Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:15:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schons_PatriciaFernanda_D.pdf: 7426090 bytes, checksum: 313de43e28f0e8dfd168987a56f6a2c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Tanino acil hidrolase (TAH) conhecida como tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima que hidrolisa ésteres e taninos hidrolisáveis produzindo glicose e ácido gálico quando o meio reacional for polar. No entanto, a literatura indica sua capacidade de esterificar também ésteres de ácidos gálico em meio orgânico. Nosso grupo de pesquisa isolou um fungo, Paecilomyces variotii, produtor de tanase no ano de 2005 e desde então vem desenvolvendo estudos de produção, purificação, caracterização e aplicações desta enzima. Dando continuidade à linha de pesquisa, o objetivo deste trabalho foi estudar um processo de imobilização da tanase de Paecilomyces variotii empregando diferentes suportes e técnicas. Foram avaliados os parâmetros do processo de imobilização, a tanase livre e imobilizada foi caracterizada bioquimicamente ainda foi investigada a quimioseletividade da tanase imobilizada e livre para reações de síntese. A tanase foi imobilizada pelo método de adsorção em alumina, Amberlite, Accurel e celite; por ligação covalente em amberlite e Dowex ativados com polietilenoimina e glutaraldeído e em sílica, accurel e celite ativados com 3-aminopropiltrietoxisilano e glutaraldeído e por gelificação iônica em alginato de sódio, alginato de alga marrom, carragena, quitosana, pectina e goma gelana. A tanase imobilizada foi avaliada quanto a porcentagem de atividade enzimática e porcentagem de eficiência de imobilização. O processo de imobilização de tanase em alginato de sódio foi otimizado empregando a ferramenta de planejamento de experimentos. A tanase imobilizada em alginato na condição otimizada, foi avaliada quanto ao reuso e caracterizada bioquimicamente quanto ao pH e temperatura ótimos de atividade e de estabilidade e quanto a atividade frente a inibidores. Em adição ao processo de imobilização, foi avaliado o efeito do emprego de reticulantes: genipina, glutaraldeído, transglutaminase Activa® e transglutaminase de Streptomyces sp. CBMAI 837. As cápsulas obtidas foram avaliadas quanto à atividade enzimática, eficiência de imobilização e sua morfologia foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura. Dentre os suportes empregados para imobilização de tanase por adsorção, ligação covalente e gelificação iônica obteve-se maior porcentagem de atividade enzimática utilizando os suportes celite, sílica ativada com 3-aminopropiltrietoxisilano e glutaraldeído e alginato de sódio, respectivamente. A condição otimizada para a imobilização de tanase em alginato de sódio foi com 3,6% de alginato de sódio, cloreto de cálcio 0,1M, 3,6mg de tanase/mL de alginato e 6h de cura. Após o processo de otimização a tanase aumentou 35 vezes sua atividade enzimática. A tanase imobilizada em alginato de sódio nas condições otimizadas pode ser reutilizadas por até 5X mantendo 60% de sua atividade catalítica, as cápsulas apresentaram maior estabilidade quanto ao pH, temperatura e inibidores comparando com a tanase livre. Por fim, avaliouse a capacidade da tanase livre e imobilizada em sintetizar ésteres de ácido gálico. A tanase livre mostrou-se efetiva na síntese de galatos, especialmente, propilgalato com porcentagem de esterificação de 65%, já com a tanase imobilizada em alginato de sódio somente 8% de esterificação do propilgalato foi observado / Abstract: Tannin acyl hydrolase (TAH) known as tannase (EC 3.1.1.20) is an enzyme that hydrolyzes esters of hydrolysable tannins producing gallic acid and glucose as the reaction medium is polar. However, the literature indicates their ability to produce also gallic acid esters in organic media. Our research group has isolated a fungus, Paecilomyces variotii, tannase producer in 2005 and since then has been conducting studies of production, purification, characterization and applications of this enzyme. Continuing the research, the objective of this work was study a process to immobilize tannase from Paecilomyces variotii using different supports and techniques. Were evaluated the parameters of the immobilization process, free and immobilized tannase were characterized biochemically and yet been investigated quimioseletivity of tannase immobilized and free for synthesis reactions. Tannase was immobilized by adsorption onto alumina, Amberlite, Accurel and celite, by covalent binding in Amberlite and Dowex activated with polyethyleneimine and glutaraldehyde on silica, celite and Accurel activated with glutaraldehyde and 3-aminopropyltriethoxysilane and ionic gelation by sodium alginate, alginate from brown seaweed, carrageenan, chitosan, pectin and gellan gum. The immobilized tannase was evaluated as the percentage of enzyme activity and percentage of immobilization efficiency. The immobilization process of tannase in sodium alginate was optimized using the experimental design method. After the optimization process the tannase immobilized in alginate was evaluated for reuse and characterized biochemically for pH and temperature optima for activity and stability and the activity against inhibitors. In addition to the immobilization process, we evaluated the effect of the use of cross-linking: genipin, glutaraldehyde, Transglutaminase Activa ® and the transglutaminase from Streptomyces sp. CBMAI 837. The capsules obtained were evaluated for percentage of enzymatic activity, percentage of immobilization efficiency and their morphology was studied by scanning electron microscopy. Among the carriers used for immobilization of tannase by adsorption, covalent and ionic gelation has been a higher percentage of enzyme activity using the supports celite, silica activated with glutaraldehyde and 3-aminopropyltriethoxysilane and sodium alginate, respectively. The optimal conditions for immobilization of tannase in sodium alginate were 3.6% sodium alginate, calcium chloride 0.1 M, 3.6 mg of tannase / mL alginate and 6h of cure. After the optimization process, the tannase activity increased by 35 times. The tannase immobilized on sodium alginate in the optimized conditions can be reused up to 5X keeping 60% of its catalytic activity, the capsules showed greater stability for pH, temperature and inhibitors compared with free tannase. Finally, we evaluated the ability of free and immobilized tannase in synthesizing esters of gallic acid. The free tannase proved to be effective in the synthesis of gallates, especially propyl gallate with a percentage of esterification of 65%, with the immobilized tannase in sodium alginate was observed only 8% of propyl gallate esterification / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Carol Hollingworth Collins / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T16:24:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chaudhry_ZahraFazal_D.pdf: 3872022 bytes, checksum: b24a0aac0711390db05a94078e2b747f (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: As fases estacionárias (FE) são consideradas uma das peças chave na técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Neste trabalho foram avaliadas FE preparadas a partir de seis diferentes sílicas utilizadas como suporte para a imobilização do polímero poli(metiloctadecilsiloxano) (PMODS). Três destes suportes são sílicas com poros grandes, que atualmente apresentam grande aplicação em separações de macromoléculas. O primeiro passo para os testes cromatográficos das FE desenvolvidas foi o preparo de uma nova mistura padrão. A partir dela foi possível avaliar comparativamente as principais características das novas FE como a eficiência, a hidrofobicidade, a capacidade de separação de compostos de estruturas espaciais similares além de compostos de diferentes polaridades. Durante o estudo da metodologia de preparo das FE, definiu-se o tratamento térmico como a técnica utilizada para a imobilização do polímero sobre o suporte. Análises de ressonância magnética nuclear mostraram que, através desta metodologia, o polímero é adsorvido sobre a superficie de sílica formando uma monocamada estável distribuída de forma altamente favorável ao processo de transferência de massa entre a FE e a fase móvel (FM). Os suportes de sílica foram divididos em dois grupos, de acordo com suas caracteristicas estruturais, e em cada um dos grupos, foi realizada a otimização de variáveis como a carga de polimero adsorvido na superficie do suporte, a temperatura ideal de imobilização térmica e o tempo de imobilização. Os resultados obtidos através de testes cromatográficos mostraram que a variável tempo de imobilização é extremamente relevante no desempenho e eficiência das FE devendo ser ajustada seguindo as caracteristicas estruturais do suporte. Isto se deve principalmente à maneira como se organizam as cadeias do PMODS dentro dos poros da sílica e sobre sua superficie. Esta técnica de imobilização por tratamento térmico produziu FE de grande eficiência, capazes de realizar separações similares às observadas em colunas cromatográficas comerciais, como foi comprovado pelos resultados de separações de fármacos e pesticidas avaliados neste trabalho. / Abstract: Stationary phases (SP) are an important component in HPLC technique. ln this work, SP with the polymer poly(methil octadecylsiloxane) (PMODS) immobilized onto six different silica surfaces were evaluated. Three of these supports were wide pore silicas that offer ample application in macromolecule separations. The first step for the chromatograprnc tests was to develop a new test mixture of analytes. This test rnade possible comparative evaluations of the to main characteristics of the newly prepared SP, such as efficiency, hidrofobicity and the separation capacity of compounds with different polarities. During the study of SP preparation methodology, thermal treatments were defined as the technique for immobilization of PMODS onto the silica supports. Analyses of nuclear magnetic resonance demonstrated that, through this methodology, the polymer is sorved on the silica surface forming a distributed stable monolayer, leading to a highly favorable mass transfer process between SP and mobile phase (MP). The silica supports were divided into two groups according to their structural characteristics. In each group, optimization of variables, such as polymer load and the ideal temperature and time of thermal immobilization, was performed. The chromatographic results showed that time of immobilization is an extremely important variable for SP efficiency and that it should be adjusted according to the structural characteristics of the support. This is due mainly to the manner in which PMODS chains are organized inside the pores of silica surface. The proposed technique of immobilization by thermal treatment produced high efliciency SP that offer potential for applications in chemical separations similar to thase observed with commercially available columns, as showed by separations of pharmaceutical compounds and herbicides with these new chromatographic columns. / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

Orientadores: Ranulfo Monte Alegre, Jorge Alberto Vieira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:42:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castiglioni_GabrielLuis_D.pdf: 2848307 bytes, checksum: 09e1e37498a764f275a4ed9afe996844 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Os avanços biotecnológicos na produção industrial de lipases têm proporcionado sua aplicação nos diferentes setores. Este interesse se deve à capacidade destas enzimas catalisarem algumas reações, dentre elas a transesterificação. Esta reação é reversível e resulta em altos rendimentos a partir da otimização de parâmetros experimentais, tais como, temperatura, concentração do catalisador, razão molar álcool:óleo, entre outros. Um grande número de trabalhos voltados para a produção de biodiesel por via enzimática vem sendo feito devido às vantagens a ela associada. Tendo em vista estas observações, o presente trabalho teve por objetivo o estudo da produção de lipase microbiana e sua aplicação na síntese de biodiesel. As etapas envolvidas neste projeto foram: produção de lipase por diferentes microrganismos utilizando fermentação submersa e semi-sólida; uso de diferentes reatores e meios de cultivo; escolha e caracterização da lipase que melhor apresentou vantagens em relação à produtividade e à atividade de transesterificação; estudo de imobilização e reutilização da lipase em diferentes resinas hidrofóbicas e de troca iônica; estudo da influência do tempo de reação, temperatura, pH, concentração de água, etanol e enzima, além da adição de co-solvente, goma arábica e íons metálicos na síntese do biodiesel. Efeitos positivos nos experimentos foram verificados quando se adicionou KH2PO4 e água de maceração de milho no processo de produção de lipase pela Burkholderia cepacia. Esta cepa apresentou maior potencial de produção de lipase com atividade de transesterificação do óleo de soja e etanol comparada com os demais microrganismos estudados. A caracterização da lipase demonstrou que os melhores resultados foram a 37°C e pH 8,0, seguindo modelo de inativação enzimática de primeira ordem. A resina de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB juntamente com a Amberlit IRA-900 apresentaram maior potencial de imobilização e utilização para a síntese do biodiesel. Nos experimentos de transesterificação, as variáveis estudadas apresentaram efeito na respostas de síntese de biodiesel. Os melhores resultados encontrados foram: pH igual a 6,0, temperatura em ttorno de 50ºC, uso de éter de petróleo como co-solvente, concentração de etanol próxima à quantidade estequiométrica e concentração de aproximadamente 42% de água. Por fim, na reutilização das resinas de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB e Amberlit IRA-900, foi observada uma diminuição no rendimento da reação devido à perda de parte da enzima por lixiviação. Os resultados referentes à primeira resina mostraram que a perda da atividade está relacionada ao número de usos e segue uma função de primeira ordem. A constante de perda da atividade foi de 3,017 e o tempo de meia vida do processo 18 usos. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx determinados na reação foram de 21,98% e 14,56%p.h-1, respectivamente. Já em relação à reutilização da lipase imobilizada na segunda resina, o tempo de meia vida foi de 6 usos. Com isso o presente trabalho apresenta uma contribuição significativa no que diz respeito ao uso de lipase de Burkholderia cepacia e agrega soluções para viabilizar o processo de transesterificação com esta enzima / Abstract: The technological advancements in the industrial production of lipases have been making its application viable in different sectors. This interest is due to these enzymes capacity to catalyze some reactions, like the transesterification. This reaction is reversible and the optimization of experimental parameters such as temperature, catalyst concentration and ethanol-to-oil molar ratio results in a high production efficiency. A great number of studies about the enzymatic production of biodiesel have been done due to its related advantages. Considering these observations, the objective of this work was to study the production of microbial lipase and its application in the synthesis of biodiesel. The stages involved in this project were: lipase production by different microorganisms using submerged and semisolid fermentation; use of different reactors and cultivation media; selection and characterization of the lipase that showed advantages related to the productivity and to the transesterification activity; study of the immobilization and reutilization of the lipase in different hydrophobic and ionic exchange resins; study of the influence of reaction time, temperature, pH, water, ethanol and enzyme concentrations and the addition of cosolvents, arabic gum and metallic ions in the synthesis of biodiesel. Positive effects were verified in the experiments when KH2PO4 and corn maceration liquor were added to the process of lipase production by Burkholderia cepacia. Compared with the other microorganisms studied, that strain showed greater potential for the production of lipase with activity of transesterification of soy oil and ethanol. The characterization of the lipase showed that the best results occurred at 37°C and pH 8.0, following the model of first order enzymatic inactivation. The poly(styrene-co-divinylbenzene) resin with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 presented greater potential for the immobilization and synthesis of the biodiesel. In the transesterification experiments, the studied variables affected the response of the biodiesel synthesis. The best results were found at pH 6.0, temperature of 50ºC, petroleum ether as co-solvent, ethanol concentration at stequiometric values and water concentration around 42%. Finally, due to the loss of enzyme by lixiviation, it was observed a decrease in the efficiency of the reaction when the poly(styrene-codivinylbenzene) resins with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 were reused. The results referring to the first resin showed that the loss of activity is related to the number of utilizations and it follows a first order function. The activity loss rate was 3.017 and the half-life of the process was 18 uses. The kinetic parameters Km and Vmax determined for the reaction were respectively 21.98% and 14.56%p.h-1. Referring to the reutilization of the lipase immobilized in the second resin, the half-life was 6 uses. Thus, this work presents a relevant contribution to the use of the lipase of Burkholderia cepacia and adds solutions to make the process of transesterification with this enzyme viable / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientador: Luiz Carlos Vulcano / Coorientador: Marco Antonio Rodrigues Fernandes / Banca: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Sheila Canevese Rahal / Resumo: No Brasil, o uso da radioterapia na medicina veterinária ainda é incipiente, com apenas estudos em nível de pesquisa científica e poucos grupos de especialistas dedicados a esse tipo de trabalho. Centros de radioterapia veterinária já existem em outros países como Estados Unidos, França, Canadá, Inglaterra, e até mesmo na Argentina. Os resultados apresentados nestas clínicas são bastante incentivadores e promissores. Muitos dos estudos desenvolvidos na radioterapia veterinária são derivados e facilitadores da implementação na medicina humana. A Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da UNESP de Botucatu foi contemplada com um novo equipamento do tipo acelerador linear, o qual será instalado no setor de radiologia veterinária. Este trabalho apresenta os protocolos clínicos específicos para a radioterapia veterinária usados em alguns dos centros atualmente em funcionamento. Foram desenvolvidos acessórios para imobilização de pequenos animais, visando o posicionamento durante o planejamento tomográfico e a reprodutibilidade dos procedimentos de radioterapia. Para a produção foi utilizado acrílico liso, madeira do tipo Medium Density Fiberboard (MDF), silicone de condensação (Speedex putty) e um catalizador universal (Speedex). Os acessórios produzidos foram a rampa de MDF, as cunhas de posicionamento e o suporte para o molde dentário, os quais, após testados em um animal durante a simulação, demostrou ser eficaz na utilização em pequenos animais e nos procedimentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Radiation therapy is a medical modality that uses sources of ionizing radiation for the treatment of diseases, and is already a medical procedure well established in human medicine, however, in Brazil, the use of this technique in veterinary medicine is still in its incipient, with only studies in scientific research level and few groups of specialists dedicated to this type of work. Veterinary radiotherapy centers already exist in other countries like USA, France, Canada, England, and even in Argentina. The results presented in these clinics are very incentive and promising. Many of the studies developed in veterinary radiation and enhancers are derived implementation in human medicine. The Scholl of Veterinary Medicine and Animal Science (FMVZ) of UNESP in Botucatu is funding a new linear accelerator will be installed in the veterinary radiology sector. However, it is necessary to establish specific clinical protocols, in addition to produce a routine guide procedures and techniques that are appropriate to the reality of the veterinary clinic. The success of radiation therapy depends on several factors, among which, the daily reliability of the planned treatment field, which requires immobilization of the target volume irradiation. In this respect, due to the peculiarities of handling routine veterinary patients, most procedures should be monitored anesthesia of the animal. To minimize this fact, methods and immobilization accessories were developed in this work for the application in different types of animals undergoing radiotherapy. / Mestre

A descoberta de inibidores seletivos é extremamente importante para o desenvolvimento de novos fármacos que possam ser usados no tratamento de pacientes diagnosticados com a doença de Alzheimer (DA). Neste contexto, o desenvolvimento de métodos de triagem para a identificação de novos compostos biologicamente ativos se torna interessante. Butirilcolinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) é uma serina hidroxilase que está classicamente associada à hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh) formando colina e ácido acético. Este trabalho descreve a imobilização covalente da BChE de soro humano nas paredes internas de capilares de sílica fundida utilizando o agente espaçador glutaraldeído, e sua aplicação na triagem de inibidores seletivos. O ICER-BChE resultante foi conectado a um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência com monitoramento on line da atividade catalítica, envolvendo detecção UV. Após os estudos das melhores condições cromatográficas, variações de pH e vazão e a influência de solventes orgânicos na atividade enzimática o método foi validado com o uso de inibidores padrões. O maior valor obtido com o ICER-BChE no parâmetro cinético, constante de Michaelis KM = 33,6 ± 6,9 mM, comparado com a enzima em solução, KM = 0,12 ± 0,02 mM, evidencia o efeito da imobilização sobre a afinidade pelo substrato. No entanto, houve retenção da atividade catalítica e seletividade frente a inibidores padrão. O método foi aplicado na triagem de novos ligantes utilizando cinco coleções de diferentes classes de compostos, entre derivados cumarínicos, complexos metálicos com cobre (Cu), complexos metálicos com cobalto (Co) e zinco (Zn), glicosídeos, e derivados de fenilpropanóides e ácido barbitúrico. Desta triagem foram selecionados sete compostos promissores com os quais foram realizados os estudos sobre a potência mínima inibitória (IC50) e destes quatro foram escolhidos para estudos de mecanismos de ação utilizando o ICER-BChE. Dos complexos metálicos os melhores compostos foram o HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), o NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) ambos com mecanismo competitivo o HesFCu (IC50 = 13,6 ± 2,9 µM), o NNINABCu (IC50 = 94,8 ± 16) e o NarFCu (IC50 = 81,7 ± 13). Dos derivados cumarínicos os compostos 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) e 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) apresentaram mecanismo incompetitivo. Os resultados demonstraram que a abordagem proposta é útil na triagem on line de inibidores seletivos, pois fornece resultados rápidos, precisos e reprodutíveis. / The discovery of selective inhibitors is extremely important for the development of drugs that can be used in the treatment of patients diagnosed with the Alzheimer disease (AD). In this context, the development of screening methods for the identification of new, biologically active compounds is a challenging task. Butyrylcholinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) is a serine hydroxylase that is classically associated with the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh), which yields choline and acetic acid. This paper describes the development of capillary enzyme reactors (ICERs) containing BChE from the human serum, covalently immobilized onto silica fused capillaries, using glutaraldehyde as spacer, and its application in the screening of selective inhibitors. The resulting BChE-ICER was connected to a liquid chromatography system high efficiency where monitoring of activity was online involving UV detection. After studying the best chromatographic conditions, pH variations, flow-rate and the influence of organic solvents on enzyme activity method was validated using standard inhibitors. The higher value obtained with the BChE-ICER in kinetic parameter, constant Michaelis KM = 33.6 ± 6.9 mM, compared with the enzyme in solution, KM = 0.12 ± 0.02 mM, shows the effect of immobilized on the affinity substrate. However, there was retention of catalytic activity and selectivity towards standard inhibitors. The method was applied in the screening of new ligands using collections of five different compounds, among coumarin derivatives, metal complexes with copper (Cu) metal complexes with cobalt (Co) and zinc (Zn), glycosides, phenylpropanoids and derivatives, and barbituric acid. These screenings were selected seven promising compounds with which the studies were made on the minimum inhibitory potency (IC50) and these four were chosen for studies of mechanisms of action using the ICER-BChE. Of the compounds metal complexes best were HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) both competitive mechanism, the HesFCu (IC50 = 13.6 ± 2.9 µM), NNINABCu (IC50 = 94.8 ± 16 µM) and NarFCu (IC50 = 81.7 ± 13 µM). Of coumarin derivatives, 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) and 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) showed mechanism uncompetitive. The results demonstrated that the proposed approach is useful in screening for selective inhibitors online because it provides quick results, accurate and reproducible.

O presente projeto teve como objetivo selecionar componentes orgânicos para obtenção de compósitos híbridos pela técnica sol-gel utilizando como precursor tetraetilortossilicato (TEOS) visando avaliar o efeito do agente orgânico na evolução do sol para gel e nas propriedades finais dos suportes para imobilizar a lipase microbiana de Burkholderia cepacia. Foram testados três compostos orgânicos ?-ciclodextrina (?CD), carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC) e os resultados obtidos foram comparados com o comportamento já estabelecido para o polivinilálcool (PVA), tanto em termos morfológicos como atividade catalítica em meio aquoso (hidrólise de triacilgliceróis) e meio orgânico (síntese de éster de cadeia curta e longa). A motivação do estudo está diretamente relacionada com a elevada afinidade do suporte híbrido SiO2-PVA pelo glicerol, sendo uma das limitações do uso deste suporte para imobilizar lipases com finalidade de aplicação em reações de transesterificação conduzidas em fluxo contínuo. As características morfológicas e estruturais dos suportes resultantes foram determinadas empregando técnicas convencionais, indicando similaridade das propriedades estruturais, fornecendo suportes com áreas superficiais entre 361,6 a 529,7 m2 g-1 e morfologia amorfa. A diferença marcante entre os suportes foi verificada quanto a capacidade de adsorção do subproduto da reação de transesterificação, sendo verificado que a substituição do polivinilálcool por ?-ciclodextrina reduziu em até 50% a habilidade do suporte hibrido em absorver glicerol. Os componentes derivados de celulose apresentaram resultados similares aos obtidos com o polivinilálcool. Em termos de afinidade pelo glicerol os resultados obtidos permitiram a classificação dos suportes híbridos na seguinte ordem crescente: SiO2-CMC > SiO2-PVA > SiO2-HEC > SiO2- ?CD. Quanto a afinidade dos suportes para imobilização da lipase de B. cepacia, os valores de atividade hidrolítica dos derivados imobilizados, nas condições adotadas, revelaram que todos os suportes tiveram o mesmo tipo de interação com a enzima resultando em valores de recuperação de atividade na faixa de 56 - 63%, valores próximos aos normalmente obtidos pela matriz de SiO2-PVA (68%). Os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) determinados indicaram que a lipase imobilizada nos diferentes tipos de suporte, apresentou afinidade semelhante pelo substrato azeite de oliva. Os valores determinados de Km e Vmax da lipase de B. cepacia na forma livre (Km = 410 mM e Vmax =12391 Ug-1) mostraram que independente do suporte, a imobilização reduziu aproximadamente 60% da afinidade da enzima pelo substrato. Em meio orgânico, tanto as reações de esterificação como de transesterificação mediadas pelos derivados imobilizados apresentaram desempenho similar com atividade de esterificação da ordem de 118 ?M.g-1min-1 e rendimentos de formação de ésteres etílicos da ordem de 98,30%. De uma forma geral, os resultados obtidos foram promissores e permitiram selecionar o composto orgânico ?CD para substituir com vantagens o polivinilálcool no preparo de matrizes hibridas para imobilização da enzima lipase. O menor poder hidrofílico desta matriz em relação às outras matrizes testadas pode ser creditado a estrutura cíclica da ?CD que reduziu a capacidade do suporte SiO2-?CD em adsorver glicerol, principal subproduto da reação de transesterificação. Testes em processos conduzidos em fluxo contínuo são sugeridos para comprovação da eficiência dessa matriz. / The objective of this work was to select organic compounds for preparing hybrid composites by the sol-gel technique using tetraethylorthosilicate (TEOS) as precursor aiming at evaluating the effect of the organic agent in the transformation of the sol into gel and in the final properties of the matrices for immobilizing lipase from Burkholderia cepacia. Three organic components ?-cyclodextrin (?CD), carboxymethylcellulose (CMC) and hydroxyethylcellulose (HEC) were tested. The organic component polyvinyl alcohol (PVA) was used as control taking into consideration its morphological properties and the catalytic activity of the immobilized derivative in aqueous medium (triacylglycerols hydrolysis) and organic medium (synthesis of short and long chain esters). The motivation of this work was directly related with the high affinity of the matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2- PVA) by the glycerol, limiting the use of the immobilized derivative in the transesterification reactions running on a continuous flow. The morphological and structure properties of the resulting matrices was determined using conventional techniques, showing similar structure properties, with surface area values between 361.6 and 529.7 m2g-1 and amorphous morphology. The main difference among the matrices were observed regarding their ability to adsorb glycerol, the main byproduct of the transesterification reaction. It was verify that the replacement of the polyvinyl alcohol by ?-cyclodextrin reduced in about 50% the hybrid composite capacity to adsorb glycerol. On the other hand, the cellulose components showed similar results as the polyvinyl alcohol. Considering as an evaluated parameter the glycerol affinity, the achieved results allowed classifying the hybrid composites as follows: SiO2- CMC > SiO2-PVA > SiO2-HEC > SiO2-?CD. The performance of the hybrid composites for immobilizing lipase from B. cepacia, through the hydrolytic activity reveal that all the matrices show the same interaction with the lipase, resulting in activity recovered values between 56-63%, which is close to the value attained by SiO2-PVA matrix (68%). The kinetic parameters (Km and Vmax) values determined for free lipase (Km = 410 and Vmax = 12391 Ug-1), showed that independely of the immobilization support the affinity of the enzyme for the substrate was reduced by 60%. In organic medium, all the immobilized derivatives showed similar behavior on both esterification and transesterification reactions attaining esterification activity of 118 ?M.g-1min-1 and ethyl ester yields of 98.30%. Overall, the results were promising and allowed selecting the organic component ?CD to replace, with advantages, the use of PVA for preparing hybrid composites. The lower hydrophilic capacity of this matrix compared with the others matrices can be explained by the cyclic structure of the ?CD that reduced the capacity of the SiO2-?CD matrix in the glycerol adsorption, the main byproduct of the transesterification reaction. Assays carried out in packed bed reactor running on a continuous basis are propose to confirm the efficiency of this matrix.

Os fungos filamentosos são utilizados em larga escala na produção de produtos biotecnológicos na indústria devido a sua versatilidade e um dos exemplos são as peptidases que representam uma das principais classes de enzimas hidrolíticas. As peptidases são hidrolases que catalisam a quebra das ligações peptídicas das proteínas e que nos microrganismos são responsáveis por funções fisiológicas e patológicas, além de ter muitas aplicações em diversos campos industriais. Neste estudo foram analisados diferentes bioprocessos fermentativos para produção de peptidases pelo fungo Aspergillus terreus. Este microrganismo foi capaz de produzir peptidases em ambos os bioprocessos, sólido ou submerso, obtendo melhor performance e o pico de produção no bioprocesso fermentativo sólido de valor 677U/mL, nas condições 5g de farelo de trigo, 72 horas, 30°C e 75% de umidade. Utilizando o bioprocesso fermentativo submerso também obtivemos resultados satisfatórios com pico de atividade de 360U/mL, nas condições de meio padrão suplementado com Caseína 0,5%, 72 horas e 35°C. A caracterização bioquímica parcial dos extratos dos dois bioprocessos mostrou semelhanças entre algumas características das enzimas produzidas como a faixa extensa de pH ótimo abrangendo regiões ácidas, neutra e alcalinas, temperatura ótima pontual de 55°C e perfil de inibição pelo PMSF e EDTA. Contudo, os perfis de estabilidade (pH e temperatura) e comportamento frente a adição de íons apresentaram respostas diferentes entre si, o que sugere a produção de enzimas diferentes produzidas pelo mesmo fungo em meios distintos. A microencapsulação por Spray Drying como processo de estabilização foi satisfatória obtendo rendimentos de 37,5-58,2% e com níveis acima de 50% de atividade enzimática. Em contrapartida, a imobilização enzimática demonstrou ser eficaz na etapa de ligação ao suporte, mas não foi capaz de estabilizar a enzima presente no extrato, o que ficou caracterizado pela perda de atividade proteolítica. / Filamentous fungi are extensively used in the production of biotechnological products in industry because of their versatility and one of the examples are peptidases which constitute a major class of hydrolytic enzymes. The peptidases are hydrolases which catalyze the cleavage of peptide bonds of proteins and microorganisms that are responsible for the physiological and pathological roles, in addition to having many applications in various industrial fields. This study evaluated various bioprocesses for fermentative production of peptidases by the fungus Aspergillus terreus. This microorganism was able to produce peptidase in both bioprocess, solid or submerged, achieving better performance in the solid bioprocess with peak of production of 677U/mL under the conditions 5g wheat bran, 72 hours, 30°C and 75% humidity . Using submerged fermentation bioprocess we also obtained satisfactory results with peak of activity of 360U/mL with conditions of standard medium supplemented with 0.5% casein, 72 hours and 35°C. Biochemical characterization of the two partial purified extracts showed similarities between some characteristics of the enzymes produced, as large optimum pH range spanning regions acidic, neutral and alkaline point temperature optimum of 55 ° C and the inhibition profile of PMSF and EDTA. However, the stability profiles (pH and temperature) and behavior in addition ions showed different responses to each extract, which suggests the production of different enzymes in different ways. Microencapsulation by Spray Drying and stabilization process was obtaining satisfactory yields of 37.5 to 58.2%, with levels above 50% of enzyme activity. In contrast, the enzyme immobilization step was effective in bonding the support, but was not able to stabilize the enzyme present in the extract, which was characterized by the loss of proteolytic activity

O presente projeto teve como objetivo sintetizar matrizes magnetizadas para imobilização da lipase de Burkholderia cepacia para aplicação na síntese de ésteres alquilicos. Foram testadas duas metodologias para síntese de compósitos formados por óxidos magnéticos dispersos em matriz de sílica, a saber: a) matriz polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) dopada com Fe3O4 e ?Fe2O3 e b) matriz polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) sintetizada com incorporação de Fe3O4 e ?Fe2O3. As matrizes polissiloxano-álcool polivinílico (SiO2-PVA) e partículas de Fe3O4 e ?Fe2O3 foram usadas como controles. As características texturais e morfológicas das matrizes magnéticas e não magnética foram determinadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), difratograma de raios-X, espectroscopia no infravermelho (IV) e análise de tamanho de poros (BET). As partículas de magnetita (Fe3O4) e maghemita (?Fe2O3) apresentaram comportamento superparamagnético. A lipase de B. cepacia foi imobilizada nas quatro matrizes (magnetizada e não magnetizada) por adsorção física e ligação covalente e os rendimentos de imobilização similares obtidos sugerem que as partículas de ferro não interferiram na interação enzima-suporte. Entretanto, os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) determinados indicaram que a lipase imobilizada nos suportes magnetizados tem menor afinidade pelo substrato. Os valores determinados de Km e Vmax da lipase de B. cepacia na forma livre (Km = 400 ± 32 mM e Vmax = 16019 ± 749 Ug-1) mostraram que independente do suporte a imobilização reduziu aproximadamente 50% da afinidade da enzima pelo substrato. Os derivados imobilizados obtidos por ligação covalente foram selecionados para mediar reações de transesterificação do óleo de coco pela rota etanólica e demonstraram eficiente desempenho, fornecendo conversões praticamente totais em ésteres de etila entre 72-96h. A menor velocidade de reação foi verificada para a lipase imobilizada em partículas de Fe3O4 e ?Fe2O3, provavelmente devido à interferência negativa do óxido de ferro que reduziu a afinidade da enzima pelo substrato, corroborando com os parâmetros cinéticos Km e Vmax. As amostras purificadas apresentaram propriedades que atendem às especificações exigidas pela Agência Nacional de Petróleo (ANP) para uso como biocombustível, incluindo: pureza elevada em ésteres etílicos (mínimo 96%), densidade (873-876 kgm-3) e viscosidade cinemática (3,76-3,93 mm2s-1). / The objective of this work was to synthesize magnetic matrices for immobilization of Burkholderia cepacia lipase to be used in the synthesis of alkyl esters. Two methods for the synthesis of the magnetic composites dispersed in silica matrices were tested: a) matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2-PVA) coating with Fe3O4 and ?Fe2O3 and b) matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2-PVA) synthesized with incorporation of Fe3O4 and ?Fe2O3. The matrix polysiloxane-polyvinyl alcohol (SiO2-PVA) and the composite Fe3O4 and ?Fe2O3 particles were used as controls. The morphological and textural characteristics of the magnetic and nonmagnetic matrices were determined by analysis of pore size (BET), scanning electron microscopy (MEV), X-ray diffraction and infrared spectroscopy (IV). The magnitete (Fe3O4) and maghmitite (?Fe2O3) particles showed super paramagnetic behavior. The lipase B. cepacia was immobilized in the matrices (magnetized and non-magnetized) by physical adsorption and covalent attachment and the similar immobilization yields obtained suggest that the iron particles did not affect the enzyme-support interaction. However, the determined kinetic parameters (Km and Vmax) indicated that the lipase immobilized in both magnetized SiO2-PVA matrices had lower affinity for the substrate. The Km and Vmax values determined for free lipase (Km = 400 ± 32 mM and Vmax =16019 ± 749 Ug-1), showed that independely of the immobilization support the affinity of the enzyme for the substrate was reduced by 50%. The immobilized derivatives prepared by covalent attachment were used to mediate the transesterification reactions of coconut oil by ethanolysis route. All immobilized derivatives were efficient in the ethanolysis of coconut oil attaining total conversion to ethyl esters in 72 hours, with the exception of the immobilized lipase on Fe3O4 and ?Fe2O3 particles, which provided total conversion in 96 h, probably due to the negative influence of the iron particles on the enzyme. The purified product samples (biodiesel) were essentially odorless and translucent appearance. The purity of the ethyl esters was high. In addition, other properties such as density (873-876 kg m-3) and viscosity (3.76-3.93 mm2 s-1) meet the specifications required by the National Petroleum Agency (ANP) to be used as a biofuel.

O objetivo deste trabalho foi contribuir no desenvolvimento de técnicas para obtenção de biocatalisadores imobilizados de baixo custo e alto poder catalítico para ser empregado na síntese de biodiesel a partir de óleos vegetais pela rota etílica. Baseia-se na utilização de células íntegras de fungos filamentosos com elevada atividade lipolítica (glicerol éster hidrolase - E.C. 3.1.1.3) imobilizadas em suporte adequado. O trabalho experimental foi desenvolvido em diferentes etapas e iniciado pela triagem de linhagens de fungos adquiridas de banco de cultura nacional, com habilidade de produzir lipase intracelular em cultivo submerso. Mediante a avaliação da atividade lipolítica do micélio, foram selecionadas as linhagens dos fungos: Rhizopus oryzae (3231 e 4692), Mucor circinelloides (4140 e 4182) e Penicillium citrinum (4216) e efetuados testes de imobilização por adsorção física (in situ e extra-situ) da biomassa produzida, utilizando os seguintes suportes: espuma de poliuretano, Celite e polihidroxibutirato. Nas condições testadas, o melhor desempenho foi alcançado pela matriz de poliuretano que permitiu a retenção de elevada concentração de biomassa celular para todas as linhagens selecionadas, exceto para fungo de P.citrinum (4216). Testes adicionais de imobilização da biomassa celular na espuma de poliuretano foram efetuados, complementando desta forma, as propriedades físicas e morfológicas desse suporte e do sistema imobilizado. Os resultados indicaram que espumas de poliuretano cortadas em cubos de 6 mm foram mais adequadas para promover completa adsorção da biomassa celular produzida pelos fungos selecionados, em especial do fungo M. circinelloides 4182, que apresentou elevado poder catalítico na reação de transesterificação. Em virtude desse fato, as condições de cultivo dessa linhagem foram estudadas, mediante variação das fontes de carbono e nitrogênio, aeração e inóculo. O biocatalisador obtido nas melhores condições (atividade lipolítica= 65 U/g) foi utilizado na etanólise do óleo de babaçu e o processo foi otimizado por meio de um delineamento fatorial, avaliando-se a influência da temperatura (33 - 47C) e da razão molar entre óleo de babaçu e etanol (1:4,8 - 1:13,2) no rendimento de transesterificação. As condições otimizadas preditas pelo planejamento fatorial foram: temperatura de 35°C e razão molar etanol/óleo de 6:1, obtendo-se rendimento de 90,5% empregando 20% m/m de biocatalisador e terc-butanol como solvente. A estabilidade operacional do biocatalisador foi avaliada em reator operando em regime de bateladas consecutivas e em regime contínuo. Resultados satisfatórios foram obtidos em ambos os sistemas, entretanto o sistema contínuo evitou a dessorção do micélio do suporte, revelando tempo de meia-vida do biocatalisador superior a 20 dias. Finalmente, a influência de óleos vegetais contendo diferentes composições em ácidos graxos (andiroba, macaúba, pinhão manso e palma) foi avaliada na reação de etanólise, sendo constatado a preferência do biocatalisador na transesterificação de ácidos graxos de cadeia média, presentes nos óleos de babaçu e macaúba. De forma geral, os resultados obtidos foram promissores e demonstraram a potencialidade de células íntegras de fungos filamentosos imobilizadas na síntese de biodiesel, com destaque para o desempenho obtido pelo fungo Mucor circinelloides 4182. / The objective of this work was contributed in developing techniques to obtain immobilized biocatalysts with low cost and high catalytic activity to be applied in the biodiesel synthesis by ethanol route. It is based on the utilization of filamentous fungi whole cells with high lipase activity (glycerol ester hydrolase - E.C.3.1.1.3) immobilized in suitable support. The experimental work was developed in different ways and started by screening fungi strains acquired from National Culture Collection which has the ability to produce intracellular lipase in submerse cultivation. Through lipase activity the fungi strains: Rhizopus oryzae (3231 and 4692), Mucor circinelloides (4140 e 4182) and Penicillium citrinum (4216) were selected. Tests to evaluate the biomass immobilization by physical adsorption (in situ and extra-situ) using the supports: polyurethane foam, Celite and polyhidroxybutyrate were carried out. The best performance was attained by polyurethane matrix that allowed attain high biomass concentration for all strain fungi, except for P. citrinum (4216). Additional tests were performed to complement the physical and morphological properties of support and immobilized system. Results indicated that polyurethane foam cut in cubes 6-mm were suitable to provide full adsorption of biomass from all selected fungi strains, specially strain of M. circinelloides 4182 displayed high catalytic activity in the transesterification reaction. Consequently, cultivation conditions of this strain were studied, evaluating the carbon and nitrogen sources, aeration and inoculum level. The biocatalyst obtained under the best conditions (lipase activity = 65 U/g) was used in the ethanolysis of babassu oil and the process was optimized by experimental design. The influence of temperature (33 - 47?C) and ethanol to oil molar ratio (4.8:1 - 13.2:1) were investigated in the transesterification yield. Under the optimized conditions (35°C and oil to ethanol molar ratio 6:1) transesterification yield of 90.5% was obtained employing 20% wt. of biocatalyst and tert-butanol as solvent. The biocatalyst operational stability was assessed under consecutive batch runs and continuous system. Satisfactory results were attained in both systems, however, the continuous system avoided cells desorption from support, revealing biocatalyst half life higher than 20 days. Finally, the influence of vegetable oils with different fatty acid compositions (babassu, andiroba, macauba, Jatropha, palm) was studied in the ethanolysis reaction, being evidenced the specificity of the biocatalyst to transesterify medium chain fatty acids as presented in babassu and macauba oils. The results obtained were promise and demonstrated the potential of filamentous fungi whole cells immobilized as biocatalysts in the biodiesel synthesis, with prominence to the performance of Mucor circinelloides 4182 strain.

A imobilização prolongada do aparelho locomotor, embora usada com finalidades terapêuticas, leva à osteopenia, o que causa enfraquecimento ósseo. Foi investigado se o uso concomitante do alendronato de sódio (um inibidor da atividade osteoclástica) é capaz de diminuir ou prevenir o enfraquecimento ósseo causado pela imobilização. Ratas fêmeas Wistar, adulta-jovens foram distribuídas em seis grupos: não imobilizado e sem tratamento (controle); não imobilizado + alendronato diário (0,1 mg/kg); não imobilizado + alendronato semanal (0,7 mg/kg); imobilizado e sem tratamento; imobilizado + alendronato diário (0,1 mg/kg); imobilizado + alendronato semanal (0,7 mg/kg). A imobilização foi obtida com aparelho gessado na região lombar, pélvica e de todo o membro pélvico direito (exceto a pata). O período de observação, imobilização e tratamento foi de 28 dias. Os métodos de avaliação foram a determinação da massa corporal, da massa e comprimento do fêmur direito, o ensaio mecânico em flexo-compressão no terço proximal do fêmur e a densidade óssea radiográfica do colo do fêmur direito. A comparação foi intergrupos. A imobilização, com alendronato ou não, causou diminuição significativa na massa corporal, enquanto que para a massa do fêmur ela diminuiu significativamente para os animais apenas imobilizados e não tratados. Com respeito à análise mecânica, houve sensível diminuição da força máxima e da rigidez nos animais apenas imobilizados. Os animais não imobilizados e que receberam alendronato de sódio (diário ou semanal) apresentaram maior resistência óssea, mesmo em relação ao controle não imobilizado e não tratado. Para os animais imobilizados e tratados (com alendronato de sódio diário ou semanal) houve aumento da força máxima e da rigidez que se igualaram ou mesmo ultrapassaram os valores do controle não imobilizado e não tratado. A determinação da densidade óssea correspondeu aos achados nos ensaios mecânicos de tal forma que a correlação dela com a força máxima e com a rigidez foi positiva e linear. Foi concluído que a imobilização gessada causou acentuado enfraquecimento ósseo que foi prevenido eficientemente pelo uso do alendronato de sódio, tanto de aplicação diária ou semanal, caracterizados pelo aumento da força máxima e rigidez no ensaio de flexo-compressão, bem como aumento da densidade óssea radiográfica. / Prolonged immobilization of the skeletal system has been used as an invaluable tool in the treatment of several orthopaedic conditions. However, as a side effect, it causes osteopenia and bone weakening. In this research it was investigated if the concomitant administration of sodium alendronate (a potent inhibitor of the osteoclastic activity) can prevent the bone weakening caused by immobilization. Young-adult female Wistar rats were distributed into six groups: non-immobilized and non-treated (control); non-immobilized + daily alendronate (0.1 mg/kg); non-immobilized + weekly alendronate (0.7 mg/kg); immobilized (no treatment); immobilized + daily alendronate (0.1 mg/kg); immobilized + weekly alendronate (0.7 mg/kg). Immobilization was achieved with a spica cast with inclusion of the right hindlimb. The period of pharmacological treatment and immobilization was 28 days. The evaluation consisted in the determination of the body mass, femoral mass, femur length, bending compression test of the proximal third of the femur and radiographic densitometry of the femoral neck. Inter-group evaluation was made. Immobilization with or without alendronate caused a significant decrease in the body mass. Conversely, the femur body mass significantly decreased in the immobilized in non-treated animals only. The mechanical tests showed that there was a significant reduction of the ultimate strength and stiffness for the immobilized and non-treated rats. When the animals were immobilized and received sodium alendronate (either daily or weekly) the femurs were stronger even in comparison in with the non-treated and non-immobilized animals (control). The immobilized and alendronate treated animals (both schedules) displayed an increased stiffness and ultimate strength that were equal or even surpassed the non-treated controls. Bone density followed the mechanical results and relationship of such parameters showed a positive linear correlation. We concluded that the plaster cast immobilization caused a significant bone weakening that was efficiently prevented either by the daily or by the weekly subcutaneous administration of sodium alendronate. This was characterized by the increase of the ultimate strength and stiffness from bending compression tests as well as by the enhancement of the radiographic bone density.