Le syndrome du X fragile est la première cause monogénique de déficience intellectuelle héréditaire affectant un garçon sur 5161 et une fille sur 6000. La maladie résulte de mutations dynamiques dans le gène FMR1 (expansion de trinucléotides CGG et méthylation du gène) conduisant à l'absence ou à la diminution importante d'expression de la protéine FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein).Le syndrome du X fragile est difficile à identifier étant donné la grande variabilité des manifestations cliniques entre les individus. La déficience intellectuelle est variable et elle est moins profonde chez les femmes et les individus mosaïques.Le phénotype atténué chez ces patients serait dû à la présence d'un allèle fonctionnel permettant la synthèse de la protéine FMRP dans une portion des cellules. Ainsi, il est suggéré qu'une relation existerait entre la quantité de synthèse de FMRP au cerveau et le phénotype cognitif des individus avec le syndrome du X fragile.Le but de notre projet de recherche est de développer un test diagnostique pour le syndrome du X fragile, basé sur la mesure quantitative de la protéine FMRP dans les plaquettes sanguines. D'abord, les niveaux de FMRP ont été mesurés dans une population d'individus sans déficience intellectuelle d'âge et de sexe différents. Nos résultats montrent que les niveaux mesurés suivent une distribution normale et ne seraient pas influencés par le sexe ou l'âge. Ensuite, ces niveaux de FMRP ont été comparés avec ceux mesurés chez les individus diagnostiqués avec le syndrome du X fragile. Comme attendu, les niveaux de FMRP des individus avec le X fragile sont inférieurs à ceux des contrôles et permettent d'établir une valeur seuil pour le diagnostic de la maladie. En combinant les résultats obtenus chez les femmes et hommes avec la maladie, une relation positive entre FMRP, le quotient intellectuel et le comportement adaptatif a été observée. Dans le groupe des femmes avec le syndrome du X fragile, la relation entre FMRP et le comportement adaptatif demeure statistiquement significative. L'approche que nous proposons permet non seulement de détecter les cas de syndrome du X fragile, mais également de donner des informations prédictives des capacités cognitives des individus atteints. Ce nouvel outil diagnostique pourrait avoir des impacts significatifs dans l'investigation et la prise en charge des individus avec le syndrome du X fragile.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane. / The L-type calcium channel, Cav1.2, plays an important role in the excitation-contraction coupling of the ventricular myocytes. It has been shown that the alternative splicing of Cavα1.2 subunit could lead to a truncated protein in the C-terminus at exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). Many groups have studied deletions in the C-terminus (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). The currents, measured in the whole cell configuration, were significantly higher with the full-length channel. We chose to test some of these deletions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) in the presence or absence of the Cavβ3 auxiliary subunit which is likely to interact with the C-terminus of the Cavα1.2 subunit through its SH3 domain (Lao, Kobrinsky et al. 2008). The truncated Cavα1.2 subunit, expressed in Xenopus Oocytes, showed macroscopic currents that were greater than those of the full length channel in presence of the Cavβ3 subunit. In addition, the truncated Cavα1.2 subunits displayed currents in the absence of the Cavβ3 subunit in contrast with the Cavα1.2 full length subunit. To investigate whether the larger macroscopic currents resulted in an increase in the number of Cavα1.2 subunits at the plasma membrane, we chose the FACS (« Fluorescence Activated Cell Sorting ») method. An HA-tag was inserted in an extracellular region of the Cavα1.2 subunit and a FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») coupled anti-HA antibody was used to measure fluorescence. Our results showed that the Cavα1.2-HA subunit of L- type channel is expressed at the plasma membrane in the presence of the Cavβ3 subunit whereas the Cavα1.2-HA subunit is slightly or not expressed at the plasma membrane in its absence. The same results were obtained for the three C-terminal deletions tested under the same conditions (CaVα1.2-HA ΔC1935, CaVα1.2-HA ΔC1856 and CaVα1.2-HA ΔC1733). Taken together, these results suggest that the increased macroscopic currents observed after a partial deletion of the C-terminus is not caused by an increased number of Cavα1.2 proteins expressed at the plasma membrane. Keywords:

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane. / The L-type calcium channel, Cav1.2, plays an important role in the excitation-contraction coupling of the ventricular myocytes. It has been shown that the alternative splicing of Cavα1.2 subunit could lead to a truncated protein in the C-terminus at exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). Many groups have studied deletions in the C-terminus (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). The currents, measured in the whole cell configuration, were significantly higher with the full-length channel. We chose to test some of these deletions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) in the presence or absence of the Cavβ3 auxiliary subunit which is likely to interact with the C-terminus of the Cavα1.2 subunit through its SH3 domain (Lao, Kobrinsky et al. 2008). The truncated Cavα1.2 subunit, expressed in Xenopus Oocytes, showed macroscopic currents that were greater than those of the full length channel in presence of the Cavβ3 subunit. In addition, the truncated Cavα1.2 subunits displayed currents in the absence of the Cavβ3 subunit in contrast with the Cavα1.2 full length subunit. To investigate whether the larger macroscopic currents resulted in an increase in the number of Cavα1.2 subunits at the plasma membrane, we chose the FACS (« Fluorescence Activated Cell Sorting ») method. An HA-tag was inserted in an extracellular region of the Cavα1.2 subunit and a FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») coupled anti-HA antibody was used to measure fluorescence. Our results showed that the Cavα1.2-HA subunit of L- type channel is expressed at the plasma membrane in the presence of the Cavβ3 subunit whereas the Cavα1.2-HA subunit is slightly or not expressed at the plasma membrane in its absence. The same results were obtained for the three C-terminal deletions tested under the same conditions (CaVα1.2-HA ΔC1935, CaVα1.2-HA ΔC1856 and CaVα1.2-HA ΔC1733). Taken together, these results suggest that the increased macroscopic currents observed after a partial deletion of the C-terminus is not caused by an increased number of Cavα1.2 proteins expressed at the plasma membrane. Keywords:

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