Introduction: 23 million patients worldwide suffer from heart failure. These patients depend on cardiac research, because cardiac research enables the development of new therapeutic strategies and –targets. In cardiomyocytes, the compartmentalization of cAMP and cGMP depends on many factors. T-tubuli and PDEs are responsible for the division of cells in microdomains in which localized and specific cAMP and cGMP-signaling occurs. The aim of this thesis was to develop a method to answer the open questions that remain about the physiological and pathophysiological significance of cAMP/cGMP compartmentalization. Methods: I used the zebrafish as a model, because the transparency of zebrafish larvae enabled non-invasive fluorescent imaging in cardiomyocytes in the living animal. I cloned the Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sensors EPAC1-camps for cAMP and cGi500 for cGMP and injected them into zebrafish fertilized embryos. Then I used the F0 generation for Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) -FRET-measurements of cAMP and cGMP. Ca2+ is an important downstream mediator of cAMP and cGMP, because Ca2+ regulates cardiac contraction. Therefore, I also cloned the Ca2+ sensor GCaMP6 and used the dye Fluo-4 AM to include intracellular Ca2+ in the imaging. Results: The cloned sensors for cAMP, cGMP and Ca2+ were successfully injected into the zebrafish and showed expression in individual cardiomyocytes. I developed a protocol to mount the living zebrafish embryos and to measure intracellular cAMP and cGMP with FLIM-FRET in vivo with high spatial resolution. I characterized the sensors in their functionality by showing that the sensors react to changes in intracellular concentrations of cAMP and cGMP. The results of this study include evidence that zebrafish have mechanisms that lead to cAMP/cGMP compartmentalization in the absence of T-tubuli, and these mechanisms keep compartmentalization constant even under extreme cAMP or cGMP increasing drug treatment. Furthermore, I imaged intracellular Ca2+ by confocal microscopy and developed a protocol to use Fluo-4 AM for Ca2+ imaging. Conclusion: The method used in this thesis should allow the investigation of subcellular cAMP/cGMP compartmentalization and Ca2+ and to subsequently answer open questions in the field, for example whether a change of cAMP compartmentalization leads to the pathological phenotypes of cardiac disease or if a changed compartmentalization of cAMP in cardiac disease influences Ca2+ concentrations and therefore contraction. Additionally, this method can be used to learn more about cAMP, cGMP und Ca2+ during regeneration in the heart, because the zebrafish cardiomyocytes can regenerate. / Einleitung: Weltweit sind mehr als 23 Millionen unter Herzinsuffizienz leidende Patienten auf die kardiologische Grundlagenforschung angewiesen, da diese die Voraussetzung für eine bessere Versorgung durch adaptierte und neue Behandlungswege schafft. In Kardiomyozyten hängt die Kompartimentierung von cAMP und cGMP von vielen Faktoren ab. T-Tubuli und PDEs werden unter anderem für die Aufteilung der Zellen in Mikrodomänen, in denen lokalisierte und spezifische cAMP- und cGMP-Signalgebung stattfinden kann, verantwortlich gemacht. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode, mithilfe derer offene Fragen bezüglich der physiologischen und insbesondere der pathophysiologischen Relevanz der cAMP- und cGMP Kompartimentierung beantwortet werden können. Methode: Als Modell diente der Zebrafisch, da die Transparenz von Zebrafisch Embryonen eine nicht-invasive Bildgebung von Fluoreszenz in Kardiomyozyten im lebenden Tier ermöglicht. Dafür klonierte ich die Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -Sensoren EPAC1-camps als cAMP-Sensor und cGi500 als cGMP-Sensor und injizierte diese in befruchtete Zebrafisch Embryonen. Anschließend benutzte ich die F0-Generation für Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) -FRET-Messungen von cAMP und cGMP. Da Ca2+ als wichtiger downstream Mediator von cAMP und cGMP die kardiale Kontraktion reguliert, klonierte ich außerdem den Ca2+-Sensor GCaMP6 und benutzte den Farbstoff Fluo-4 AM, um intrazelluläres Ca2+ darzustellen. Ergebnisse: Die klonierten Sensoren für cAMP, cGMP und Ca2+ konnten erfolgreich in den Zebrafisch injiziert werden und zeigten alle Expression in einzelnen Kardiomyozyten. Ich entwickelte ein Protokoll, dass die Fixierung von lebenden Zebrafisch Embryonen und nachfolgender Bildgebung von cAMP und cGMP mit hoher zellulärer Auflösung mit FLIM-FRET in vivo erlaubte. Ich konnte eine funktionelle Charakterisierung der Sensoren durchführen, indem ich zeigte, dass sie auf Konzentrationsänderungen von intrazellulärem cAMP und cGMP reagieren sowie zeigen, dass Zebrafische trotz fehlender T-Tubuli eine signifikante cAMP- und cGMP Kompartimentierung aufweisen, auch unter extremen Bedingungen nach Gabe von cAMP/cGMP stimulierenden Substanzen in hoher Dosierung. Ich konnte zudem subzelluläres Ca2+ durch konfokale Mikroskopie bildgebend darstellen und entwickelte ein Protokoll, um mit Fluo-4 AM eine schnelle Möglichkeit zu haben, Ca2+ mit in die Messungen einzubeziehen. Ausblick: Die in dieser Arbeit benutzte Methode bietet eine gute Möglichkeit, subzelluläre cAMP- und cGMP-Kompartimentierung und Ca2+ zu untersuchen und damit zum Beispiel die Fragen zu beantworten, ob eine veränderte cAMP/cGMP Kompartimentierung zu Herzkrankheiten wie Hypertrophie führt oder ob eine veränderte cAMP Kompartimentierung den zellulären Ca2+ Haushalt und damit die kardiale Kontraktion beeinflusst. Darüber hinaus kann das von mir etablierte Protokoll dazu genutzt werden, mehr über cAMP, cGMP und Ca2+ während der Regeneration im Herzen zu lernen, da der Zebrafisch über ausgeprägte Regenerationsfähigkeiten verfügt.

Les données sur le comportement biomécanique de la paroi abdominale restent limitées. Cette méconnaissance est un facteur limitant pour le développement de modèles numériques de cette région anatomique. L’objectif de cette thèse est d’apporter des données quantitatives sur le comportement biomécanique de la paroi abdominale, en adoptant une approche expérimentale globale allant de l’ex vivo à l’in vivo. Dans un premier temps, un protocole de caractérisation ex vivo est mis au point et validé sur des spécimens porcins, puis appliqué à des échantillons humains. Ce protocole permet de tester une même paroi abdominale sous deux types de sollicitation (pression et contact) dans le domaine élastique. Il permet également d’évaluer l’influence d’une lésion et d’une réparation avec un implant chirurgical, sur la réponse mécanique de la paroi. Des mesures par corrélation d’images 3D réalisées simultanément sur les surfaces internes et externes quantifient les différences de distribution des déformations de la paroi abdominale. Dans un second temps, des examens in vivo sur volontaires permettent de prendre en compte l’activité musculaire. Une raideur locale est ainsi évaluée pour diverses activités physiologiques, raideur qui augmente en fonction du niveau de contraction jusqu’à 6 fois la valeur au repos. En résumé, cette recherche propose une méthodologie pour mieux comprendre le comportement mécanique global de la paroi abdominale. Cette méthodologie peut être déclinée, afin d’étudier l’influence des différents composants de la paroi. Au-delà de cette thèse, ces données contribueront à la construction et la validation d’un modèle numérique de la paroi abdominale / Data on the biomechanical behaviour of the abdominal wall are limited. This lack of knowledge is a limiting factor for the development of numerical models of this anatomical area. Therefore, the objective of this thesis is to provide quantitative data on the biomechanical behaviour of the abdominal wall, adopting a global experimental approach ranging from ex vivo to in vivo. As a first step, a protocol for ex vivo characterization is develop and validated on porcine specimens and then applied to human anatomical specimens. This protocol allows testing a same abdominal wall under two loading types (pressure and contact) in the elastic range. It also enables to assess the influence of an incision and of a repair with a surgical implant on the mechanical response. Measurements by 3D digital image correlation performed simultaneously on the internal and external surfaces quantify differences in strain distribution of the abdominal wall. As a second step, in vivo examinations on volunteers enable to take into account muscle activity. A local stiffness is thus assessed for various physiological activities. This stiffness increases with the level of muscle contraction and reaches on average six times the stiffness at rest. In conclusion, this research proposes a methodology to better understand the global mechanical behaviour of the abdominal wall. This methodology can now be used in order to study the influence of the different components of the abdominal wall. Beyond this thesis, these data will contribute to the construction and validation of a numerical model of the abdominal wall

Les données biomécaniques sur les enfants sont rares et difficiles à obtenir lors d'expérimentations. Cette recherche s'intéresse à l'évaluation in vivo du comportement mécanique du tronc et des propriétés mécaniques de l'os cortical des côtes. Le comportement mécanique in vivo du tronc de l'enfant et de l'adulte sous charge pendant des manipulations de kinésithérapie respiratoire ont été étudiées. Trois formes typiques de courbes de force en fonction du déplacement ont été observées. Un plus grand décalage en temps entre les courbes de force en fonction du temps et les courbes de déplacement en fonction du temps ont été observés plus fréquemment chez les enfants que chez les adultes, ce qui conduit à différentes formes de courbes de force en fonction du déplacement entre les enfants et les adultes. Parmi les paramètres qui peuvent affecter le comportement mécanique du tronc, les propriétés mécaniques de l'os cortical des côtes ont été étudiées. Dans un premier temps, il a été constaté ex vivo que les propriétés mécaniques de l'os cortical des côtes des adultes sont liées de façon linéaire à la Densité Minérale Osseuse (DMO) mesurée par la tomodensitométrie quantitative (Quantitative Computed Tomography, QCT) et la tomographie périphérique quantitative à haute résolution (High Resolution Peripheral Quantitative Computed Tomography, HR-pQCT). La DMO peut être mesurée par QCT in vivo. Ensuite, les relations entre la DMO et les propriétés mécaniques pour l'adulte ont été appliquées aux enfants, et les propriétés mécaniques de l'os cortical de l'enfant ont pu être estimées. Les propriétés mécaniques ont été trouvées plus élevées dans la partie latérale des côtes que dans les régions antérieures et postérieures. Il a également été constaté que les propriétés mécaniques augmentent au cours de la croissance. Il s'agite la première étude qui a évalué les propriétés des matériaux de l'os cortical des côtes de l'enfant in vivo. Cette étude peut aider à mieux comprendre la réponse mécanique du tronc de l'enfant et les propriétés mécaniques de l'os cortical costal. À court terme, ces résultats mesurés in vivo seront considérés dans des modèles éléments finis du tronc de l'enfant / Biomechanical data on children, both mechanical behaviors and tissue properties, are rare and difficult to be obtained through biomechanical experiments. This thesis mainly discussed the mechanical behavior of pediatric trunk and mechanical properties of pediatric rib cortical bones in vivo. The mechanical responses of the living and active pediatric and adult trunks during in vivo loading tests were investigated. Three typical shapes of force-displacement curves were observed. Larger time lags between force time histories and displacement time histories were observed more frequently in children than adults, resulting in different shapes of force-displacement curves between children and adults. To better understand the mechanical behavior of pediatric trunk, rib cortical bone mechanical properties were studied. It was found that mechanical properties of adult rib cortical bones were linearly related to Bone Mineral Density (BMD) measured by Quantitative Computed Tomography (QCT) and High Resolution Peripheral Quantitative Computed Tomography (HR-pQCT). The BMD could be measured by QCT in vivo. Then, the mechanical property-BMD relationships were introduced to child population, and the mechanical properties of pediatric rib cortical bones were estimated. The mechanical properties were found higher in the lateral part of the ribs than the anterior and posterior regions. It was also found that the mechanical properties were growing during the growth of children. This is the first study which estimated the material properties of pediatric rib cortical bones in vivo. This study can help to better understand the mechanical response of pediatric trunk and mechanical properties of pediatric rib cortical bones. These results measured in vivo could contribute to improve the biofidelity of pediatric modeling

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Polymeric nanocapsules have been studied extensively for drug delivery by various routes of administration. Currently, the nanoencapsulation of drugs is considered the most efficient means of ensuring controlled release, specific targeting and reduction of adverse effects. In this context, the aim of this work was to develop polymeric nanocapsules for pulmonary delivery of beclomethasone dipropionate (BD). Nanocapsules have been prepared from 2 polymers, poly(-caprolactone) (PCL) and ethyl cellulose (EC). To quantify the drug in the nanostructures, the analytical method was developed and validated. This method showed to be specific, linear, precise, accurate and robust. Nanocapsules were prepared by interfacial deposition of preformed polymers and were evaluated as to pH, particle diameter, polydispersity index, drug content, encapsulation efficiency and zeta potential. All samples showed encapsulation efficiency greater than 98%, negative zeta potential, pH value in the range of neutrality and drug contents close to their theoretical values. The size distribution was nanometric (158-270 nm) with polydispersity index lower than 0.2. The results of the photodegradation study showed that polymeric nanocapsules were able to protect BD from UVC radiation when compared to the free drug solution. In vitro release experiments were performed using the dialysis bag technique, which showed, for all formulations, a prolonged drug release mediated by anomalous transport and first order kinetics. Free drug in solution took between 24 and 36 h to reach 100% of release, whereas nanocapsules were able to control the drug release for up to 108 h, depending on the polymer employed. Nanocapsules of EC and PCL were evaluated for in vitro and in vivo toxicity and the results suggest that the proposed formulations are safe. In the final stage of the work, pullulan was proposed as stabilizer agent for PCL nanocapsules and the results obtained for the zeta potential and the drug content suggested that these formulations have become more stable. Thus, the nanocapsules developed in this work represent a promising alternative for the pulmonary delivery of BD in the treatment of asthma and other respiratory disorders. / Nanocápsulas poliméricas vem sendo estudadas extensivamente para liberação de fármacos por diversas vias de administração. Atualmente a nanoencapsulação de fármacos é considerada o meio mais eficiente de assegurar liberação controlada, direcionamento específico e redução dos efeitos adversos. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver nanocápsulas poliméricas para a liberação pulmonar do dipropionato de beclometasona (DB). Nanocápsulas foram preparadas a partir de 2 polímeros, a poli(-caprolactona) (PCL) e a etilcelulose (EC). Para a quantificação do fármaco nas nanoestruturas, o método analítico foi desenvolvido e validado. Este mostrou ser específico, linear, preciso, exato e robusto. As nanocápsulas foram preparadas por deposição interfacial do polímero pré-formado e avaliadas quanto ao pH, diâmetro de partícula, índice de polidispersão, teor, eficiência de encapsulamento e potencial zeta. Todas as amostras apresentaram eficiência de encapsulamento maior que 98%, valor de potencial zeta negativo, valor de pH na faixa da neutralidade e teores próximos aos teóricos. A distribuição de tamanho foi nanométrica (158-270 nm) com índice de polidispersão menor que 0,2. Os resultados do estudo de fotodegradação mostraram que as nanocápsulas poliméricas foram capazes de proteger o DB da radiação UVC quando comparadas com uma solução do fármaco. Os experimentos de liberação in vitro foram realizados empregando a técnica de sacos de diálise, a qual mostrou, para todas as formulações, uma liberação prolongada do DB, mediada por transporte anômalo e cinética de primeira ordem. A solução etanólica de DB levou entre 24 e 36 h para alcançar 100% de liberação, enquanto que as nanocápsulas foram capazes de controlar a liberação do fármaco por até 108 h, dependendo do polímero empregado. Nanocápsulas de EC e PCL foram avaliadas quanto à toxicidade in vitro e in vivo e os resultados obtidos sugerem que as formulações propostas são seguras. Na etapa final do trabalho, o pullulan foi proposto como agente estabilizador de nanocápsulas de PCL e os resultados obtidos para o potencial zeta e o teor de fármaco sugerem que estas formulações tornaram-se mais estáveis. Desta forma, as nanocápsulas desenvolvidas neste trabalho representam uma alternativa promissora para a liberação pulmonar do DB no tratamento da asma e de outras desordens do trato respiratório.

Iron is an essential nutrient for cellular activities including oxygen transport, electron transfer, and gene regulation. However, iron is potentially toxic via its redox reactions which generate reactive oxygen species (ROS). Oxidative damage to biomolecules can be modulated by antioxidants such as ascorbic acid (AA). However, it is well known that in the presence of redox-active iron, AA can act as a pro-oxidant in vitro and contribute to the formation of hydroxyl radicals. Based on the possible pro-oxidant interaction of iron and AA, we evaluated the manifestations of supplementation of iron associated with the ascorbic acid. The study was delineated by nine non-smoking male healthy volunteers, aged between 20 and 31 years. The volunteers were supplemented with a single dose containing 2g of AA (first group), 150mg of iron (second group) and 2g of AA plus 150mg of iron (third group). The 9 volunteers were submitted the all the treatments, which were alternate every 15 days. The volunteers were submitted to blood collections before the supplementation and 2, 5 and 24 hours after the supplementation. They were evaluated the levels of iron and ferritin, the activity of the antioxidants enzymes catalase (CAT), gluthatione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), the level non-enzymatic antioxidants: AA, non-protein-SH, as well as markers of the oxidative stress Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), diclorofluorescein oxidation and delta-amino levulinate dehydratase (ALA-D) activity. The results showed that plasma AA levels were increased at 2, 5 and 24 hours after AA or AA plus iron ingestion. Plasmatic iron level was increased at 2 hours after iron ingestion and 2, 5 hours in the group AA plus iron. The erythrocytes TBARS levels decreased at 5 hours after AA and 5, 24 hours after AA plus iron ingestion. The erythrocytes CAT levels caused a significant increase 5 hours after supplementation with AA plus iron. The other results showed no significant different in the determinations. Thus, the present study does not support the hypothesis that the combination of high plasma oncentrations of AA and iron, or iron alone, causes oxidative damage in vivo. However, further studies are required to determine if iron and AA interactions could have a pro-oxidant effect in vivo. / O ferro é um nutriente essencial para atividades das células incluindo transporte de oxigênio, transferência de elétrons e regulação genética. Entretanto, esse mineral é potencialmente tóxico por participar de reações de óxido-redução, que favorecem a formação de espécies reativas ao oxigênio (ERO). O dano oxidativo nas biomoléculas pode ser modulado por antioxidantes como o ácido ascórbico (AA). Entretanto, sabe-se que na presença de ferro, o ácido ascórbico pode atuar como um pró-oxidante in vitro e contribuir para formação de radicais hidroxila. Baseado na possibilidade pró-oxidante da interação entre o ferro e o ácido ascórbico, for avaliados as manifestações da suplementação do ferro associado com o ácido ascórbico. O estudo foi delineado por 9 voluntários saudáveis, não tabagistas, entre 20 e 31 anos. Os voluntários foram suplementados com uma dose única contendo 2g de ácido ascórbico (primeiro grupo), 150mg de ferro (segundo grupo) e 2g de ácido ascórbico mais 150mg de ferro (terceiro grupo). Os 9 indivíduos foram submetidos a todos os tratamentos, os quais foram alternados a cada 15 dias. Os voluntários foram submetidos a coletas sanguíneas antes da suplementação e 2, 5 e 24 horas após a suplementação. Foram avaliados os níveis de ferro e ferritina, a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), os níveis dos antioxidantes não-enzimáticos: ácido ascórbico, tiois não proteicos (NPSH), bem como os marcadores do estresse oxidativo: espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), oxidação da diclorifluoresceína e a atividade da delta aminolevulinato desidratase (ALA-D) . Os resultados encontrados mostraram que os níveis plasmáticos de ácido ascórbico aumentaram significativamente em 2, 5 e 24 horas após a ingestão de ácido ascórbico mais ferro ou somente ácido ascórbico. Os níveis plasmáticos de ferro aumentaram significativamente 2 horas após a ingestão de ferro e 2 e 5 horas no grupo ferro mais ácido ascórbico. Os níveis de TBARS eritrocitário diminuíram significativamente em 5 e 24 horas após a ingestão de ferro, bem como, em 5 horas após a ingestão de ferro mais ácido ascórbico. A atividade da CAT eritrocitária aumentou significativamente em 5 horas após a ingestão de ácido ascórbico mais ferro. Os demais parâmetros avaliados não mostraram diferenças significativas. Com isso, o presente estudo não confirma a hipótese que a combinação de altas doses de ácido ascórbico e ferro, ou apenas ferro causam dano oxidativo in vivo. Entretanto, mais estudos são necessários para determinar se a interação entre o ferro e o ácido ascórbico pode causar efeito pró-oxidante in vivo.

Les cellules souches de gliomes (CSG), une sous-population de cellules tumorales, seraient en partie responsables de l’échec des traitements des gliomes de par leur résistance et leur capacité régénérative. Le mécanisme alternatif (ALT) de maintenance des télomères, basé sur la recombinaison homologue et non pas sur la télomérase, est détecté dans environ 30% des gliomes humains suggérant que des stratégies thérapeutiques spécifiquement dirigées contre ALT pourraient avoir un intérêt thérapeutique. Dans ce travail, nous avons poursuivi la caractérisation du premier exemple de CSG humaines ayant un phénotype ALT, les cellules TG20. Nous avons montré que malgré leur très fort taux de recombinaison, les télomères de ces cellules continuaient à assurer leur fonction de protection des chromosomes. Nous avons vérifié que les cellules TG20 conservaient leur capacité à générer des tumeurs intracérébrales après des transplantations sériées chez les souris immunodéprimées tout en gardant un phénotype ALT. Ces résultats confirment à la fois les propriétés de cellules souches cancéreuses des cellules TG20 et la capacité de ALT à assurer la maintenance des télomères nécessaire à l’autorenouvellement et au fort taux de prolifération des CSG in vivo. La greffe intracérébrale de cellules TG20 chez des souris immunodéprimées représente donc un bon modèle d’étude préclinique des gliomes ALT. Nous avons ainsi montré qu’un traitement précoce par un ligand des G-quadruplexes télomériques, 360B, juste après la greffe de cellules TG20, était capable d’inhiber le développement tumoral suggérant l’intérêt de l’utilisation de ligands des G-quadruplexes pour cibler spécifiquement les CSG ALT. Une étude des profils d'expression transcriptomique des cellules TG20 et de plusieurs lignées de CSG humaines exprimant la télomérase, nous a conduit à nous intéresser aux rôles de deux lysine acétyl transférases homologues, PCAF (P300/CBP Associated Factor) et GCN5 (General Control Nonderepressible 5) dans la régulation de la recombinaison télomérique des cellules ALT. Nous avons montré que les inhibitions de ces deux protéines ont des effets opposés sur le mécanisme ALT. Nous proposons qu’une balance d’expression de PCAF et GCN5 régule la maintenance des télomères dans les cellules ALT via le contrôle du turnover de TRF1 ce qui pourrait constituer la base d’une nouvelle stratégie thérapeutique vis-à-vis des gliomes ayant un phénotype ALT. / Glioma stem cells (GSC), a subpopulation of tumor cells, are partly responsible for the failure of treatment of gliomas because of their resistance and regenerative capacity. The mechanism of alternative lengthening of telomere (ALT), based on homologous recombination, is detected in approximately 30 % of human gliomas. Therefore, therapeutic strategies directed specifically against ALT may have a therapeutic value. In this work, we further characterized the first model of human ALT GSC, the TG20 cells. We showed that despite their very high rate of recombination, the telomeres were still capable of fulfilling their protective function of chromosomes. We verified that the TG20 cells retained their ability to generate intracerebral tumors after serial transplantations in immunocompromised mice, while preserving an ALT phenotype. These results confirm the cancer stem properties of TG20 cells and the ability of ALT to ensure telomeres maintenance, which is required for the self-renewal and the high proliferation rate of GSC in vivo. Intracerebral grafts of TG20 cells in immunocompromised mice represent thus a good preclinical model for studying ALT gliomas. We have shown that treatment with a ligand of telomeric G-quadruplexes, the 360B, at an early stage of TG20 tumor engraftment, was able to inhibit tumor growth, showing the interest of the use of G-quadruplex ligands to specifically target ALT GSC. Transcriptomic profiling of TG20 cells and several other GSC telomerase-positive lines, incited us to study the roles of two homologous lysine acetyl transferases, PCAF (p300/CBP Associated Factor) and GCN5 (General Control Nonderepressible 5), in the regulation of telomeric recombination in ALT cells. We showed that the inhibition of these two proteins has opposite effects on the ALT mechanism. We propose that a balance of expression of PCAF and GCN5 regulates the telomere maintenance in ALT cells by controlling the turnover of TRF1. This model could serve for the development of new therapeutic strategies targeting ALT gliomas.

Les motoneurones tiennent une place remarquable dans l'organisme : ils constituent l'interface entre le système nerveux central et le système musculaire. Leur excitabilité est une caractéristique primordiale dans le comportement moteur puisqu'elle définit la force musculaire développée en réponse à la commande motrice. Chez la souris, la décharge des motoneurones est marquée par la présence d'oscillations de mode mixte (MMOs) entre les potentiels d'action. Ces MMOs permettent la décharge des motoneurones à basse fréquence et sont responsables d'un régime de décharge particulier nommé zone sous-Primaire, pendant lequel la fréquence de décharge est très variable et le gain de la relation courant-Fréquence élevé. Nous avons étudié les mécanismes responsables de l'apparition de ces MMOs à la fois de manière expérimentale, dans une préparation in vivo de souris anesthésié, incluant l'utilisation du Dynamic Clamp, et théorique, au moyen d'un modèle mono-Compartimental de motoneurone. Nos résultats ont montré que ces MMOs étaient causées par les courants sodiques et potassiques responsables des potentiels d'action et qu'elles émergeaient d'un état de faible excitabilité de la membrane, dû à l'inactivation lente des courants sodiques. Nous avons également montré que le courant de post-Hyperpolarisation pouvait paradoxalement augmenter l’excitabilité des motoneurones et réduire les MMOs en dé-Inactivant le courant sodique. La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) conduit à la dégénérescence spécifique de ces motoneurones qui s'accompagne d'une vacuolisation de leur arborisation dendritique. L'augmentation précoce de l'excitabilité des motoneurones dans la maladie a largement été évoquée pour rendre compte de leur atteinte. Une hyperexcitabilité, aussi bien d'origine intrinsèque qu'extrinsèque pourrait en effet produire une excitotoxicité délétère pour la cellule. Si une telle modification de l'excitabilité est en cause dans la maladie, elle devrait persister jusqu'aux âges auxquels se produisent les premières dénervations des jonctions neuromusculaires. Nous avons enregistré les propriétés électrophysiologiques des motoneurones dans une préparation in vivo de souris adultes SOD1-G93A, modèle de la SLA. Nos résultats ont montré que leur conductance d'entrée était augmentée dans les jours qui précèdent les premières dénervations de leurs jonctions neuromusculaires. Malgré cela, leur excitabilité n'était pas modifiée. Loin d'être intrinsèquement hyperexcitables, une fraction d'entre eux perdaient même leur capacité à décharger de manière répétée. Nous avons finalement étudié la vacuolisation qui prend place dans les dendrites des motoneurones au cours de la maladie et son lien avec la couverture synaptique. Nous avons montré que la vacuolisation dendritique prenait place avant les dénervations et que la taille des vacuoles augmentait avec l'âge des souris SOD1-G93A. De manière intéressante, cette progression semblait plus rapide dans les motoneurones les plus sensibles à la maladie. Bien que la couverture synaptique n'était pas modifiée au cours de la maladie, nous avons mis en évidence une densité de synapses excitatrices et inhibitrices plus importante sur les régions dendritiques qui se vacuolisent. Ces résultats suggèrent un lien entre l'activité synaptique et la formation de vacuoles dans les motoneurones au cours de la SLA. Les motoneurones ne présentant pas d'hyperexcitabilité intrinsèque, une excitotoxicité d'origine synaptique pourrait alors être responsable de leur dégénérescence. / Motoneurones hold a remarkable position in the organism: they are the interface between the central nervous system and the muscular system. Their excitability is a crucial characteristic in motor behavior since it determines the muscular force produced in response to motor command. In mice, motoneurone discharge is marked by the presence of sub-Threshold oscillations between action potentials which create a behavior of mixed mode oscillations (MMOs). These MMOs allow the motoneurones to fire at low frequency and are responsible for a sub-Primary range of discharge during which the firing frequency is irregular and the slope of current-Frequency relation is steep. We investigated the mechanisms responsible for these MMOs by in vivo recordings in anesthetized mice, using Dynamic Clamp, and by theoretical modelization in a monocompartimental model of motoneurone. Our results showed that MMOs were caused by sodium and potasium currents responsible for action potentials and that they emerged from a state of low membrane excitability caused by a slow inactivation of the sodium current. Paradoxically, we also showed that the after-Hyperpolarization current was able to increase the membrane excitability and to reduce MMOs by de-Inactivating the sodium current. Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) leads to the specific degeneration of these motoneurones and is accompanied by a vacuolation of their dendritic trees. An early increase in motoneurons excitability during the disease has been widely proposed to account for their degeneration. Indeed, a motoneuron hyperexcitability of intrinsic or extrinsic origin could produce a deleterious excitotoxicity. If such a change of excitability is involved in the disease, it should last until the ages where the first denervation of neuromuscular junctions occurs. We recorded the electrophysiological properties of motoneurones in an in vivo preparation of adult SOD1-G93A mice, model of ALS. Our results showed that their input conductance was increased before the first denervation of their neuromuscular junctions. Nevertheless, their excitability was not modified. Far from being intrinsically hyperexcitable, a fraction of them even lost their ability to discharge repeatedly. We finally studied the vacuolation that takes place in dendrites of motoneurones during the disease and its relation with synaptic coverage. We have shown that the dendritic vacuolation takes place before the denervation and that the size of these vacuoles increases with age in SOD1-G93A mice. Interestingly, this increase was faster in the most vulnerable motoneurones. Although synaptic coverage was not altered in the disease, we ¬revealed higher densities of excitatory and inhibitory synapses on dendritic regions that vacuolate. These results suggest a link between synaptic activity and vacuoles formation in motoneurones during ALS. Motoneurones were not intrinsically hyperexcitable, instead, an excitotoxicity from a synaptic origin may be responsible for their degeneration.

La trisomie 21 est la première cause de retard mental, phénotype majeur de la maladie. Elle est due à la présence d’un chromosome 21 supplémentaire. De nombreux gènes sont présents sur ce chromosome mais quelques-uns ont été proposés comme candidats pour les phénotypes neurocognitifs associés à la maladie, notamment le gène Dyrk1a. Il code pour une sérine-thréonine kinase, DYRK1A, à rôle majeur dans le développement cérébral et l’activité synaptique. Le cortex préfrontal sous-tend un ensemble de fonctions cognitives supérieures dont les fonctions exécutives et est impliqué dans la régulation du comportement émotionnel et de l’humeur, composantes largement affectées dans la trisomie 21. Ce travail de thèse a permis de caractériser des défauts majeurs de la transmission et la plasticité synaptique glutamatergique au sein du cortex préfrontal de deux modèles murins différents de trisomie 21: le modèle mBACtgDyrk1a surexprimant le gène murin Dyrk1a et le modèle Ts65Dn surexprimant 130 gènes de l’analogue murin du chromosome 21 dont Dyrk1a. Un autre versant de l’étude a concerné l’utilisation d’un composé inhibiteur de l’activité DYRK1A ou d’autres cibles cellulaires pour corriger les altérations préfrontales observées, constituant ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques pour les phénotypes neurocognitifs associés à la trisomie 21. / Down syndrome is the major cause of mental retardation, the main phenotype of the pathology. It is due to an extra chromosome 21. Many genes have been proposed as candidates for the neurocognitive phenotypes of Down syndrome, notably Dyrk1a. It encodes the serine-threonine kinase DYRK1A which is involved in brain development and synaptic functions. The prefrontal cortex mediates higher cognitive functions, such as executive functions and emotional regulation. This study highlighted major deficits in prefrontal cortex glutamatergic transmission and plasticity of two mouse models for Down syndrome: the overexpressing Dyrk1a mBACtgDyrk1a model and the Ts65Dn model, overexpressing around 130 murine orthologous genes of HSAS21 chromosome. Another aspect of this study was the development of new effective therapeutic strategy for Down syndrome neurocognitive phenotypes based on DYRK1A or other cellular targets activity inhibition.

Les protéines à centre Fe-S sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires. In vivo, la formation des centres Fe-S est réalisée par des machineries multi-protéiques dont ISC et SUF, conservées chez les eucaryotes et les procaryotes. D’autres composants participent à la formation des centres Fe-S chez les eucaryotes, comme la frataxine (FXN). La FXN est une protéine présente chez l’homme, les plantes, la levure ou encore les bactéries à Gram négatif. Chez les eucaryotes, l’absence de FXN conduit à des phénotypes drastiques comme une accumulation de fer dans la mitochondrie, une diminution drastique de l’activité d’enzymes à centre Fe-S ou encore des dommages oxydatifs. Chez l’homme, un déficit en FXN est responsable d’une maladie neurodégénérative, l’ataxie de Friedreich. A la différence des eucaryotes, chez les procaryotes comme Escherichia coli, l’absence de CyaY, homologue bactérien de la FXN, ne conduit à aucun des phénotypes évoqués ci-dessus.Durant ma thèse, je me suis intéressée au rôle de CyaY chez E. coli. J’ai montré que, in vivo, CyaY favorise la formation des centres Fe-S via la machinerie ISC. Un lien génétique entre CyaY et IscX a également pu être établi, montrant que ces deux protéines participent à la formation des centres Fe-S in vivo. Je me suis ensuite intéressée aux bases moléculaires pouvant expliquer la différence entre les phénotypes liés à l’absence de FXN chez les eucaryotes et les procaryotes. J’ai montré que le résidu 108 de IscU joue un rôle clé pour la dépendance de CyaY. Enfin, pour mieux comprendre le rôle de CyaY chez E. coli, j’ai réalisé une approche globale en caractérisant le transcriptome du mutant ∆cyaY. / Fe-S cluster containing proteins are involved in many cellular processes such as respiration, DNA repair or gene regulation. In vivo, Fe-S cluster biogenesis is catalysed by specific protein machineries, ISC and SUF, conserved in both eukaryotes and prokaryotes. Frataxin (FXN) is a small protein found in humans, plants, yeast and Gram negative bacteria. In eukaryotes, a defect in FXN leads to drastic phenotypes such as mitochondrial iron accumulation, drastic decrease of Fe-S cluster protein activity, sensitivity to oxidants. In humans, FXN deficiency is responsible for the neurodegenerative disease, Friedreich’s ataxia. In prokaryotes like E. coli, a defect in CyaY, the bacterial FXN homolog, does not lead to significant phenotypes compared to the wild-type strain. During my thesis, I investigated the role of the bacterial FXN CyaY in E. coli. I showed that, in vivo, CyaY assisted the ISC-catalyzed Fe-S cluster biogenesis. A genetic link was also observed between cyaY and iscX, demonstrating that these proteins participate in Fe-S cluster biogenesis. In a second part, I investigated the differences between the impact of the eukaryotic versus prokaryotic FXN. I showed that the IscU 108th residue is crucial for the CyaY-dependency. Finally, I used a transcriptomic approach to test whether CyaY has a global role in E. coli.

Les syndromes septiques restent à ce jour un problème majeur de santé publique. Une importante immunodépression est observée lors des syndromes septiques, affectant notamment les lymphocytes T, acteurs majeurs de la réponse immunitaire. En effet, après avoir subi une apoptose massive ils présentent d'importantes altérations fonctionnelles et phénotypiques, associées à un mauvais pronostic. Cependant les mécanismes impliqués dans le développement de ces altérations lymphocytaires induites par le sepsis (ALIS) sont encore mal connus. Le but de ce travail était d'étudier ces mécanismes à travers la mise au point de modèles ex-vivo. Nous avons optimisé un test de mesure de la réponse proliférative des lymphocytes T, utilisable pour le diagnostic des immunodéficiences primaires, comme pour l'étude expérimentale et clinique des ALIS. Nous avons développé un premier modèle ex vivo, reposant sur l'incubation de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) en présence de LPS, suivie d'une stimulation spécifique des lymphocytes T via leur TCR. Ce modèle récapitule des mécanismes indirects potentiellement impliqués dans l'induction des ALIS, impliquant les monocytes. Puis, nous avons mis au point un modèle qui repose sur l'incubation de PBMC en présence d.IL-10, suivie d'une stimulation des lymphocytes T par des anticorps anti-CD2/CD3/CD28. Ce modèle pourrait reproduire des mécanismes directs et indirects impliqués dans l'induction des ALIS. Nos résultats nous ont permis d'améliorer la compréhension des mécanismes en jeux dans les ALIS et d'en souligner la complexité. Les modèles ex-vivo présentés pourraient permettre d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques / Sepsis remains a major public healthcare issue. During sepsis, an important immunodepression develops, affecting particularly the T lymphocytes, major players of the immune response. Following a massive apoptosis, T lymphocytes display important functional and phenotypical alterations, which are associated with higher risk of secondary infections and higher mortality. Mechanisms involved in the induction of such alterations are not fully understood. The aim of this study was to analyze those mechanisms through the development of ex vivo models. We optimized a test to measure T lymphocytes proliferative response, which can be used for the diagnosis of primary immunodeficiencies, as well as to clinically and experimentally study sepsis induced T lymphocytes alterations (SILA). First, we set up a model consisting in an incubation of PBMC (peripheral blood mononuclear cells) with LPS followed by specific T lymphocytes stimulation via its TCR. This model recapitulates indirect mechanisms likely to participate in SILA induction, mediated by monocytes. Then, we set up a model consisting in PBMC incubation with IL-10 followed by T lymphocytes stimulation with anti-CD2/3/28 antibody coated beads. This model may recapitulate direct and indirect mechanisms involved in SILA induction. Our results allowed us to improve the understanding of the mechanisms involved in SILA induction and to highlight its complexity. The ex-vivo models that we developed could be used for the evaluation of new therapeutic strategies