Le cancer de la vessie se caractérise par un taux de récidive de 70% après résection chirurgicale. Les tumeurs récidivantes sont traitées par une immunothérapie intravésicale au BCG dont le mode d'action est peu connu. Bien que donnant des résultats appréciables, cette thérapie est appliquée de façon empirique et reste sans effets pour 30% des patients traités. Afin d'identifier les patients réfractaires au traitement, nous avons analysé différentes caractéristiques tant au niveau des patients, de leurs tumeurs ou encore du schéma d'administration de l'immunothérapie qui seraient reliées au temps de survie sans récidive. Le système immunitaire inné, par l'intermédiaire du gène NRAMP1, est considéré comme un facteur impliqué dans l'effet antitumoral de l'immunothérapie. La distribution de plusieurs polymorphismes de ce gène a été comparée parmi différentes cohortes de patients montrant des risques variables de récidive. L'expression de l'ARNm de ce gène fut évaluée par hybridation in situ dans des spécimens de tumeurs ou par RT-PCR parmi plusieurs lignées tumorales d'origines diverses. L'analyse de l'expression d'autres antigènes fut aussi pratiquée par immunohistochimie sur des spécimens de tumeurs de patients traités au BCG. Parmi les différents marqueurs analysés, la distribution du polymorphisme D543N et la quantité de cellules tumorales exprimant l'antigène 19A211 furent associées à la survie sans récidive après immunothérapie. L'expression de NRAMP1 ne fut retrouvée dans aucune lignée cellulaire de vessie testée, même si 3 autres lignées cancéreuses (côlon et utérus) exprimaient ce gène spontanément. De plus, l'hybridation in situ a montré une expression inattendue de ce gène dans le tissu tumoral vésical. Quant au traitement d'entretien, les patients qui l'ont toléré pour au moins 1 an ont obtenu les meilleurs temps de survie sans récidive. Ainsi les résultats de ce projet semblent montrer qu'il existe des différences caractéristiques entre les patients atteints de tumeurs récidivantes et ceux traités par une simple résection transuréthrale. Ceci pourrait fournir des indications quand à pratiquer ou non une immunothérapie. / Superficial bladder cancer recurrences occur in 70% of cases. Intravesical immunotherapy is applied to prevent those recurrences but it fails in about 30% of cases. This study tried to ascertain characteristics which could be used to discriminate patients according to their recurrence risk after treatment. As the NRAMP1 gene was tied to the immune System activation, we suspected it played a role in BCG treatment efficacy. We analysed its polymorphisms distribution among patients showing variable recurrence risk and its expression in tumoral cells through in situ hybridization and RTPCR. The treatment schedule is still empirical and needs to be optimized, so we analysed the impact of long-term maintenance treatment on tumor recurrence. D543N polymorphism distribution and expression of the 19A211 antigen were significantly associated with recurrence-free survival time. Even if NRAMP1 was not found to be expressed on any bladder tumor cell lines analysed, in situ hybridization did reveal an expression of this gene mRNA in tumor cells. Moreover it was shown that patients with the best recurrence free survival time were those who tolerated maintenance treatment for at least a year. We did show that it was possible to discriminate patients through characteristics which could indicate recurrence free survival after immunotherapy.

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Chez les hommes, le cancer de la prostate est, au niveau mondial, le 2ème cancer le plus diagnostiqué et le 5ème cancer le plus létal. Lorsqu'il est localisé à la prostate, il est principalement traité par prostatectomie ou radiothérapie. Cependant, entre 27 et 53% des patients traités à ce stade développeront éventuellement une récidive. L'hormonothérapie qui vise à réduire l'effet des androgènes sur le cancer, permet d'augmenter significativement la survie de ces patients. Par contre, ces cancers deviendront irrémédiablement résistants à la castration puis évolueront vers la forme métastatique pour laquelle il n'existe aucun traitement curatif. Ainsi de nouvelles thérapies sont nécessaires pour augmenter la survie de ces patients. Un nombre important d'études visant le développement d'immunothérapies du cancer de la prostate ont vu le jour au cours des dernières années. Ces études ont mené entres autres au développement du Sipuleucel-T, la première immunothérapie approuvée pour le traitement du cancer de la prostate, ainsi qu'à l'étude de l'effet antitumoral des inhibiteurs de points de contrôle immunologiques. Ces traitements, principalement testés sur des cancers avancés, ont montré des effets très limités et dans certains cas, des effets indésirables importants. Plusieurs études soulignent l'importance d'administrer les traitements plus tôt dans le cours de la maladie et suggèrent que l'administration locale de combinaisons de molécules immunomodulatrices pourrait être efficace tout en limitant les effets indésirables. L'objectif principal de mon projet était de développer une nouvelle approche immunothérapeutique basée sur l'utilisation du vecteur adénoviral PCA3-TSTA permettant l'expression ciblée à la tumeur de molécules immunostimulatrices. L'expression ciblée à la tumeur est réalisée grâce à la spécificité du promoteur de l'ARN long non-codant PCA3 humain, qui est à ce jour le biomarqueur le plus spécifique du cancer de la prostate, ainsi que l'amplification de l'activité transcriptionnelle par le système TSTA. Ces approches immunothérapeutiques ont été testées dans le modèle murin immunocompétent de cancer de la prostate TRAMP-C2. Dans un premier temps, nous avons montré chez des souris portant des tumeurs TRAMP-C2, la spécificité tumorale et l'activité transcriptionnelle in vivo pendant au moins 21 jours de l'adénovirus PCA3-TSTA codant pour la luciférase. Nous avons ensuite construit et testé des adénovirus PCA3-TSTA codant pour les formes murines de mGM-CSF, mIL-17A ou mIL-12. Seul le traitement précoce de tumeurs TRAMP-C2 par l'adénovirus PCA3-TSTA-mIL-12 a résulté en une régression tumorale complète chez 100% des souris traitées. A un stade plus avancé, ce traitement a induit un ralentissement significatif de la croissance tumorale et une régression complète chez 20% des souris traitées. Par la suite, l'analyse des tumeurs TRAMP-C2 traitées in vivo avec le PCA3-TSTA-mIL-12 a montré l'induction de l'expression de mIL-12 mais aussi d'une réponse cytokinique impliquant l'IFN-γ. L'infection de biopsies de cancer de prostate humain par le PCA3-TSTA-mIL-12 a également induit une sécrétion d'IFN-γ dans certains échantillons, suggérant la stimulation, par l'IL-12 murine, de cellules T CD8+ ou NK infiltrant ces biopsies. Nos analyses en cytométrie de flux ont montré que les cellules immunes infiltrant les tumeurs TRAMP-C2 sont caractérisées par l'expression de PD-1 et plus faiblement de CTLA-4 et que cette infiltration est caractérisée par une importante proportion de MDSC. Nous avons donc analysé l'effet antitumoral du PCA3-TSTA-mIL-12 en combinaison avec des anticorps anti-PD-1 et anti-CTLA-4. La combinaison du PCA3-TSTA-mIL-12 avec un anticorps bloquant le CTLA-4 a montré une régression tumorale complète chez 33% des souris traitées contre 16% lorsque que le virus était combiné avec un anticorps inhibant le PD-1. Finalement, nous avons testé la combinaison d'un inhibiteur de PD-1 avec le tasquinimod, un composé inhibiteur de la fonction des MDSC. Nous n'avons cependant pas pu mettre en évidence d'effet significatif de cette combinaison sur la croissance des tumeurs TRAMP-C2. Globalement, nos résultats ont démontré que le vecteur adénoviral PCA3-TSTA permet d'induire l'expression localisée et durable de molécules immunomodulatrices par des cellules tumorales prostatiques. L'injection du PCA3-TSTA-mIL-12 dans des tumeurs TRAMP-C2 in vivo et des biopsies de cancer de prostate humain in vitro nous ont permis de mettre en évidence la production de cytokines par les cellules immunes infiltrant ces tumeurs en réponse à la production de mIL-12. Ces protocoles permettraient dans des travaux futurs de tester différents vecteurs PCA3-TSTA afin de sélectionner des combinaisons optimales de signaux immuns capables d'activer une réponse antitumorale pouvant mener à des effets immunothérapeutiques cliniques. / In men, prostate cancer is, worldwide, the 2nd most diagnosed cancer and the 5th most lethal cancer. When localized to the prostate, it is mainly treated with prostatectomy or radiation therapy. However, between 27 and 53% of patients treated at this stage will eventually develop a recurrence. Hormone therapy, which aims to reduce the effect of androgens on cancer, significantly increases the survival of these patients. On the other hand, these cancers will become irremediably resistant to castration and then evolve into the metastatic form for which there is no cure. Thus, new therapies are needed to increase the survival of these patients. A significant number of studies aimed at the development of immunotherapies for prostate cancer have emerged in recent years. These studies led, among other things, to the development of Sipuleucel-T, the first immunotherapy approved for the treatment of prostate cancer, as well as the study of the antitumor effect of immunological checkpoint inhibitors. These treatments, mainly tested on advanced cancers, have shown very limited effects and in some cases, significant adverse effects. Several studies highlight the importance of administering treatments earlier in the course of the disease and suggest that local administration of combinations of immunomodulatory molecules may be effective while limiting adverse effects. The main objective of my project was to develop a new immunotherapeutic approach based on the use of the adenoviral vector PCA3-TSTA allowing the targeted expression to the tumor of immunostimulatory molecules. Targeted expression to the tumor is achieved by the specificity of the promoter of the human PCA3 long non-coding RNA, which is to date the most specific biomarker of prostate cancer, as well as the amplification of transcriptional activity by the TSTA system. These immunotherapeutic approaches were tested in the immunocompetent mouse model of prostate cancer TRAMP-C2. As a first step, we showed in mice carrying TRAMP-C2 tumors, tumor specificity and transcriptional activity in vivo for at least 21 days of the PCA3-TSTA adenovirus encoding luciferase. We then built and tested PCA3-TSTA adenoviruses encoding the murine forms of mGM-CSF, mIL-17A or mIL-12. Only early treatment of TRAMP-C2 tumors with PCA3-TSTA-mIL-12 adenovirus resulted in complete tumor regression in 100% of the treated mice. At a more advanced stage, this treatment induced a significant slowdown in tumor growth and complete regression in 20% of the treated mice. Subsequently, the analysis of TRAMP-C2 tumors treated in vivo with PCA3-TSTA-mIL-12 showed the induction of mIL-12 expression but also of a cytokine response involving IFN-γ. Infection of human prostate cancer biopsies with PCA3-TSTA-mIL-12 also induced secretion of IFN-γ in some samples, suggesting stimulation by murine IL-12 of CD8+ or NK T cells infiltrating these biopsies. Our flow cytometry analyses have shown that immune cells infiltrating TRAMP-C2 tumors are characterized by the expression of PD-1 and weaker expression of CTLA-4 and that this infiltration is characterized by a large proportion of MDSC. We therefore analyzed the antitumor effect of PCA3-TSTA-mIL-12 in combination with anti-PD-1 and anti-CTLA-4 antibodies. The combination of PCA3-TSTA-mIL-12 with a CTLA-4-blocking antibody showed complete tumor regression in 33% of treated mice compared to 16% when the virus was combined with a PD-1-inhibiting antibody. Finally, we tested the combination of a PD-1 inhibitor with tasquinimod, a compound that inhibits MDSC function. However, we could not show a significant effect of this combination on the growth of TRAMP-C2 tumors. Overall, our results demonstrated that the adenoviral vector PCA3-TSTA induces the localized and sustained expression of immunomodulatory molecules by prostate tumor cells. Injection of PCA3-TSTA-mIL-12 into TRAMP-C2 tumors in vivo and human prostate cancer biopsies in vitro allowed us to demonstrate the production of cytokines by immune cells infiltrating these tumors in response to the production of mIL-12. These protocols would allow in future work to test different PCA3-TSTA vectors in order to select optimal combinations of immune signals capable of activating an antitumor response that can lead to clinical immunotherapeutic effects.

Le cancer de la vessie est au niveau mondial le 9ème cancer en importance avec 430 000 nouveaux cas diagnostiqués en 2014. Les tumeurs vésicales infiltrant le muscle représentent environ 25% des tumeurs au premier diagnostic, alors que les tumeurs vésicales non infiltrant le muscle représentent environ 75% de ces tumeurs. Ces dernières sont généralement associées à un bon pronostic mais sont caractérisées par un taux élevé de récidive et de progression, alors que les premières sont d’emblée agressives et présentent un risque élevé de progression vers les stades avancés de la maladie. Parmi les différentes thérapies disponibles pour la prise en charge des tumeurs vésicales on retrouve l’immunothérapie non-spécifique par le Bacillus de Calmette-Guérin (BCG) pour les tumeurs non-infiltrant le muscle et, depuis peu, les inhibiteurs de point de contrôle immunologique (PCI) pour les tumeurs à des stades avancés. Le cancer de la vessie est un des rares cancers à bien répondre à l’immunothérapie, mais malgré cela ces traitements ne sont pas optimaux. L’objectif principal de mon projet était de développer de nouvelles approches immunothérapeutiques plus efficaces pour lutter contre les cancers de la vessie. Pour ce faire, trois approches complémentaires ont été investiguées dans des modèles murins de cancer de la vessie. Dans un premier temps, nous avons évalué in vitro et in vivo le potentiel du poly(I:C), un agoniste du TLR3, utilisé seul ou en combinaison avec le BCG. Alors que le poly(I:C) a induit une diminution de la prolifération et une induction de l’apoptose dans des cellules de cancer de la vessie traitées in vitro, la combinaison poly(I:C)/BCG a induit, in vivo, une régression tumorale complète chez 28% des souris traitées. Par la suite, nous avons évalué le potentiel de deux combinaisons d’inhibiteurs de PCI dans deux modèles murins différents de cancer de la vessie. La première combinaison étudiée est celle du blocage simultané des PCI PD-1 et TIM-3 testée dans le modèle MBT-2 puisque que la caractérisation des tumeurs MBT-2 a montré que ces deux récepteurs étaient des PCI fréquemment exprimés dans ces tumeurs. Le blocage in vivo de ces voies de signalisation a révélé que, dans les tumeurs MBT-2, PD-1 est associé à une activité pro-tumorale, alors que de façon étonnante, TIM-3 est associé à une activité anti-tumorale, révélant des fonctions opposées de ces deux PCI dans ces tumeurs. La seconde combinaison étudiée est celle des PCI PD-1 et LAG-3 testée cette fois-ci dans le modèle MB49. La caractérisation des tumeurs MB49 a démontré que PD-1 et LAG-3 étaient des PCI importants dans ces tumeurs. L’étude in vivo a démontré que l’inhibition conjointe des voies PD-1 et LAG-3 doublait le taux de survie, puisque 67% des souris démontraient une régression tumorale complète alors que les taux de survie étaient respectivement de 33% et 0% lorsque les anti-PD-1 et anti-LAG-3 étaient administrés en monothérapie. Finalement, puisque les androgènes semblent jouer un rôle important dans le cancer de la vessie, nous avons testé une approche combinant l’inhibition de PD-1 et du récepteur aux androgènes (AR). Nous avons démontré que l’enzalutamide et le seviteronel, des anti-androgènes de deuxième génération, induisaient in vitro une diminution de la prolifération des cellules de cancer de la vessie humaines et murines. In vivo, la combinaison d’enzalutamide et d’anti-PD-1 a démontré un taux de survie de 66%, soit un taux bien supérieur au taux de 16% observé lors de l’utilisation de l’enzalutamide ou de l’anti-PD-1 utilisés en monothérapie. Ces études ont ainsi permis d’identifier différentes avenues possibles, pour augmenter la réponse immune anti-tumorale, qui pourraient être testées en essais cliniques. Elles démontrent également que la combinaison d’approches thérapeutiques est très prometteuse pour l’avenir de l’immunothérapie du cancer de la vessie. / Bladder cancer (BCa) is the ninth most common cancer in the world, with 430 000 new cases diagnosed in 2014. Muscle-invasive bladder cancer represents about 25% of bladder tumors, while non-muscle-invasive bladder cancer represents about 75% of these tumors. The latter are usually associated with a favorable prognosis but are characterized by a high rate of recurrence and progression while the former are aggressive from the onset and are at high risk of progression toward advanced disease. Among the various therapies available for the management of bladder tumors is non-specific immunotherapy using bacillus Calmette-Guerin (BCG) for the treatment on non-muscle invasive bladder tumors and, more recently, inhibitors of immune checkpoint (IC) for the treatment of advanced bladder tumors. BCa is one of the rare cancers to respond well to immunotherapy but, nevertheless, these treatments are suboptimal. The main objective of my project was to develop new immunotherapeutic approaches to fight more efficiently against BCa. To achieve this, three complementary approaches were investigated in murine BCa models. We first assessed in vitro and in vivo the potential of poly(I:C), a TLR3 agonist, used alone or in combination with BCG. While poly(I:C) induced anti-proliferative and apoptotic effects on BCa cells in vitro, the combination of poly(I:C) and BCG induced in vivo a complete tumor regression in 28% of treated mice. Then, we evaluated the potential of two combinations of IC inhibitors in two murine BCa models. The first combination studied was that of the simultaneous blockade of PD-1 and TIM-3 tested in the MBT-2 model because the characterization of the MBT-2 tumors showed that these two receptors where frequently IC expressed in these tumors. In vivo blockade of these pathways revealed that in MBT-2 tumors, PD-1 is associated to a pro-tumoral activity, whereas, TIM-3 is associated with anti-tumoral activity, revealing opposite functions of these IC in these tumors. The second combination studied was that of PD-1 and LAG-3 tested in the MB49 BCa model. The characterization of MB49 tumors showed that PD-1 and LAG-3 were important IC in these tumors. The in vivo study showed that the simultaneous blockade of PD-1 and LAG-3 increased the survival rate, since 67% of mice showed a complete tumor regression while the survival rates were 33% and 0% when anti-PD-1 and anti-LAG-3, respectively, were used in monotherapy. Finally, since androgens seem to play an important role in BCa, we tested an approach combining the inhibition of PD-1 and of the androgen receptor (AR). We showed that enzalutamide and seviteronel, two second generation antiandrogens, induced in vitro a decrease of the proliferation of human and murine BCa cells. In vivo, the combination of enzalutamide with anti-PD-1 showed a 66% overall survival rate, a rate that is much higher than the 16% rate observed when enzalutamide or anti-PD-1 were used alone. Thus, these studies allowed us to identify various possible ways to increase anti-tumor immune response that could be tested in clinical trials. They also show that the combination of therapeutic approaches is very promising the future of BCa immunotherapy.

Les antigènes testiculaires du cancer sont des cibles idéales pour l’immunothérapie du cancer car ce sont des protéines immunogéniques dont l’expression est restreinte aux cellules germinales et au cancer. Le but de cette étude est d’évaluer le potentiel de MAGE-A11, un antigène testiculaire du cancer, comme cible pour développer un vaccin contre le cancer de la prostate. Pour ce faire, l’anticorps monoclonal 5C4 qui a la capacité de reconnaître la présence de MAGE-A11 dans les tissus fixés et inclus en paraffine a été produit. De plus, l’expression de MAGE-A11 a été analysée sur plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Il a été démontré que MAGE-A11 est exprimé dans plusieurs types de cancers notamment dans le cancer du côlon et du cerveau. Finalement, nous avons identifié trois épitopes du CMH classe II HLA-DR1 dans la protéine MAGE-A11 confirmant ainsi l’immunogénicité de cet antigène et son potentiel comme cible pour l’immunothérapie du cancer. / Cancer/testis antigens are ideal targets for cancer immunotherapy because of their limited expression in normal tissues, aberrant expression in malignancies and their immunogenic properties. The aim of this study was to evaluate the potential of cancer/testis antigen, MAGE-A11, as an immunotherapeutic target for development of a prostate cancer vaccine. To accomplish this, we produced the monoclonal antibody 5C4 that is capable of recognizing MAGE-A11 in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. We also investigated the expression of MAGE-A11 in a wide variety of cancer cell lines to determine the scope of its expression in cancer. It was shown that MAGE-A11 is widely expressed in malignancies. The highest MAGE-A11 expression was observed in colon cancer and astrocytoma brain tumors. Finally, we identified three naturally processed MHC class II HLA-DR1 epitopes in MAGE-A11 protein, thus confirming its immunogenicity and its potential as a target for cancer immunotherapy.

Le carcinome du nasopharynx (CNP) est associé à la latence II d’EBV et serait une cible préférentielle de peptides vaccinaux, dérivés des antigènes de latence II d’EBV, au sein d’une approche d’immunothérapie ciblant une réponse de type Th1. Cependant, les cellules de CNP sécrétaient des exosomes immunosuppresseurs qui induisent la mort des cellules T CD4+ Th1. En outre, cet environnement immunosuppressif est aggravé par un recrutement important de lymphocytes T régulateurs (Treg) qui sont associés à un mauvais pronostic dans le CNP. Ainsi, les objectifs de ma thèse ont consisté à (i) étudier l’impact des exosomes tumoraux de CNP (Exo-CNP) sur le phénotype et la fonctionnalité des Treg (ii) explorer les moyens de favoriser l’expansion et l’efficacité des effecteurs anti-tumoraux, notamment des lymphocytes T CD4+ Th1 anti-EBV, en proposant une stratégie d’immunothérapie peptidique. Dans la première partie, nous avons montré in vivo que la chimiokine CCL-20 était responsable du recrutement des Treg au sein de la tumeur. Par ailleurs, nous avons montré que les exosomes de CNP expriment la CCL-20 et sont capables de favoriser in vitro l’attraction des Treg via cette chimiokine. En parallèle, nous avons montré que les Exo-CNP (i) augmentent significativement l’expansion des Treg, (ii) augmentent significativement le niveau d’expression du CD25 et du FoxP3 sur les Treg, (iv) conduisent à la conversion des cellules T CD4+CD25neg en Treg CD4+CD25high. L’ensemble de ces résultats a été corrélé à une augmentation significative de l’activité suppressive des Treg en présence des exosomes de CNP. Dans la deuxième partie, nous avons validé ex vivo l’immunogénicité des peptides sur des cellules immunitaires humaines. Les résultats obtenus montrent également que des lignées T CD4+ humaines spécifiques d’EBV induisent une lyse des cellules de CNP EBV+. Et, de façon inattendue, la présence des Exo-CNP ne semble pas altérer les capacités de lyse des lignées. Enfin, nous avons pu valider l’efficacité des peptides dans un modèle in vivo. En effet, nous avons évalué l’effet anti-tumoral de la vaccination par les peptides dérivés d’EBV en mesurant l’évolution des masses tumorales. Nous avons pu montrer que la reconstitution immunitaire des souris SCID-CNP couplée à la vaccination peptidique permet la stabilisation de la croissance tumorale au cours du temps. En conclusion, la mise en évidence d’une coopération entre les Exo-CNP et les Treg est très importante et pourrait représenter ainsi un nouveau mécanisme d’échappement du CNP au système immunitaire. Par ailleurs, nos résultats consolident l’efficacité des peptides EBV qui pourraient être utilisés, à terme, dans une stratégie de vaccination peptidique ou de thérapie cellulaire en complément des traitements de référence chez les patients atteints d’un CNP. / Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is associated to the EBV latency II and should be a preferential target for our previously selected peptides derived from EBV latency II antigens. However, previous studies performed showed that NPC cells release exosomes which are able to induce apoptosis in mature Th1 lymphocytes. Furthermore, the NPC immunosuppressive environment is compounded by significant recruitment of natural regulatory T cells (Treg) associated with a poor prognosis in NPC. Thereby, this immunosuppressive environment could potentially be an obstacle to the use of this promiscious peptide coktail as a future vaccine in EBV associated nasopharyngeal carcinoma. In this context, the main objectives of my thesis consisted of (i) investigating the impact of NPc-derived-exosomes and Treg and (ii) exploring ways to promote expansion and efficiency of anti-tumoral effectors, notably anti-EBV Th1 CD4+ lymphocytes. First, we showed for the first time that NPC exosomes contain CCL-20 chemokine and are able to facilitate the recruitment of Treg cells in a CCL-20 dependent manner. This finding was confirmed by in vivo experiments in immunodeficient (SCID) and humanized mouse model xenografted with human NPC. NPC exosomes significantly increase the expansion, significantly increase the expression level of CD25 and FoxP3 on Treg and lead to the conversion of CD4+CD25neg T cells into CD4+CD25high Treg. These converted cells showed an effective immunosuppressive activity on autologous PBMCs. Moreover, NPC exosomes induce Treg suppressive activity and recruitment. In the second part, we validated peptides immunogenicity ex vivo. Then, we showed efficient EBV specific T CD4+ cytotoxicity in NPC cells. Furthermore, tumor exosomes do not affect the lysis capacity of our generated EBV specific T CD4+ cell lines. Finally, the efficiency of the EBV peptides coktail was evaluated in vivo by injecting EBV peptides into SCID mice xenografted with human NPC cells and reconstituted with human PBMCs. Here we showed that immune reconstitution coupled to peptide vaccination could stabilize tumor growth. In conclusion, our findings give new insights about NPC-derived exosomesimmunoregulatory properties and we showed that interactions of NPC-exosomes with Treg cells support immune evasion of human NPC. Our results also confirm that EBV peptides coktail could eventually be used in a vaccination strategy in combination with standard treatments in NPC patients to minimize relapse and control residual disease.

Le cancer de la prostate (CaP) est caractérisé par un microenvironnement tumoral immunosuppresseur qui inhibe l'immunité antitumorale. Le traitement avec des immunomodulateurs, comme les cytokines (e.g. IL-12), pourrait modifier la réponse immunitaire. Cependant, l'administration systémique d'immunomodulateurs peut provoquer des toxicités. Pour éviter cela, les immunomodulateurs pourraient être produits dans la tumeur par un adénovirus assurant l'expression du transgène spécifiquement au CaP. Notre laboratoire a construit un tel adénovirus codant pour l'IL-12 murin (mIL-12) sous le contrôle du promoteur PCA3 et d'un système d'amplification appelé TSTA. Il a été démontré que cet adénovirus, nommé Adv-PCA3-TSTA-mIL-12, réduisait la croissance des tumeurs de prostate TRAMP-C2 chez les souris C57BL/6. Ici, nous avons cherché à vérifier un possible effet synergique de l'activation d'OX40 pour améliorer la réponse observée avec l'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. OX40 murin (mOX40), ainsi que son ligand (mOX40L), sont des points de contrôle immunitaires qui appartiennent à la superfamille des Tumor Necrosis Factors. Pour atteindre cet objectif, nous avons proposé deux approches. Dans la première, nous avons cherché à produire un Adv-PCA3-TSTA-mOX40L afin de l'utiliser en combinaison avec l'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. L'Adv-PCA3-TSTA-mOX40L a été construit, mais sa capacité à induire l'expression de mOX40L dans les cellules TRAMP-C2 n'a pas encore été confirmée. Dans la seconde, un anticorps monoclonal (AcMo) agoniste anti-mOX40 serait administré en combinaison avec l'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. Pour tester cette approche, des cellules TRAMP-C2 ont été implantées chez des souris et les tumeurs ont été traitées par injections d'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12 seules ou en association avec des injections de AcMo anti-mOX40 ou anti-mPD-1, comme comparateur. Les résultats n'ont montré aucun effet synergique significatif des combinaisons. Les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs ont montré peu de changements significatifs, à l'exception d'une diminution des cellules CD8⁺PD-1⁺ dans les tumeurs traitées avec les anti-mOX40 ou anti-mPD-1. La combinaison de la stimulation d'OX40 avec l'Adv-PCA3-TSTA-IL-12 ne semble pas avoir d'effet synergique. Des combinaisons plus efficaces devraient être recherchées. / Prostate cancer (PCa) is characterized by an immunosuppressive tumor microenvironment that inhibits antitumor immunity. Treatment with immunomodulators, such as cytokines (e.g., IL-12), could modify the immune response. However, systemic administration of immunomodulators can cause toxicities. To avoid these toxicities, the immunomodulators could be produced locally in the tumor using an adenoviral vector able to ensure PCa-specific expression of the transgene. Our laboratory previously constructed such an adenovirus encoding the murine IL-12 (mIL-12) under the control of the PCa-specific promoter PCA3 and an amplification system called TSTA. This adenovirus, named Adv-PCA3-TSTA-mIL-12, was shown to reduce the growth of TRAMP-C2 prostate tumor in C57BL/6 mice. Here, we aimed to test a possible synergistic effect of the activation of OX40 to improve the response observed with Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. The murine OX40 (mOX40), along with its ligand (mOX40L), are immune checkpoints that belong to the Tumor Necrosis Factor superfamily. To achieve this goal, we proposed two approaches. In the first, we aimed to produce an Adv-PCA3-TSTA expressing mouse OX40L in order to use it in combination with Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. The Adv-PCA3-TSTA-mOX40L was constructed, but its capacity to induce mOX40L expression in TRAMP-C2 cells has not been confirmed yet. In the second, agonistic anti-mOX40 monoclonal antibody (mAb) would be administered in combination with Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. To test this approach, TRAMP-C2 cells were implanted in mice and tumors were treated by injections of Adv-PCA3-TSTA-mIL-12 alone or in combination with injections of anti-mOX40 or anti-mPD-1 (as comparator) mAbs. Results showed no statistically significant synergistic effects of the addition of treatment with anti-mOX40 to Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. The immune cells infiltrating tumors showed few significant changes, except for a decrease in CD8⁺+D-1+ cells in tumors treated with anti-mOX40 or anti-mPD-1 mAbs. The combination of OX40 stimulation with Adv-PCA3-TSTA-IL-12 appears to have no synergistic effect. We conclude by suggesting that more effective combinations should be looked for.

Le cancer superficiel de la vessie (CSV) est caractérisé par un taux de récidive élevé (60%). L’immunothérapie non-spécifique au BCG est actuellement le traitement le plus utilisé pour contrer les récidives du CSV. Un vaccin ciblant spécifiquement un antigène tumoral pourrait être plus efficace que le traitement BCG. Nous avons montré que l’antigène tumoral MAGE-A9 est exprimé dans 63% des tumeurs superficielles et que son expression était associée à la récidive et à la progression. Cette étude visait à mieux caractériser l’immunogénicité de MAGE-A9 en identifiant les épitopes reconnus par les lymphocytes T CD4+ et en analysant la séroprévalence anti-MAGE-A9 chez des patients atteints de CSV. Des peptides candidats, identifiés in silico, ont été testés en essais de prolifération avec des T CD4+ de souris transgéniques HLA-A2/DR1 présensibilisées à l’antigène. Pour analyser la séroréactivitié anti-MAGE-A9, la protéine a été produite et purifiée à partir du système d’expression Baculovirus. Les résultats obtenus et les réactifs développés au cours de ce travail seront utiles pour l’élaboration d’une immunothérapie contre le CSV.

L'utilisation d'agents chimiothérapeu tiques est souvent limitée par leur toxicité sur les cellules non pertinentes. Pour remédier à ce problème, nous avons utilisé des drogues dirigées de façon spécifique vers la tumeur grâce à leur association à des anticorps monoclonaux qui reconnaissent spécifiquement la cellule-cible. Nous avons évalué l'efficacité de ce modèle avec deux drogues couramment utilisées en thérapie, la daunorubleine et le chlorambucil, couplées a des anticorps mono clonaux dirigés contre un antigène de surface des lymphocytes T, 1'antigène Thy-1.1. Ces anticorps ont été produits en ascite chez des souris nu/nu et CDF1. Ils ont ensuite été purifiés sur DEAE-Sepharose CL-6B et leur activité sur les cellules AKR-SL3 (Thy-1.1 positives) a été prouvée par immuno fluorescence et ELISA. Une fois les conjugués obtenus, nous avons mesuré leur activité pharmacologique par des tests d'inhibition de croissance cellulaire sur les cellules de leucémie de souris P388-D1 (Thy-1.1 -) et AKR-SL3. Les conjugués se sont révélés beaucoup plus actifs (pourcentage de survie plus faible) sur la lignée AKR-SL3 que sur les cellules P388-D1. On constate aussi une augmentation de la spécificité par rapport a la drogue 119re. Cependant lorsqu'on utilise des conjugués non pertinents (dirigés contre des cellules d’adénocarcinome de colon humain, LoVo) on trouve une activité similaire à celle des conjugués drogue-anti-Thy-1.1. On ne peut donc pas vraiment parler de spécificité du modèle d'immunochimiothérapie. Nous avons aussi étudié l'action combinée des deux drogues sur les deux lignées leucémiques et une lignée myélomateuse (SP2/0-Ag-14) selon une représentation graphique appelée isobologramme. Cette représentation permet d'évaluer si l'action des drogues est antagoniste, synergique ou tout simplement additive. Sur les cellules AKR-SL3 et SP2/O-Ag-14, elle s'est avérée additive ; par contre sur les cellules P388-D1 elle est synergique. / Montréal Trigonix inc. 2018

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.