Fluorescence in situ hybridization (FISH) and digital imaging microscopy were modified to allow detection of single RNA molecules. Oligodeoxynucleotide probes were synthesized with five fluorochromes per molecule and the light emitted by a single probe was calibrated. Points of light in exhaustively deconvolved images of hybridized cells gave fluorescent intensities and distances between probes consistent with single mRNA molecules. Analysis of β-actin transcription sites after serum induction revealed synchronous and cyclical transcription from single genes. The rates of transcription initiation and termination and mRNA processing could be determined by positioning probes along the transcription unit. This approach extends the power of FISH to yield quantitative molecular information on a single cell.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 6 uppsatser.

Orientador: Eliana Regina Forni Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Engel_ThaissaBrogliatoJunqueira_M.pdf: 3058703 bytes, checksum: 0c07b7bfd8295f9d32498e3cb53cd894 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O gênero Griffinia Ker Gawl pertence à subfamília Amaryllidoideae que, junto às subfamílias Agapanthoideae e Allioideae, compõem a família Amaryllidaceae, com cerca de 73 gêneros e 1605 espécies. As Amaryllidaceae, incluindo as Griffinia, são apreciadas pelas suas flores e cultivadas para a jardinagem e ornamentação. Endêmico do Brasil, esse importante gênero está ameaçado de extinção pela constante degradação de seu ambiente natural, sendo que muitas espécies não foram mais encontradas na natureza e nem em cultivo. A taxonomia de Griffinia é bastante dificultada pela morfologia floral e vegetativa bastante semelhante entre algumas espécies, e pela variação morfológica dentro de uma mesma espécie, ocasionada pelo isolamento entre populações e pela existência de diferentes citótipos. Os objetivos deste trabalho foram obter o cariótipo de diferentes espécies de Griffinia e de espécies proximamente relacionadas, e fornecer à sistemática informações que auxiliem na compreensão das relações filogenéticas e evolutivas das espécies desse gênero. Foram estudadas 10 espécies e duas morfoespécies não identificadas de Griffinia, bem como quatro espécies de gêneros próximos. Pontas de raízes coletadas dessas espécies foram pré-tratadas em colchicina e fixadas em solução Farmer para a produção de lâminas com metáfases mitóticas. Foram determinados número e morfologia cromossômicos e realizados bandamentos com os fluorocromos cromomicina3 (CMA3) e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), e in situ fluorescent hybridization (FISH) com DNA ribossomal (DNAr 5S). Todas as espécies de Griffinia apresentaram 2n=20. Os números cromossômicos para as espécies analisadas de Eithea, Hippeastrum, Tocantinia e Worsleya foram 2n=18, 44, 22, e 42 respectivamente. Foram observadas espécies de Griffinia com duas, quatro, cinco e seis bandas CMA3+. De um a três sítios de DNAr 5S foram observados em dois a seis pares cromossômicos, em posição terminal, subterminal ou pericentromérica. Para cada espécie, foi observado um padrão único de distribuição de sítios de DNAr 5S, sendo assim possível a delimitação de espécies por meio das técnicas citogenéticas aplicadas. As espécies do grupo reportado na literatura como complexo Liboniana apresentaram semelhanças cariotípicas que podem corroborar a proximidade entre espécies: possuem apenas um par cromossômico com banda CMA3+ e dois pares cromossômicos com sítios de DNAr 5S. Variações cariotípicas foram observadas não apenas entre as espécies, mas também entre populações de uma mesma espécie. Casos de variação intraespecífica são conhecidos para plantas. Contudo, essa variação pode não ser uma variação interpopulacional, mas sim, reflexo da dificuldade taxonômica no gênero. Os resultados obtidos nesse estudo, apontam a citogenética como uma ferramenta útil na delimitação dos gêneros e espécies, e no reconhecimento de grupos dentro de Griffinia. / Abstract: The genus Griffinia Ker Gawl belongs to the subfamily Amaryllidoideae which together with the subfamilies Agapanthoideae and Allioideae, forms the Amaryllidaceae family, with about 73 genera and 1605 species. Amaryllidaceae plants, including Griffinia, are aprecciated because of their flowers and cultivated for gardening and ornamentals. Endemic to Brazil, the genus is endangered by the continuous degradation of their natural environment, and many species have not been found in nature. Taxonomy of Griffinia is very complicated because of its vegetative and floral morphology, which are quite similar between some species. There is also some morphological variation within a single species, caused by the isolation between populations and the existence of different cytotypes. The aim of this study was to obtain the karyotype of different species of Griffinia and closely related species, thus providing for systematic studies some information to assist in the understanding of the evolutionary and phylogenetic relationships of the species of this genus. We studied 10 species and two unidentified morphospecies of Griffinia, as well as four species of closely related genera. Root tips collected from these species were pretreated with colchicine and fixed in Farmer solution for the production of slides with metaphasic cells. We determined the number and chromosomal morphology. We performed banding with chromomicin3 (CMA3) and 4',6-diamidino-2-phenilindole (DAPI) fluorochromes and fluorescent in situ hybridization (FISH) with ribosomal DNA (5S rDNA). All Griffinia species presented 20 chromosomes. Chromosome numbers for the analyzed species of Eithea, Hippeastrum, Tocantinia and Worsleya were 2n= 18, 44, 22 and 42 respectively. Griffinia species presented two, four, five or six CMA3+ bands. One to three 5S rDNA sites were observed in two to six chromosome pairs in the terminal, subterminal or pericentromeric position. For each species, there was a unique pattern of distribution of DNAr 5S sites, so it is possible to delimitate species trough this cytogenetic technique. The species of a group reported in the literature as Liboniana complex showed similar karyotypes that can corroborate the closeness among the species of the group: they have only one chromosome pair with a CMA3+ band and two chromosome pairs with 5S rDNA sites. We observed karyotypic variations not only among species but also between populations of the same species. Cases of intraspecific variation are known for plants. However, this variation may be either an interpopulational variation, or a simple reflection of the difficulty in taxonomy of the genus. The data found at this analysis proved cytogenetic studies to be a quite useful tool in the delimitation of genera and species, and recognition of groups within Griffinia. / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestra em Biologia Vegetal

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2002. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 100 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 80-96).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2005. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 214-243).

O gene SHOX (short stature homeobox containing gene), expresso em altos níveis nas células osteogênicas, é fundamental para o desenvolvimento ósseo e para a determinação da altura. Haploinsuficiência do SHOX é responsável por vários fenótipos que envolvem a baixa estatura, como a síndrome de Turner, a discondrosteose de Léri-Weill e a baixa estatura idiopática. Cerca de dois terços das haploinsuficiências são causados por deleções. Neste trabalho, foi realizada uma comparação entre três técnicas para detecção de deleções do SHOX: a hibridação in situ com fluorescência (FISH), o estudo de microssatélites e o multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA). Nos pacientes sem deleção do SHOX, foi realizado um rastreamento para identificação de mutações de ponto no gene que levassem à sua haploinsuficiência. Foram analisados seis pacientes com discondrosteose de Léri-Weill (DLW) e 20 com baixa estatura desproporcionada (BED). Na técnica de FISH, os cromossomos metafásicos obtidos a partir de cultura de linfócitos foram hibridados com o cosmídio LLNOYCO3M34F5. DNA genômico extraído a partir de leucócitos de sangue periférico foi submetido à análise de microssatélites e MLPA. Foram amplificados seis marcadores de microssatélites (repetições CA, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 e DXYS234) e o MLPA foi realizado de acordo com as instruções dos kits SALSA MLPA P018-C1 e P018-D1 SHOX. Estes kits contêm oito sondas específicas para o gene SHOX e 13 para a área do SHOX, localizada a jusante do gene. O seqüenciamento direto da região codificadora do gene foi realizado nos pacientes sem deleção. Todos os pacientes com DLW apresentaram deleções envolvendo todo o gene. Entre os pacientes com BED, apenas um (5,0%) apresentou uma deleção intragênica envolvendo os exons 4, 5 e 6a. Os resultados das três metodologias foram concordantes na maioria dos casos, exceto em dois casos. No primeiro caso, inicialmente o FISH não identificou uma deleção envolvendo todos os éxons em um paciente com DLW. No segundo, uma deleção envolvendo os exons 4, 5 e 6a, identificada em uma paciente com BED, foi detectada apenas pelo MLPA. Ainda entre os pacientes com BED, três (15%) apresentaram deleção da região do marcador DXYS10096, a 3 do gene. Outros três (15%) pacientes apresentaram mutações de ponto identificadas pelo seqüenciamento direto: a mutação p.Tyr35X, que resulta na substituição de uma tirosina por um códon de parada prematuro; a p.Arg147His localizada na região do homeodomínio e a NM_000451:c.1236 -10T>C que se encontra a 10 nucleotídeos antes do início do éxon 5. Em uma comparação das três metodologias, o FISH foi considerado a técnica mais trabalhosa e com menor sensibilidade, levando até oito dias para sua realização. A análise por microssatélites requer o estudo dos progenitores, além de um grande número de marcadores para a análise de regiões extensas. O MLPA detectou todas as deleções, sendo considerada a metodologia mais sensível. Ele apresentou também menor custo e tempo de execução, além de possibilitar a estimativa do tamanho da deleção. Desta forma, o MLPA foi considerado a melhor metodologia para investigação inicial dos pacientes com DLW e BED. / The SHOX gene (short stature homeobox containing gene), expressed at high levels in osteogenic cells, is essential for bone development and growth process. SHOX haploinsufficiency is responsible for several phenotypes involving short stature, such as Turner syndrome, Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and idiopathic short stature. Deletions are responsible for 2/3 of SHOX haploinsufficiency. In this study, a comparison among three techniques for detection of SHOX deletions: fluorescence in situ hybridization (FISH), microsatellites analysis and multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) was performed. A screening for point mutations that could lead to haploinsufficiency was performed in patients without SHOX deletion. Six patients with Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and 20 with disproportionate short stature (DSS) were analyzed. FISH analysis was performed using the cosmid LLNOYCO3\"M\"34F5 and metaphase spreads obtained from lymphocytes culture. Genomic DNA extracted from peripheral blood leukocytes was used to microsatellite and MLPA analysis. Six microsatellite markers (CA repeats, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 and DXYS234) were amplified by PCR and MLPA was performed according to the manufacturers instructions for SALSA MLPA P018 and P018-C1-D1 SHOX kits. These kits contain 8 specific probes for SHOX gene and 13 for \"SHOX area, which is located downstream of the gene. The direct sequencing of entire encoding region was performed in patients with no SHOX deletions. All patients with LWD presented deletions involving the entire gene. One (5.0%) patient with DSS, presented an intragenic deletion involving exons 4, 5 and 6a. The results of the three methods were concordant in most cases, except in two cases. In the first case, a patient with DLW, the FISH did not identify a deletion involving all SHOX exons. In the second case, a deletion of exons 4, 5 and 6a in a patient with BED was identified only by MLPA. Other 3 (15%) DSS patients had deletion in SHOX area, in the DXYS10096 marker. Other three (15%) patients presented a point mutation identified by direct sequencing: p.Tyr35X, which replaces a tyrosine for a premature stop codon, p.Arg147His located in the homeodomain region and NM_000451: c.1236-10T> C which is 10 nucleotides before the exon 5. In a comparison of three methods, the FISH technique was considered the more laborious and less sensitive, taking until eight days to obtain the results. The microsatellite analysis requires the parents DNA study. In addition, several markers are essential for the analysis of extensive regions. The MLPA was considered the most sensitive methodology since it detected all deletions. It also presented lower cost and execution time, and allowed the estimation of the size of the deletion. Thus, the MLPA was considered the best approach for initial investigation of LWD and DSS patients.

Sarcomas uterinos são tumores mesodérmicos raros que compreendem, aproximadamente, 3% de todos os cânceres uterinos. Até o momento não há consenso quanto os fatores de risco para determinar um pior prognóstico e tratamento mais adequado. A radioterapia adjuvante não tem impacto na sobrevida e o papel da quimioterapia ainda é limitado. Nesse contexto, a busca por marcadores moleculares mostra-se importante tanto para a individualização do tratamento, quanto para o diagnóstico e prognóstico desses tumores. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de HER-2 e do fator de transcrição FOXO3a nos sarcomas e carcinossarcomas uterinos. Para isso, foram avaliadas 100 amostras incluindo: 56 leiomiossarcomas (LMS), 24 carcinossarcomas (CS), 18 sarcomas do estroma endometrial (SEE) e 2 adenossarcomas (AS). A expressão das proteínas foi avaliada por imunoistoquímica e a presença de alterações no número de cópias do gene HER-2 foi analisada por FISH e SISH. A amplificação de HER-2, resultando na hiperexpressão da proteína, foi observada no componente epitelial de uma única amostra de carcinossarcoma. Não foi observada deleção do gene. Os dados de SISH mostraram maior correlação com os de imunoistoquímica. A expressão de FOXO3a foi significativamente maior em todos os tumores avaliados em comparação ao miométrio, e mostrou associação significativamente com maior sobrevida livre de doença nos casos de LMS. Maior expressão dessa proteína também foi observada nos SEE de alto grau. Mulheres com mais de 50 anos, portadoras de LMS, apresentaram menor expressão de FOXO3a. Em conjunto, os resultados sugerem ser o FOXO3a potencial marcador para o risco de malignização e prognóstico para pacientes com LMS. Além disso, permitem indicar a utilização da técnica de SISH para melhor correlacionar a amplificação de HER-2 com os dados imunoistoquímicos / Uterine sarcomas are rare mesodermal tumors that comprise approximately 3% of all uterine cancers. To date, there is no consensus related to risk factors for poor prognosis and appropriate treatment. Adjuvant radiotherapy has no impact on survival of the patients and chemotherapy has limited role. In this context, the search for molecular markers is important in a search for individualization of treatment, for the diagnosis and prognosis of these tumors. The objective of this study was to evaluate the expression of HER-2 and FOXO3a transcription factor in uterine sarcomas and carcinosarcomas. For this, we evaluated a total of 100 samples including: 56 leiomyosarcomas (LMS), 24 carcinosarcomas (CS), 18 endometrial stromal sarcoma (ESS) and 2 adenosarcomas (AS). The protein expression were assessed by immunohistochemistry and copy number of the HER-2 was performed by FISH and SISH. HER-2 gene amplification, resulting in the protein overexpression was found in the epithelial component of an only one case of carcinosarcoma. SISH data showed higher relationship with protein expression than FISH. FOXO3a expression was significantly higher in all tumors than normal myometrium and it showed association with lower disease free survival, in LMSs patients. Protein overexpression was observed in the high grade SEE samples. LMS women´s with > 50 years old showed lower FOXO3a protein expression. Our results suggest that FOXO3a is involved in leiomyosarcoma risk of malignancy and might become a potential prognostic marker to these patients. Moreover, they allow us to indicate the SISH analysis as a better correlation method with the immunohistochemical data for HER-2 amplification, in the future

Sarcomas uterinos são tumores mesodérmicos raros que compreendem, aproximadamente, 3% de todos os cânceres uterinos. Até o momento não há consenso quanto os fatores de risco para determinar um pior prognóstico e tratamento mais adequado. A radioterapia adjuvante não tem impacto na sobrevida e o papel da quimioterapia ainda é limitado. Nesse contexto, a busca por marcadores moleculares mostra-se importante tanto para a individualização do tratamento, quanto para o diagnóstico e prognóstico desses tumores. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de HER-2 e do fator de transcrição FOXO3a nos sarcomas e carcinossarcomas uterinos. Para isso, foram avaliadas 100 amostras incluindo: 56 leiomiossarcomas (LMS), 24 carcinossarcomas (CS), 18 sarcomas do estroma endometrial (SEE) e 2 adenossarcomas (AS). A expressão das proteínas foi avaliada por imunoistoquímica e a presença de alterações no número de cópias do gene HER-2 foi analisada por FISH e SISH. A amplificação de HER-2, resultando na hiperexpressão da proteína, foi observada no componente epitelial de uma única amostra de carcinossarcoma. Não foi observada deleção do gene. Os dados de SISH mostraram maior correlação com os de imunoistoquímica. A expressão de FOXO3a foi significativamente maior em todos os tumores avaliados em comparação ao miométrio, e mostrou associação significativamente com maior sobrevida livre de doença nos casos de LMS. Maior expressão dessa proteína também foi observada nos SEE de alto grau. Mulheres com mais de 50 anos, portadoras de LMS, apresentaram menor expressão de FOXO3a. Em conjunto, os resultados sugerem ser o FOXO3a potencial marcador para o risco de malignização e prognóstico para pacientes com LMS. Além disso, permitem indicar a utilização da técnica de SISH para melhor correlacionar a amplificação de HER-2 com os dados imunoistoquímicos / Uterine sarcomas are rare mesodermal tumors that comprise approximately 3% of all uterine cancers. To date, there is no consensus related to risk factors for poor prognosis and appropriate treatment. Adjuvant radiotherapy has no impact on survival of the patients and chemotherapy has limited role. In this context, the search for molecular markers is important in a search for individualization of treatment, for the diagnosis and prognosis of these tumors. The objective of this study was to evaluate the expression of HER-2 and FOXO3a transcription factor in uterine sarcomas and carcinosarcomas. For this, we evaluated a total of 100 samples including: 56 leiomyosarcomas (LMS), 24 carcinosarcomas (CS), 18 endometrial stromal sarcoma (ESS) and 2 adenosarcomas (AS). The protein expression were assessed by immunohistochemistry and copy number of the HER-2 was performed by FISH and SISH. HER-2 gene amplification, resulting in the protein overexpression was found in the epithelial component of an only one case of carcinosarcoma. SISH data showed higher relationship with protein expression than FISH. FOXO3a expression was significantly higher in all tumors than normal myometrium and it showed association with lower disease free survival, in LMSs patients. Protein overexpression was observed in the high grade SEE samples. LMS women´s with > 50 years old showed lower FOXO3a protein expression. Our results suggest that FOXO3a is involved in leiomyosarcoma risk of malignancy and might become a potential prognostic marker to these patients. Moreover, they allow us to indicate the SISH analysis as a better correlation method with the immunohistochemical data for HER-2 amplification, in the future

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 6 uppsatser.