Nous avons développé un algorithme de prédiction des résidus impliqués dans le noyau du repliement par des approches couplées. La prédiction des Most Interacting Residues (MIR) est associée aux méthodes d'analyse structurale par fragments, les Tightened End Fragments (TEF) et d'alignement multiple. Cet algorithme a été développé sur une banque de protéines à faible identité en séquence appartenant à une famille bien documentée, les immunoglobulines. Les résultats obtenus sont comparés à ceux produits par d'autres techniques similaires, mais aussi à ceux provenant d'études expérimentales. Comme résultat nous avons pu voir qu'il existe une bonne corrélation entre les résidus prédits par notre méthode et les données expérimentales. Dans une deuxième partie, nous avons généré une banque de multimères biologiques dans le but de développer un outil de prédiction de la structure quaternaire. La banque est validée par le programme DiMoVo utilisant la représentation des protéines par tesselation de Voronoï. Afin d'analyser les modes d'interaction entre domaines, les différents complexes ont été découpés en fragments par la méthode des Tightened End Fragments. Nous avons développé un algorithme permettant d'inclure chaque fragment dans un cylindre, afin de pouvoir caractériser le fragment par une hauteur et un rayon. Ces fragments ont ensuite été classés sur ces critères structuraux et les interactions de différentes classes de fragments au sein des interfaces protéines-protéines ont été comptabilisées. On observe que les classes ne sont pas utilisées de façon homogène dans les interactions protéines-protéines.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) sont caractérisées par leur capacité unique de sécrétion massive d’interféron de type I (IFN-I) suite à la stimulation des Tolllike récepteurs (TLR) 7 et 9. Un rôle fondamental des pDCs a été démontré dans le lupus érythémateux systémique via la production d’IFN-I. Les pDC expriment le récepteur de forte affinité aux immunoglobulines de type E (IgE), FcεRI, impliqué dans la régulation négative de la sécrétion d’IFN-I. L’objectif de notre étude est d’explorer, dans le contexte lupique, les effets du traitement par les IgE sur les fonctions des pDC, particulièrement sur la production d’IFN-I. In vitro, le traitement des pDC par des IgE monoclonales permet la surexpression du FcεRI à leur surface et diminue le taux de transcrits des TLR7/9 et de l’IRF7. De plus, les pDC traitées par des IgE diminuent leur production d’IFN-I et l’expression de marqueurs de maturation, induites par leur stimulation par des ligands des TLR7/9 et des complexes immuns lupiques. En outre, ces pDC pré-traitées par des IgE induisent la différenciation de LT4 naïfs allogéniques en LT4 produisant de l’IL-10. In vivo, les patients lupiques en phase quiescente de la maladie présentent des taux plus élevés d’IgE totales comparés aux patients en phase active (indépendamment d’allergies et d’infestations parasitaires). Chez les patientslupiques, le taux d’IgE totales est inversement corrélé au taux d’anti-ADN et à l’activité de la maladie (SLEDAI). L’ensemble de nos résultats suggère un rôle protecteur des IgE dans le lupus à travers la modulation de la réponse inflammatoire des pDC. / Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are characterized by their unique ability to produce large amounts of type I interferon (IFN-I) upon Toll-like receptors (TLR) 7 and 9 triggering. A fundamental role for pDCs has been shown in systemic lupus erythematosus (SLE) through IFN-I production. pDCs express the high affinity Fc receptor for immunoglobulin E (IgE), FcεRI, involved in the negative regulation of IFN-I secretion. The objective of our study is to investigate, in the context of SLE, the effects of IgE treatment on pDCs functions, especially on IFN-I production. In vitro, monoclonal IgE treatment of pDCs upregulate their surface expression of FcεRI and decrease transcripts levels of TLR7/9 and IRF7. IgE-treated pDCs decrease IFN-α secretion and downregulate maturation markers expression induced by TLR7/9 and immune complexes triggering. Moreover, the coculture of IgE pretreated pDCs with allogeneic naive LT4 promotes their differentiation into IL-10-secreting cells. In vivo, patients with quiescent SLE have higher IgE levels than patients with active disease (independently of allergy or parasitic infection). In SLE patients, IgE levels are inversely correlated to anti-DNA antibodies and disease activity (SLEDAI). All together, our data suggest a protective role for IgE in SLE through the modulation of the inflammatory response by pDC.

Parmi les cinq isotypes d’anticorps présents chez l’Homme, les immunoglobulines A (IgA) prédominent dans les muqueuses. Les IgA sont produites dans le chorion sous forme majoritairement polymérique (pIgA) et sécrétées dans la lumière des muqueuses. Leur transport trans-épithélial est assuré par le récepteur aux immunoglobulines polymériques (pIgR), exprimé au pôle basal des épithéliums. Les pIgA ainsi sécrétées conservent le domaine extracellulaire du pIgR et sont appelées IgA sécrétoires (SIgA). Une fonction essentielle des SIgA intestinales est de maintenir microorganismes et antigènes alimentaires dans la lumière des muqueuses afin d’empêcher leur pénétration dans l'organisme. Néanmoins, la transcytose inverse des SIgA couplées à des bactéries a été décrite dans les plaques de Peyer où elle participe à la génération de la réponse immune contre ces bactéries. En outre, les travaux passés du laboratoire ont suggéré que le récepteur de la transferrine (CD71), surexprimé au pôle apical des entérocytes chez les patients cœliaques, interagit avec les SIgA couplées à des peptides de gliadines et permet leur transcytose inverse à travers l’épithélium intestinal. Ce travail de thèse a eu pour objectif de mieux caractériser l’interaction SIgA-CD71 dans les entérocytes humains. Dans un premier temps, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9 pour générer une lignée cellulaire intestinale humaine (Caco-2 TC7) dépourvue du récepteur CD71 (CD71KO). De manière inattendue, nous n’avons observé aucune altération de la fixation des SIgA sur les cellules Caco-2 CD71KO. Ce résultat nous a amenés à réévaluer le rôle de CD71 comme récepteur aux SIgA. Dans un second temps, nous avons vérifié et confirmé que les SIgA interagissent avec CD71, mais nous avons montré que cette interaction est indirecte. Nous avons ensuite criblé les récepteurs aux IgA déjà décrits dans la littérature et montré qu'aucun n'est responsable de la fixation des SIgA à la surface des cellules Caco-2 TC7. Ces résultats nous ont amenés à chercher le(s) autre(s) partenaire(s) du complexe SIgA-CD71. Par immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié les protéines Secretory Carrier Membrane Protein 3 (SCAMP3), B-Cell Receptor-Associated Protein 31 (BCAP31) et Histocompatibility minor 13 (HM13) comme membres du complexe SIgA-CD71. En nous appuyant à nouveau sur la technologie CRIPSR-Cas9, nous avons montré qu’aucun de ses partenaires n’interagit directement avec les SIgA. Néanmoins, nos résultats suggèrent que SCAMP3 est nécessaire à l’oligomérisation de surface des complexes de fixation des SIgA. Enfin, l’internalisation des SIgA n'est pas altérée par l’absence de chacun des partenaires du complexe, suggérant que leur rôle advient durant le transport trans-épithélial des SIgA. L’ensemble de nos travaux montre que les SIgA interagissent avec l'épithélium intestinal via un complexe protéique composé d'au moins cinq membres : CD71, SCAMP3, BCAP31, HM13 et le(s) récepteur(s) inconnu(s) aux SIgA. Ces résultats complètent les travaux antérieurs sur le rôle physiopathologique des SIgA dans la maladie cœliaque et contribuent à souligner la complexité des interactions entre IgA et entérocytes. Une question importante sera d’identifier le(s) récepteur(s) aux SIgA et de déterminer le rôle des partenaires identifiés dans la transcytose inverse des SIgA par l’entérocyte. / Among the five isotypes of antibodies found in Humans, immunoglobulins A (IgA) are the most abundant in the mucosae. In the lamina propria, IgA are produced mainly as polymeric IgA (pIgA) and then secreted in the lumen. In fact, pIgA are translocated across the epithelium via the polymeric immunoglobulin receptor (pIgR), which is expressed at the basolateral side of the epithelium. Once secreted in the lumen, pIgA retain the extracellular domain of the pIgR and are called secretory IgA (SIgA). One of the main functions of intestinal SIgA is to restrain microorganisms and dietary antigens in the lumen, therefore, preventing their uptake through the epithelial barrier. However, retrotranscytosis of SIgA conjugated to bacteria has been described in Peyer’s patches where it participates to immune response. Moreover, previous works from the laboratory have suggested that transferrin receptor (CD71), which is overexpressed at the apical side of enterocytes from coeliac patients, interacts with SIgA bound to gliadin peptides and allows their retrotranscytosis across the intestinal epithelium. This thesis work aimed to further characterize the interaction between SIgA and CD71 in human enterocytes. We, first, generated a human epithelial intestinal cell line (Caco-2 TC7) devoid of CD71 expression (CD71KO) using the CRISPR/Cas9 genome editing method. Unexpectedly, flow cytometry experiments did not reveal a significant reduction of SIgA binding at the cell surface of CD71KO cells. Overall, our results indicated that CD71-SIgA interaction is indirect and may occur via additional protein partners through the assembly of a multifactorial protein complex. Therefore, we screened IgA receptors already known in the literature and showed that all are dispensable for SIgA binding at the surface of Caco-2 TC7 cells. In the effort to identify partner(s) within SIgA-CD71 complex, we set out mass spectrometry-based immunoprecipitation proteomics experiments and identified secretory carrier membrane protein 3 (SCAMP3), B-cell receptor-associated protein 31 (BCAP31) and histocompatibility minor 13 (HM13) as members of SIgA-CD71 complex. By generating knockout cell lines with the CRISPR/Cas9 system, we showed that none of these partners directly interacts with SIgA. However, our results suggest that SCAMP3 is required for the oligomerization of SIgA complexes at cell surface. Finally, we did not find any role in SIgA internalization for the different members of the complex, suggesting that they may play a role later on during SIgA retrotranscytosis. In conclusion, our work shows that SIgA interact with the intestinal epithelium via a proteic complex composed of at least five members: CD71, SCAMP3, BCAP31, HM13 and one or more unknown SIgA receptor(s). These results complement the previous works on the pathophysiologic role of SIgA in coeliac disease and underline the highly complex interaction between IgA and enterocytes. An important point to address will be to identify SIgA receptor(s) and to determine the role of the four other identified partners in SIgA retrotranscytosis across the intestinal epithelium.

L’objectif de mon doctorat, réalisé dans le cadre d’une collaboration entre le laboratoire des protéines et nanotechnologies en sciences séparatives (institut Galien Paris-Sud) et le groupe Micro et Nano Système (institut d’électronique fondamentale) était d’étudier l’influence des monocouches autoassemblées, sur l’activité biologique du bio-récepteur dans une perspective de développement de biocapteur. Dans ce projet, nous avons choisi les organo-silanes qui peuvent se lier de manière covalente sur le silicium. Deux silanes (7-octenyl trichlorosilanes et le (3-aminopropyl)triethoxysilane) ont été étudiés, leur impact en terme de nature et de stabilité sur la fonctionnalité du bio-récepteur, des immunoglobulines G de souris, ont été évalué. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la fonctionnalité des anticorps greffés sur une mono couche auto-assemblée composée de 7-octenyltrichlorosilane (OTS) présentant à sa surface un groupement carboxylique. Une caractérisation spectroscopique par XPS et infra-rouge à transformé de Fourrier (FTIR) a tout d’abord été effectuée afin de vérifier la présence de ces groupements carboxyliques. L’homogénéité de la surface a été évaluée par AFM. Nous avons ensuite immobilisé ces anticorps, sur ces supports, de manière covalente et une étude topographique par AFM a été menée pour mesurer la répartition de ces anticorps. L’orientation des anticorps greffés a été évaluée à l’aide d’immuno-essais. Ensuite, nous avons comparé l’APTES, permettant l’obtention de plaques de silicium fonctionnalisé avec des groupements aminés à leur surface, avec l’OTS. Nous avons notamment comparé la capacité de capture des anticorps immobilisés sur ces deux types de silanes. Dans la dernière partie, l’impact du vieillissement d’un support immunologique préparé chimiquement en utilisant l’APTES a été évaluée sur le plan physico-chimique et biologique. / The aim of my PhD thesis, conducted as part of a collaboration between the laboratory of protein separation sciences and nanotechnology (Paris-Sud Galen Institute) and the Micro and Nano System (basic electronics institute) group was to study the influence of self-assembled monolayers on the biological activity of bioreceptor toward biosensor development. In this project, we choose the organosilanes that can bind covalently to the silicon. Two silanes (7-octenyl trichlorosilane(OTS) and 3- aminopropyltriethoxysilane (APTES)) were studied., Their impact on the stability and the functionality of bio- receptor , model mouse immunoglobulin G (IgG), were evaluated. Spectroscopic characterization by XPS and infra- red Fourier transformed (FTIR) was first carried out to assess that the silanized surface exhibit carboxylic groups. The homogeneity of the surfaces was measured by AFM. Then, IgG were immobilized on these supports, covalently and a topographic AFM study was conducted to measure the distribution of these antibodies. The orientation of the grafted antibody was investigated by immune-enzymatic assays. We have also evaluated the binding capacity of the IgG immobilized on both surfaces. Then, the impact of aging on APTES surface was evaluated by spectroscopics and biological methods.

Plus de 40 ans après la découverte de la technologie des hybridomes, une soixantaine d’anticorps monoclonaux thérapeutiques IgG ou assimilés sont aujourd’hui commercialisés. Leur succès découle de leur humanisation, en particulier celle de la portion Fc qui dérive de différents variants humains naturels, isotypes et allotypes. Depuis quelques années, apparaissent sur le marché de nombreux anticorps comportant des portions Fc artificiellement modifiées dans le but de moduler diverses propriétés pharmacologiques (propriétés cytolytiques, demi-vie, stabilité, etc.), dont certaines ont été particulièrement étudiées suite aux travaux de notre équipe. Les variants Fc sont protégés par des technologies brevetées dont on connaît mal l’étendue, qui ne font pas nécessairement l’objet de publications scientifiques, et dont la raison d’être reste méconnue des chercheurs et plus encore des professionnels de santé. Nous avons donc entrepris de réaliser une cartographie et une analyse fine des brevets traitant des modifications dans la portion Fc des IgG. Cette analyse a été menée de front avec une étude bibliographique détaillée, car les données scientifiques décrites dans les brevets sont toujours à considérer avec prudence, les demandes de brevets n’étant pas revues par des pairs. Nous avons eu l’occasion d’ailleurs d’épingler certaines dérives, comme celle de considérer qu’il pourrait y avoir plus de 4 sous-classes d’IgG dans l’espèce humaine (jusqu’à 19 dans certaines revendications…). / More than 40 years after the discovery of the hybridoma technology, around sixty therapeutic monoclonal antibodies based on IgG or assimilated are marketed today. Their success comes from their humanization, especially of the Fc portion derived from various natural human variants, isotypes and allotypes. For some years, many antibodies artificially modified in their Fc portions have emerged, in order to alter various pharmacological properties (cytolitic properties, half-life, stability, etc.), some of them having been particularly studied following the works of our team. Fc variants are covered by patented technologies of which little is known about the extent, which are not necessarily the subject of scientific publications, and whose purpose remains unknown for researchers and even more for health professionals. We therefore undertook to realize a landscape and a detailed analysis of patents dealing with modifications in the Fc portion of IgG. This analysis has been conducted in front with a detailed literature survey, since the scientific data described in patents must be treated with caution, as patent application are not peer reviewed. We actually point certain abuses, such as to consider that there might be more than four human IgG subclasses (up to 19 in some claims…).

Environ 20% des chiots nés vivants meurent au cours des trois premières semaines de vie. Cette mortalité néonatale est ainsi responsable de pertes économiques importantes pour les éleveurs. Néanmoins, les déterminants immunitaires et nutritionnels de ces cas de mortalité sont très mal connus dans l'espèce canine. L'objectif de ce travail était donc d'identifier les facteurs de risque de mortalité néonatale chez le chiot, dont en particulier l'importance de la prise colostrale pour la survie. La première partie des résultats a mis en évidence une association forte entre la croissance précoce (sur les deux premiers jours de vie) et les pertes néonatales. Cette croissance précoce reflétant directement la prise colostrale, la suite des travaux s'est ensuite intéressée aux différents apports colostraux. Le transfert d'immunité passive affecte le taux de mortalité, une concentration sérique en immunoglobulines G à l'âge de 2 jours inférieure à 2,3 g/l étant associée à un risque de mortalité néonatale plus élevé et caractérisant un déficit de transfert. Un résultat similaire a été obtenu avec l'étude de l'immunité spécifique dirigée contre le parvovirus canin de type 2 : les chiots ayant acquis les titres en anticorps les plus faibles à deux jours d'âge séroconvertissent et excrètent du virus significativement plus tôt que les chiots avec de plus forts titres d'anticorps maternels. L'apport énergétique colostral était également associé aux chances de survie : les chiots présentant une glycémie à 24 heures de vie inférieure à 0,92 g/l ayant un plus fort risque de mortalité. Outre la forte relation entre survie et prise colostrale (apportant immunoglobulines et énergie), notre travail montre également l'impact du poids et de la vitalité à la naissance (évalué par le score Apgar). Par ailleurs, la qualité immunologique du colostrum (évaluée par sa concentration en IgG), bien que non directement liée aux chances de survie, s'est montrée très variable entre les chiennes, aggravant probablement le risque de déficit de transfert de l'immunité passive chez certains chiots. Tous ces travaux contribuent à une meilleure connaissance des facteurs de risque de mortalité qu'il est important de contrôler en élevage. Ils révèlent le rôle crucial de la croissance foetale, du déroulement de la mise-bas et de l'ingestion colostrale. Une pesée des chiots au cours des premiers jours de vie peut être a minima conseillée aux éleveurs pour identifier les chiots à risque et auxquels des soins plus attentifs devront être apportés. / Neonatal mortality in dogs (within the first three weeks after birth) accounts on average for 20% of puppies born alive, being thus responsible for a great economic loss to dog breeders. However, immunological and nutritional determinants of puppies survival are poorly described. This dissertation thus investigated the risk factors of neonatal mortality in dogs, and in particular the importance of colostrum intake for survival. The first part of results revealed a strong association between early growth rate (during the first two days of life) and neonatal losses. As early growth rate reflects the colostrum intake, the role of colostrum was then addressed. Passive immune transfer was shown to affect mortality rate, with serum IgG concentration at two days of age lower than 2.3 g/L being characterized as in deficit of maternal immunoglobulins. Similar lack of immunoprotection was observed for a specific canine pathogen (canine parvovirus type 2), as puppies with low antibody titers at two days of age seroconverted or underwent parvovirus infection significantly earlier than puppies with higher titers. Energy intake, evaluated via blood glucose concentration at 24h of life, was also found associated with survival: puppies with low glucose concentration (≤ 92 mg/dl) were found at higher risk of death. Besides the strong relationship between colostrum ingestion, providing passive immunity and energy, the impact of birth weight and vitality at birth (evaluated via Apgar score) on puppies’ survival was also evidenced. Colostrum immune quality (evaluated via IgG concentration), although not directly linked with the risk of neonatal death, was found of great variability, most probably putting some puppies at a risk of passive immune deficit. The present study contributed to the knowledge about the risk factors of mortality to be controlled in breeding kennels. Results provided in this work revealed the crucial role of the fetal growth, course of parturition and intake of the colostrum for the newborn dog. Regular weighing of newborns can be advised as a practical application for dog breeders, as it allows to identify puppies at a higher risk of death and to provide puppies with additional nursing and veterinary care.

La commutation de classe (CSR) est une étape clef de la réponse immunitaire. Ce phénomène va permettre de changer le type d’immunoglobuline (Ig) produite en réponse à un antigène donné. Ces Ig seront ensuite produites par les plasmocytes, qui constituent le stade ultime de la différenciation de la lignée cellulaire B. Lors de dérèglements de la prolifération de ces cellules, certaines Ig monoclonales anormales peuvent être produites et conduire à des situations pathologiques. La première partie de ce travail s’inscrit dans une logique de compréhension des éléments minima requis pour l’établissement de ce phénomène de CSR. Grace à un modèle animal d’insertion dirigée dans le locus kappa murin, naturellement ciblé par l’enzyme AID responsable de ce phénomène, nous avons mis en évidence que la présence de deux régions « switch » transcrites et fortement mutées par AID, n’était pas suffisante pour permettre ce phénomène. Un modèle murin reproduisant une maladie due à une Ig anormale a aussi été établi. Ce modèle de HCDD (Heavy Chain Deposition Disease) nous a permis de mettre en évidence la nécessité de la délétion du CH1 des chaînes lourdes d’Ig pour la génération des dépôts et nous a également permis de montrer que l’efficacité des thérapies à base d’inhibiteur de protéasome observée chez les patients atteint de HCDD, était en partie due à l’Ig pathogène elle-même, qui induit une élévation du stress du réticulum endoplasmique (UPR) au sein des plasmocytes producteurs de ces Ig. / Class Switch Recombination (CSR) is a key step during the immune response. CSR results in a switch to a more specific Ig isotype in response to a specific antigen. Plasma cells, the ultimate stage of B cell lineage differentiation, will synthesize this Ig. During plasma cell disorders, the production of an abnormal monoclonal Ig can lead to pathogenic situations. The aim of the first part of this study is to determine the minimal requirements for CSR induction with a mouse model in which we inserted a “switch cassette” composed of two transcribed S regions into a kappa locus which is naturally targeted by AID. However, despite efficient transcription and AID targeting of S regions, the “switch cassette” was not sufficient to induce effective CSR. We also developed a mouse model of HCDD (Heavy Chain Deposition Disease) which reproduced typical Randall-type renal lesions due to production of a pathogenic truncated heavy chain. This model demonstrated that the effective response to proteasome inhibitors observed in patients, is the consequence of the presence of a truncated HC that sensitizes plasma cells to this type of therapy through an elevated unfolded protein response (UPR).

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le lymphome avec phase circulante le plus fréquent chez l’adulte dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par une grand hétérogénéité dans son évolution naturelle avec des formes indolentes ne nécessitant jamais de traitement spécifique et des formes agressives requérant une chimiothérapie rapidement après le diagnostic. Dans ce travail de thèse, nous avons posé la question du rôle des anomalies moléculaires et en particulier des gènes des immunoglobulines dans l’histoire naturelle de la maladie, tant au plan mécanistique que pour le pronostic. Nous avons étudié trois remaniements atypiques impliquant un gène des immunoglobulines et un partenaire inconnu dans la LLC/lymphome lymphocytique. Les points de cassure ont pu être identifiés et nous ont permis de mettre en évidence l’implication dans 2 cas d’ARN longs non codants en 17q25 et 8q24. De plus, deux cas ont des points de cassure dans une région chromosomique restreinte (espacés de 200 kb en 17q25). Il pourrait s’agir d’un locus important dans la lymphomagénèse, de même que pour la région 8q24 contenant MYC et de nombreux gènes non codants jusqu’ici peu explorés. Par ailleurs, dans l’ère du séquençage haut débit, de nombreux marqueurs pronostiques moléculaires sont décrits dans la LLC. Nous avons démontré que l’électrophorèse des protéines sériques normale (immunoglobulines polyclonales sans hypogammaglobulinémie) au diagnostic, un marqueur simple et peu couteux, reste dans l’ère du NGS, un marqueur indépendant de bon pronostic dans la LLC. Sa combinaison avec un statut IGHV muté identifie un groupe de patients qui n’auront probablement jamais besoin de traitement spécifique. Ce travail nous a conduit à mettre au point un outil performant de détection des anomalies de nombre de copies par séquençage haut débit. Celui-ci permet la mise en évidence de disomies uniparentales dont la signification pronostique n’est actuellement pas établie dans la LLC. Ces anomalies pourraient être le reflet d’une instabilité chromosomique et il serait intéressant d’étudier leur impact pronostique dans la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent lymphoma with leukemic phase in the elderly in Western countries. It is characterized by a great heterogeneity in its natural history with indolent forms never requiring any specific treatment and aggressive forms needing chemotherapy rapidly after diagnosis. In this work of thesis, we asked the question of the role of molecular abnormalities, and in particular of the immunoglobulin genes in the natural history of the disease, at mechanistic level and for prognosis. We studied three atypical rearrangements implicating an immunoglobulin gene and an unknown partner in CLL/lymphocytic lymphoma. The breakpoints have been identified and the implication of long non coding RNA was highlighted in two cases in 17q25 and 8q24. Moreover, two cases harboured breakpoints in a restricted chromosomic region (200 kb spaced in 17q25). It could be an important locus in lymphomagenesis, as is 8q24 region containing MYC and numerous other non coding genes poorly characterized by now. Furthermore, in high throughput sequencing (HTS) era, many molecular prognosis markers have been described in CLL. We demonstrated that normal serum protein electrophoresis (polyclonal immunoglobulin without hypogammaglobulinemia) at diagnosis, a simple and unexpensive marker, stays in HTS era an independent good prognosis marker in CLL. Its combination with unmutated IGHV genes status identifies a group of patients who will probably never require any specific treatment. This work led us to develop an efficient tool to detect copy number variations by THS. This tool allows to highlight uniparental disomy whose prognosis signification is not established in CLL. These abnormalities could reflect chromosomal instability and it could be interesting to study their prognosis impact in CLL.

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Ce travail porte sur différentes méthodes de détection de protéines par des anticorps (Acs) marqués par des boîtes quantiques (QD, « quantum dots »). La première partie de la thèse porte sur le développement et l'optimisation de méthodes de conjugaison d'Acs polyclonaux à des QDs. Une étude de 2007 avait démontré que les conjugués anticorps-quantum dots (Acs-QDs) commerciaux ne présentent que de très rares anticorps fonctionnels à leur surface [Pathak et al., 2007]. Nous avons donc : (i) développé des conditions de réduction ménagée des ponts disulfures des Acs en utilisant soit du dithiothreitol, soit du 2-mercapotethanolamine, (ii) purifié les fragments d'Acs fonctionnels grâce à une colonne d'affinité, (iii) conjugué ces fragments fonctionnels d'Acs aux QDs en utilisant l'agent de liaison amine-thiol SMCC et (iv) développé une méthode de purification des conjugués sur gel d'agarose afin d'éliminer les fragments d'Acs non conjugués et les QDs libres. Des tests en cytométrie en flux ont permis de déterminer l'efficacité des conjugués pour détecter l'expression de la molécule CD4 à la surface de lymphocytes T humains. Un marquage de CD4 réalisé avec des conjugués préparés selon notre méthode s'avère être cinq fois plus sensible qu'en utilisant des conjugués réalisés selon les recommandations commerciales. Une autre méthode de préparation des Acs pour la conjugaison aux QDs a été testée : l'ajout de groupements fonctionnels sulfhydriles sur des amines primaires grâce au N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). Cependant, cette méthode ne permet pas d'avoir un contrôle précis du nombre ni de l'emplacement des groupements fonctionnels sulfhydriles ainsi ajoutés. Les tests de conjugaison aux QDs qui ont été réalisés avec ces Acs-SH, en utilisant l'agent de liaison SMCC, a entraîné la formation d'agrégats de taille variable. Cette méthode a donc été abandonnée.La seconde partie de la thèse porte sur la démonstration de la faisabilité et l'optimisation d'un marquage de l'antigène carcino-embryonnaire (CEA, « carcinoembryonic antigen ») humain à la surface de lignées cellulaires murines avec un anticorps simple domaine (sdAb) anti-CEA biotinylé détecté grâce à des conjugués streptavidine-QDs commerciaux et analysé par cytométrie en flux. Ces sdAbs ont été biotinylés selon deux approches : (i) avec des agents de biotinylation chimique qui permettent d'ajouter une biotine sur les amines primaires (biotinylation in vitro) et (ii) par une enzyme lors de leur production par E. coli (biotinylation in vivo). La détection du CEA humain à la surface des 100 000 cellules (lignées cellulaires murine MC38 et MC38-CEA) par ces sdAbs biotinylés a été testée en cytométrie de flux puis comparée à celle obtenue par un anticorps monoclonal biotinylé in vitro. Les résultats ont démontré que les sdAbs biotinylés ont une sensibilité de détection similaire que la biotinylation soit réalisée in vitro ou in vivo. Par contre, la sensibilité de la détection du CEA est environ cinquante fois meilleure en utilisant des sdAbs biotinylés (0,6 fmol d'anticorps sont nécessaires pour détecter le CEA) qu'avec des anticorps monoclonaux biotinylés (33 fmol). / We have been working on different ways to detect proteins with antibodies (Abs) labeled by quantum dots (QDs). The first part of his work is to develop and optimize the conjugation of polyclonal antibodies to quantum dot. A study has reported that commercial antibody-quantum dots conjugates (Abs-QDs) present very few functional Ab fragments at the surface of the conjugate [Pathak et al., 2007]. We had: (i) developed an advanced procedure of antibody reduction using dithiothreitol (DTT) or 2-mercaptoethanolamine (2-MEA) (to prevent the loss of antibody functions), (ii) purified the active fragments by affinity purification on column, (iii) conjugated the active reduced antibody fragments to QDs using the amine-thiol crosslinker SMCC for SH coupling, and (iv) developed the purification of the conjugates on agarose gel to remove free QDs and unconjugated antibody fragments. Our conjugates present about a five times better ability to detect CD4 by flow cytometry on 500 000 isolated human lymphocyte T cells than those made after the commercial procedure. Another procedure for antibody preparation was addition of sulfhydryl groups on primary amines using N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA). However this procedure presents some variable yield and the number and the localization of sulfhydryl groups added on antibody cannot be fully controlled. Thereby, the conjugation of these Abs-SH to QDs using SMCC chemistry leads to the creation of aggregates. This Ab preparation in preparation for conjugation to QDs was abandoned.The second part of our work focusses on testing and comparing the ability to detect carcinoembryonic antigen (CEA) by flow cytometry with anti-CEA single domain antibodies (sdAbs) labeled by QDs. The sdAbs were biotinylated by using two methods: (i) in vitro chemical biotinylation reagent which adds biotins on primary amines, and (ii) enzymatic in vivo biotinylation during their production in E. coli. These anti-CEA sdAb biotinylation methods were compared to in vitro biotinylated monoclonal Abs against CEA for their respective ability to detect human CEA on 100 000 mice cells (MC38 and MC38-CEA cell lines) using flow cytometry. The results show that the limit detection for biotinylated sdAbs is similar between in vitro and in vivo biotinylation. Furthermore the limit detection with biotinylated sdAb (0.6 fmol are required to detect CEA) is about fifty times better than with biotinylated monoclonal Abs (33 fmol).