceller vilket kan leda till ett livshotande tillstånd. KML drabbar främst vuxna över 55 år. Orsaken till KML är nästan alltid en somatisk mutation i blodcellerna som leder till förändring i karyotypen, den abnormala kromosomen kallas för Philadelphia kromosomen. De olika behandlingalternativ som finns mot KML inkluderar kemoterapi (låg dos/hög dos med stamcellstransplantation), interferon alfa, donator lymfocytinfusion och tyrosinkinasinhibitor (TKI). TKI är standardbehandling vid KML och TKIs inlkluderar imatinib, dasatinib, nilotinib, bosutinib och ponatinib. Studier har visat att TKI administrerat på friska råttor och möss har en teratogen effekt. Syfte: Syftet med arbetet var att utvärdera risker och fördelar vid behandling av kronisk myeloid leukemi med tyrosinkinasinhibitor i samband med graviditet. Metod: Arbetet är en litteraturstudie baserat på 13 caserapporter därav 4 studier om imatinib, 4 om nilotinib, 4 om dasatinib och 1 studie om imatinib, nilotinib och dasatinib. Bosutinib och ponatinib exkluderades eftersom det fanns inga studier om exponering av dessa läkemedel under graviditet. Resultat: Från studierna om imatinib var det totalt 23 av 163 patienter som fick missfall och 14 av 90 födsel slutade med foster abnormiteter. Totalt hade 49 fall rapporterats om exponering med nilotinib under graviditet därav 46 fall resulterade i normal födsel och 3 spädbarn fick fetala abnormiteter som resulterade till dödlighet. Av de fyra fall som rapporterades om Dasatinib var det ett som slutade med abort efter vecka 17 på grund av fostrets dåliga perinatala prognos. Alla patienter behandlades inte med TKIs under graviditeten. Vissa patienter hade kombinationer av läkemedel. Slutsats: Det finns fortfarande inte bekräftade risker med TKI behandling i samband med graviditet då statistiskt underlag saknas. Fördelen med att behandlas med TKI under graviditet är att risken för återfall och försämrad sjukdomprognos förminskas. Läkaren ska alltid diskutera med patienten om eventuella risker och möjligheter. Behandling för varje patient individualiseras utifrån patienens önskemål. / Background Chronic myeloid leukemia (CML) is a type of leukemia that affects bone marrow and blood cells. In CML, the blood stem cells produce an excessive number of immature granulocytes which leads to a high count of white blood cells in patients. Consequently, the risk of acquiring infections, anemia and hemorrhage, is increased. If not successfully treated the leukemia cells will eventually crowd out platelets and healthy blood cells and ultimately lead to death. Generally, CML occurs in adults aged 55 years or older. The cause of CML is in most cases a somatic mutation that is referred to as the Philadelphia chromosome. There are various treatments for CML, I.e., chemotherapy, interferons-alpha, high-dose chemotherapy combined with a stem cell transplantation, donor lymphocyte infusion (DLI), and tyrosine kinase inhibitors (TKI). TKI are the standard treatment for CML. There are several types of TKI, namely: Imatinib, nasatinib, nilotinib, bosutinib and ponatinib. Although considered the most effective treatment for CML, there are several animal studies indicating that TKI has a teratogenic effect. Purpose The objective of this study was to evaluate the risks and benefits of TKI treatment in connection with pregnancy. Method  A literature review based on 13 case reports, among them four reports about imatinib, four reports about nilotinib, four reports about dasatinib and one report describing several patients treated with imatinib, nilotinib and dasatinib. Studies about bosutinib and ponatinib are excluded from this study due to the lack of scientific research regarding their impact on pregnant women. Result The studies about Imatinib showed that 23 of 163 patients had miscarriage. Furthermore, 14 of the 90 live births resulted in foster abnormalities. There were totally 49 cases in which Nilotinib was administered to pregnant women. In 46 cases the patients gave birth to healthy children. However, in three cases the fetuses were abnormal and in one of these cases the child was stillborn. Moreover, there were four case studies in which the patients were treated with dasatinib. In one case the treatment lead to an abortion after week 17 due do the fetus poor perinatal prognosis. All patients were not treated with TKIs during pregnancy. Some patients had combinations of drugs.  Conclusion  There are still no confirmed risks with TKI treatment in connection with pregnancy because statistical evidence is missing. The benefit of being treated with TKI during pregnancy is that the risk of relapse and impaired disease prognosis is reduced. The doctor should always discuss with the patient about risks and opportunities. Treatment for each patiens is individualized based on the patients wishes.