Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:48:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Endo_MarcosSergio_D.pdf: 3037856 bytes, checksum: a21ebec8d8ad677c201694383adabc1c (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: Microrganismos resistentes à terapia endodôntica ou que invadiram o sistema de canais radiculares após os procedimentos clínicos de desinfecção são considerados as principais causas do insucesso endodôntico. Objetivos: 1) investigar a prevalência de Enterococcus faecalis nos casos de retratamento endodôntico e lesão periapical utilizando a técnica de cultura, PCR tradicional e nested PCR, e avaliar a suscetibilidade antimicrobiana e os fatores de virulência dos E. faecalis isolados dos canais radiculares investigados (Capítulo 1); 2) quantificar bactérias viáveis e endotoxinas em dentes com infecções endodônticas secundárias e correlacionar seus níveis com aspectos clínicos e radiográficos, e também avaliar o efeito do preparo químico-mecânico (PQM) com clorexidina 2% gel + EDTA 17% na redução de bactérias e endotoxinas. Também visou investigar determinadas espécies bacterianas Gram-negativas por meio da técnica de PCR (Capítulo 2). Métodos: Amostras microbiológicas foram coletadas de 30 canais radiculares de dentes com tratamento endodôntico prévio e lesão periapical após a remoção da guta-percha (C1) e após o PQM (C2). Técnicas de cultura microbiana, PCR (16S rDNA) e nested PCR foram empregadas para investigação de E. faecalis. Determinadas espécies bacterianas Gram-negativas foram investigadas por meio da técnica de PCR. Níveis de endotoxinas e unidades formadoras de colônias (UFCs) foram monitorados em C1 e C2, utilizando o método LAL e cultura, respectivamente. Cepas clínicas de E. faecalis foram testadas quanto sua suscetibilidade antimicrobiana frente a 12 tipos de antibióticos por meio do E-test. Fatores de virulência (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp e cylA) dos E. faecalis isolados foram investigados pela técnica de PCR. Resultados: E. faecalis foi encontrado pela técnica de cultura (7/30), PCR tradicional (13/30) e nested PCR (23/30). PCR tradicional e nested PCR revelaram maior sensibilidade do que a cultura na detecção de E. faecalis (p<0,05, teste McNemar). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15), T. denticola (1/15), T. socranskii (1/15) e T. forsythia (2/15) foram detectadas nos canais radiculares. Endotoxinas foram detectados em todos os casos (C1 e C2). Correlação positiva entre níveis de endotoxinas e destruição óssea periapical foi observada (p<0,05). E. faecalis apresentou-se suscetível frente à Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, Benzilpenicilina, Moxifloxacina e Vancomicina, entretanto algumas cepas mostraram resistência contra Eritromicina (3/12), Azitromicina (8/12), Rifampicina (4/12), Tetraciclina (2/12) e Doxiciclina (1/12). Foram encontrados os seguintes fatores de virulência nos E. faecalis isolados: ace e efaA (100%), gelE (91,6%), asa (83,3%), esp (25%) e cylA (16,6%). Conclusão: 1) A percentagem de E. faecalis encontrada variou dependendo da técnica empregada. Todos os E. faecalis isolados apresentaram fatores de virulência relacionados à aderência (genes ace e efa). Foi observada resistência frente a alguns antibióticos comumente utilizados na Odontologia (Capítulo 1); 2) Foram encontrados microrganismos e endotoxinas em todos os canais radiculares, antes e após o PQM. Os níveis de endotoxinas presentes inicialmente nos canais apresentaram associação com o tamanho da lesão periapical. O PQM com clorexidina 2% gel + EDTA 17% foi efetivo na redução da carga bacteriana e dos níveis de endotoxinas nos casos de infecção endodôntica secundária. (Capítulo 2) / Abstract: Introduction: Microorganisms resistant to the endodontic therapy or that invaded the root canal system after clinical disinfection procedures are considered the main causes of endodontic failure. Aims: 1) to investigate the prevalence of E. faecalis in cases of endodontic retreatment with periapical lesions using culture technique, traditional PCR and nested PCR; and also to evaluate the antimicrobial susceptibility and virulence factors of E. faecalis isolates (Chapter 1); 2) to quantify cultivable bacteria and endotoxin in root canals with secondary endodontic infection correlating their levels with the presence of clinical features; and also to evaluate the effect of chemomechanical preparation (CMP) with 2% chlorhexidine-gel + 17% EDTA on bacterial and endotoxin removal. Moreover, it was also aimed to investigate the presence of target strict Gram-negative anaerobic bacteria by PCR/ nested PCR (Chapter 2). Methods: Microbial samples were collected from 30 root-filled canals of teeth with secondary endodontic infection after removal of gutta-percha (S1) and after CMP (S2). Microbial culture techniques, PCR (16S rDNA) and nested PCR were used to investigate the presence of E. faecalis. Target Gram-negative bacteria species were investigated by PCR. Levels of endotoxin and CFU were monitored in S1 and S2, using the LAL assay and culture, respectively. Clinical strains of E. faecalis were tested for their antimicrobial susceptibility to 12 types of antibiotics by E-test. The virulence factors (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp and cylA) of E. faecalis isolates were investigated by PCR technique. Results: E. faecalis was found by culture technique (7/30), traditional PCR (13/30) and nested PCR (23/30). The traditional PCR and nested PCR technique revealed higher sensitivity for detection of E. faecalis than culture (p<0.05, McNemar's test). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15) T. denticola (1/15) T. socranskii (1/15) and T. forsythia (2/15) were detected in the root canals investigated. Endotoxins were detected in all cases (S1 and S2). Positive correlation between endotoxin levels and periapical bone destruction was observed (p <0.05). All E. faecalis strains were susceptible to Amoxicillin, Amoxicillin + clavulanic acid, Benzylpenicillin, Vancomycin and Moxifloxacin, however some strains showed resistant to Erythromycin (3/12), Azithromycin (8/12), Rifampicin (4/12), Tetracycline (2/12) and Doxycycline (1/12). The virulence factors of the E. faecalis strains were ace and efaA (100%), gelE (91.6%), asa (83.3%), esp (25%) and cylA (16.6%). Conclusion: 1) The percentage of E. faecalis found varied according to the technique employed. All E. faecalis isolated showed virulence factors related to adherence (genes ace and efa). They also showed resistance to some antibiotics commonly used in dentistry (Chapter 1); 2) Microorganisms and endotoxins were found in all root canals investigated, before and after CMP. The endotoxin levels initially found in the infected root canals were associated with a larger size of periapical radiolucent area. CMP with 2% chlorhexidine-gel + 17% EDTA was effective in reducing both bacterial load and endotoxin contents in the post-treatment apical periodontitis (Chapter 2) / Doutorado / Endodontia / Doutor em Clínica Odontológica

Neste estudo focamos no papel de cinco transportadores da família ABC (ATP-binding cassete) envolvidos com a captação ativa de oligopeptídeos, poliaminas, fosfato inorgânico, glutamato e glutamina, em duas espécies bacterianas: Streptococcus mutans, que causa a cárie, e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), responsável por diarreias e síndrome hemolítica urêmica em humanos. Com relação a inativação do sistema de transporte de oligopeptídeos de S. mutans não observamos alteração do crescimento bacteriano ou da aderência à superfícies abióticas. A deleção do sistema de captação de poliaminas não interferiu com o crescimento em meio rico, porém aumentou a resistência à ambiente ácidos. Inativação do sistema de transporte de fosfato inorgânico reduziu a aderência de S. mutans. Sobre os sistemas de transporte de glutamato e glutamina, mutantes de S. mutans apresentaram alterações nas taxas de crescimento e adesão à superfícies. Inativação da proteína OppA de EHEC não afetou a produção da toxina Stx bem como a patogenicidade in vitro e in vivo de EHEC. Em suma, o presente estudo demonstra que o papel dos transportadores ABC na fisiologia e patogenicidade de bactérias pode variar de acordo com a espécies bem como com o substrato transportado. / This study focuses on the role of five ABC (ATP-binding cassette) transport systems related to active uptake of oligopeptides, polyamines, inorganic phosphate, glutamate and glutamine. In this work we study two bacterial species: Streptococcus mutans, which causes caries, and enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC), responsible for diarrhea and hemolytic uremic syndrome in humans. The inactivation of the S. mutans oligopeptide transport system did not change the bacterial growth and adherence to abiotic surfaces. Inactivation of the polyamine uptake system did not interfere with growth in rich medium, but increased the survival of bacteria in acid environments. Inactivation of the inorganic phosphate transport system reduced the adherence of S. mutans. Regarding the glutamate and glutamine transport systems, the S. mutans mutants showed changes in growth rates and adhesion to abiotic surfaces. Inactivation of the EHEC OppA protein, did not affect the production of the Stx toxin neither affected the in vitro and in vivo pathogenicity of the strain. Collectively, the present study shows that the roles of ABC transporters in the physiology and pathogenicity of bacteria may vary according to the species involved as well as the substrate transported.

Orientador: Fernanda Lourenção Brighenti / Resumo: Este trabalho está dividido em 2 publicações cujos objetivos foram: a) realizar uma revisão sistemática da literatura, seguida de uma metanálise sobre a eficácia da terapia fotodinâmica (TFD) nos micro-organismos responsáveis pela cárie dentária (Publicação 1); b) avaliar o potencial in vitro dos óleos essenciais de Coffea arabica, Matricaria recutita e Eugenia uniflora e dos extratos vegetais de Senna splendida, Senna reticulata e Senna Macranthera para serem utilizados como monoterapia na terapia fotodinâmica sobre suspensões de micro-organismos de interesse médico-odontológico. Publicação 1: A questão de pesquisa e as palavras-chave foram construídas de acordo com a estratégia do PICO. A pesquisa do artigo foi realizada nas bases de dados Embase, Lilacs, Scielo, Medline, Scopus, Cochrane Library, Web of Science, Science Direct e Pubmed. Ensaios clínicos randomizados e estudos in vitro foram selecionados na revisão. O estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes do PRISMA para revisão sistemática. Publicação 2: Foram utilizadas as seguintes cepas de referência em suspensão: Cutibacterium acnes ATCC 6919, Streptococcus mutans ATCC 35688, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 e Candida albicans ATCC 90028. Os materiais vegetais foram testados nas concentrações de 50 μg/mL (extratos) ou 2% (óleos essenciais). Foram estudados cinco grupos: controle negativo, material vegetal sem exposição a luz (FS-luz), material vegetal com exposição a luz (FS+luz),... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias do gênero Leptospira. A patogênese da doença em humanos é observada principalmente no pulmão, fígado e rins. Neste trabalho, foi avaliado o papel da resposta imune inata na proteção contra a leptospirose usando camundongos como modelo experimental. Os animais foram infectados com L. interrogans e o desenvolvimento da doença foi acompanhado, observando-se a morte de animais C3H/HeJ, enquanto C3H/HePas apresentou icterícia e BALB/c não apresentou sintomas. O perfil de mRNA foi medido por qPCR nas amostras de rim, fígado e pulmão e as concentrações de proteinas TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, TGF-<font face=\"Symbol\">b, MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 e IL-8 foram analisadas por ELISA em extratos dos tecidos e no soro. Os resultados demonstraram que L. interrogans estimula a expressão prematura de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945;, TGF-<font face=\"Symbol\">b, MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 e IL-8 na linhagem BALB/c resistente à infecção. A análise histológica indica que estes mediadores podem estar relacionados com o influxo de diferentes células do sistema imune desempenhando importantes funções na proteção contra leptospirose. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by Leptospira. The pathogenesis in humans is mainly observed in lungs, livers and kidneys. In this work the role of innate immune response in protection against leptospirosis is being studied using different mice models. The animals were infected intraperitoneally with virulent cells of L. interrogans serovar Copenhageni and the development of the disease was followed, being observed mortality of C3H/HeJ mice, whereas C3H/HePas presented jaundice and BALB/c mice remained asymptomatic. Samples of liver, kidney, lungs and sera were analyzed following the profiles of mRNA and protein of the cytokines TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; and TGF-<font face=\"Symbol\">b and chemokine MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 and CXCL1/IL-8. We showed that Leptospira infection stimulates early expression of cytokine TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; and TGF-<font face=\"Symbol\">b and chemokine MCP-1, MIP-1<font face=\"Symbol\">&#945;, MIP-2 and IL-8 in the resistant mice strain BALB/c. Histological analysis indicates that the expression of those molecules can be related to the influx of distinct immune cells, which play a role in the naturally acquired protective immunity.

A deficiência da proteína C5 do sistema complemento humano é rara com 38 casos relatados na literatura e freqüentemente associada a severas infecções provocadas por bactérias Neisseria. O objetivo do trabalho é caracterizar imunológica e geneticamente esta deficiência encontrada pela primeira vez em brasileiros. Por imunodifusão dupla obtivemos níveis expressivos de C3, C4, C6, C7, C8, C9, Fator B, Fator H e Fator I em todos os membros desta família, a proteína C5 não foi detectada no soro de três irmãos: II:9, II:4 e II:5. Por ELISA a concentração de C5 nestes indivíduos foi (0,9; 1,0; 1,3 µg/ml, 45- 190 µg/ml). Soros destes probandos não apresentam atividade hemolítica mediada pelo sistema complemento. O cDNA de C5 dos indivíduos I:1, I:2, II:4 e II:9 apresenta a deleção do éxon 30. Causada pela substituição de GAG4028 por GAA4028 no último nucleotídeo deste éxon que leva a um erro no splicing. Este defeito provavelmente produz uma proteína incompleta e destinada à degradação. / The deficiency of the C5 component of the complement system is rare with 38 described cases in the literature. This deficiency is frequently associated with severe infections, especially caused by Neisseria. Our objective is to characterize immunologically and genetically this deficiency, the first of its type described in the Brazilian population.We noted that C3, C4, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor H and Factor I have expressive levels in all the individuals sera of this family. C5 was absent in individuals II:4, II:5 and II:9. By ELISA a C5 concentration in this individuals were 0,9; 1,0; 1,3 µg/ml (normal: 45 - 190 µg/ml). Their serum doesn´t present hemolytic activity mediated by complement system. The C5 cDNA from individuals I:1, I:2, II:4 and II:9 has éxon 30 deleted. Caused by the substitution of GAG4028 for a GAA4028 in the last codon of exon 30. This defect was responsible for the deficiency of C5 in this family and this deletion would probably produce an unstable protein destined for degradation.

As espécies Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa são responsáveis por infecções neonatais hospitalares. Lipopolissacarídeo (LPS) é o principal indutor de respostas inflamatórias. Os objetivos foram avaliar a transferência placentária de IgG reativa ao LPS de K. pneumoniae, E. coli O111, O26 e O6 e P. aeruginosa empregando ELISA para dosar IgG em soro materno e de cordão de 29 neonatos pré-termos e 32 a termo; analisar IgM total e específica no soro materno; e investigar a influência das patologias apresentadas pelas mães na transferência placentária. Concentrações de IgG total foram reduzidas em pré-termos como esperado, porem índices de transferência placentária de IgG total e IgG anti-LPS foram sistematicamente reduzidos quando comparados aos neonatos a termo. Níveis de IgM total e anti-LPS foram equivalentes em mães de ambos os grupos. As patologias das mães influenciaram os níveis de IgM no grupo de mães de pré-termos. Estes resultados indicam uma imunidade adquirida deficiente pelo grupo pré-termo aumentando os riscos de infecção. / Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa species are responsible for neonatal nosocomial infections. Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is the major inducer of the inflammatory responses. The aims were to evaluate the placental transfer of IgG reactive to LPS present in K. pneumoniae, in E. coli O111, O26 and O6 and in P. aeruginosa employing ELISA to detect IgG in maternal and cord sera from 29 preterm and 32 term neonates; to analyze total and specific IgM on the mothers sera; and to investigate the influence of the pathologies presented by some mothers in the placental transfer. Total IgG concentrations were reduced in preterm neonates as expected, but placental transfer indexes of total and anti-LPS IgG were systematically reduced when compared with term neonates. Total and anti-LPS IgM levels were equivalent on mothers of both groups. The mothers pathologies influenced only the IgM levels in the preterm mothers group. These results indicate a deficient acquired immunity by the preterm group increasing the risk of infection.

Introdução: Em estudo prospectivo, os efeitos da gastroplastia redutora com reconstrução em Y de Roux sobre a flora bacteriana e produção de citoquinas nas câmaras gástricas proximal e excluída foram estudados. Métodos: pacientes bariátricos (n=37) foram submetidos à avaliação endoscópica em ambos reservatórios gástricos,7,3+-1,4 anos após a gastroplastia. Idade foi de 42,4+-9,9 anos (70,2% sexo feminino), IMC pré-operatório de 53,5+-10,6, e IMC atual de 32,6+-7,8kg/m2. TNFalfa e TGF-beta foram medidos pelo método ELISA em biópsias da mucosa gástrica., assim como cultura quantitativa da secreção gástrica, com pH gástrico e teste respiratório lactulose/hidrogênio.Resultados: Nenhum dos pacientes apresentou queixas sugestivas de supercrescimento bacteriano gastrointestinal. Todavia, contagens elevadas de bactérias e fungos foram identificadas nas duas câmaras, principalmente no estômago proximal. Gram-positivos representaram a maioria dos isolados. O pH foi neutro na câmara proximal, enquanto que também na câmara distal nem sempre conservou-se em níveis esperados. Conclusões: 1)Produção elevadas de TNF-alfa e TGF-beta, com a colonização de aeróbios, anaeróbios e fungos em ambas câmaras gástricas foram identificadas; 2)O pH gástrico como a contagem bacteriana foram maiores no estômago proximal funcionante; 3)Teste respiratório foi positivo para supercrescimento bacteriano em 40,5% dos pacientes,entretanto não foram identificadas manifestações clínicas de supercrescimento bacteriano gastrointestinal. / Background: In a prospective study, the effect of Roux-en-Y gastric bypass (RYGBP) on bacterial flora and cytokines production in the used (proximal pouch) and unused (large bypassed) gastric chamber was analysed. Methods: Bariatric subjects (n=37) were submitted to endoscopic examination of both gastric reservoirs, 7.3 ± 1.4 years after RYGBP. Age was 42.4 ± 9.9 years (70.2% females), preoperative BMI was 53.5 ± 10.6, and current BMI was 32.6 ± 7.8 kg/m2.TNF-alpha and TGF-beta were meausured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) from gastric mucosal biopsies. Quantitative culture of gastric secretion along with gastric pH and actulose/hydrogen breath test were also investigated.Results: None of the subjects displayed complaints suggestive of GI bacterial overgrowth. Elevated counts of bacteria and fungi were identified in both chambers, mostly in the proximal stomach. Gram-positives represented the majority of the isolates. Gastric pH was neutral in the proximal pouch, whereas the distal chamber mostly but not always onserved the expected acidity. Conclusions: 1)Increased TNF-alpha and TGFbeta production, as aerobes, anaerobes and fungi colonization of both gastric chambers was detected; 2) Gastric pH as well as bacterial count was higher in the functioning proximal stomach; 3) Breath test was positive for bacterial overgrowth in 40.5% of the subjects, however clinical manifestation of GI bacterial overgrowth were not demonstrated

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica subcutânea causada por fungos da família Dematiceae sendo o principal agente etiológico o fungo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi). Estes fungos induzem uma lesão crônica na pele de freqüente recidivas. O objetivo do trabalho foi avaliar alguns aspectos imunológicos na cromoblastomicose experimental através de dois modelos de infecção pelas vias: intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.). No primeiro modelo de infecção pela via s.c. em camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi, ocorreu a cura espontânea da infecção em aproximadamente 4 semanas. Na subtipagem de linfócitos T em linfonodos regionais ocorreu um predomínio de células T CD4+ que foi constante até a 4ª semana de infecção, no entanto, observamos aumento significativo de linfócitos T CD8+ ao longo da infecção sugerindo que essa população tenha também uma importante participação no controle da doença. Os ensaios de linfoproliferação demonstraram, na 1ª semana de infecção, elevado índice de proliferação celular quando as células de linfonodos foram estimuladas in vitro com antígenos de F. pedrosoi, além da liberação principalmente da citocina IFN-&#947;, já na 4ª semana de infecção não foi detectado proliferação celular. Esses resultados sugerem que no início da infecção a resposta celular seja mediada principalmente por linfócitos T CD4+ produtores de IFN-&#947;, o que nos sugere, que neste modelo experimental, polarize uma resposta de células T do tipo Th1. No segundo modelo de infecção, via intraperitoneal (i.p.), camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi mostraram desenvolvimento de infecção crônica com preservação da imunidade celular mesmo após a 8ª semana. Ainda pela via i.p., os camundongos C57BL/6 nocautes de T CD4+ apresentaram uma maior carga fúngica no início da infecção e em tempos mais tardios a carga fúngica foi semelhante aos camundongos controles (C57BL/6); esses mesmos animais nocautes não apresentaram uma ativação da resposta celular medida pelo teste de HTT (Hipersensibilidade do Tipo Tardio). Quando avaliamos o padrão de citocinas, a citocina IFN-&#947; produzida pelos órgãos baço e fígado apresentou menores níveis no início da infecção quando comparado ao camundongos controle. Já os níveis de IL-10 aumentaram gradativamente ao longo da infecção e IL-4 não apresentou diferenças em relação ao controle. Nos camundongos nocautes para coa (C57BL/6 CD8 \"KO\"), a carga fúngica, os níveis de citocinas e o teste de HTT foram semelhantes aos animais controle. Esses resultados mostraram que pela via i.p. os linfócitos T, principalmente células T CD4+ são importantes no controle inicial da infecção. Em tempos mais tardios a infecção foi controlada mesmo em camundongos deficientes de linfócitos TCD 4+ ou T CD8+, sugerido que outras células como macrófagos ou NK, estariam atuando de forma mais efetiva no controle da infecção. / Abstract not available.

A sepse bacteriana constitui a causa mais frequente de óbitos neonatais, e seu diagnóstico é complexo devido à inexistência de um teste laboratorial definitivo. O presente estudo desenvolveu uma técnica de amplificação quantitativa (qPCR) do gene 16S rDNA de bactérias tanto para o diagnóstico de sepse neonatal, quanto para avaliar se a qPCR é capaz de monitorar o tratamento. Para ser recrutado o RN deveria apresentar ao menos dois sinais/sintomas sugestivos de sepse, e dois parâmetros laboratoriais alterados. Amostras de sangue foram colhidas no tempo zero (suspeita de sepse), 48 horas e sete dias após o início da antibioticoterapia. Foram analisados 73 RN (21 RNT e 52 RNPT) com suspeita de sepse neonatal. A hemocultura foi positiva em 32 RN (43,8% - sepse confirmada) e negativa em 41 (56,2% - sepse clínica), enquanto a qPCR foi positiva em 65 RN (89%) e negativa em oito casos (11%). Dentre os 32 RN com sepse confirmada (11 RNT e 21 RNPT), neutrofilia foi encontrada em 22 (68,75%), CRP elevada em 21 (65,62%), plaquetopenia em 15 (46,87%) e leucopenia em 14 (43,75%). Foram analisadas 200 amostras dos 73 casos suspeitos, considerando os três tempos de coleta, resultando em 36 hemoculturas positivas (18,0%) e 135 qPCR positivas (67,5%). Nas 36 hemoculturas positivas houve 38 isolamentos. Bactérias Gram-positivas foram encontradas em 32 amostras (84,21%) e Gram-negativas em seis (15,78%). Staphylococcus coagulase negativa predominou dentre as Gram-positivas (75,0%). No grupo de 32 RN com sepse confirmada a qPCR foi positiva em 30 (30/32 - 93,7%). Em 14 casos (47%) a qPCR antecipou o diagnóstico de sepse quando comparada à hemocultura e foi positiva no tempo zero em 22 casos (68,75%), enquanto a hemocultura foi positiva em 11. Dos 41 casos de sepse clínica, a qPCR foi positiva em 35 (85,4%); em 26 casos (74,3%) já no tempo zero. O teste de McNemar encontrou discordância entre os resultados das hemoculturas e qPCR (p<0,0001, IC de 95%), indicando superioridade da qPCR. Houve nove óbitos na casuística, todos com hemocultura e qPCR positiva. Em seis dos nove óbitos somente a terceira hemocultura foi positiva, enquanto a qPCR foi positiva em cinco casos já no tempo zero e não negativou em seis casos. A qPCR empregou a técnica de touchdown, com temperaturas de annealing decaindo de 66 a 62oC, limiar de detecção entre 1-10 UFC/mL. As cargas bacterianas foram em geral baixas (< 50 UFC/mL) mesmo nos casos com sepse confirmada e óbitos, porém quando as medianas das cargas bacterianas no tempo zero dos grupos com sepse confirmada (37,10 UFC/mL) e sepse clínica (24,49 UFC/mL) foram comparadas, foi encontrada uma diferença estatisticamente significante (p=0,0402). O estudo concluiu que a qPCR é capaz de detectar mais casos de sepse neonatal que a hemocultura, antecipando o diagnóstico na maior parte deles. Em relação à monitorização do tratamento, a qPCR apresentou associação com o sucesso ou falha terapêutica, negativou em casos que tiveram evolução favorável, não negativou na maior parte dos óbitos, porém há necessidade de confirmação destes dados / Bacterial sepsis constitutes one of the most frequent causes of neonatal deaths and its diagnosis is difficult due to the lack of a definitive laboratorial approach. The present study developed a bacterial 16S rDNA-based quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) both to the diagnosis of neonatal sepsis and to evaluate if qPCR is capable of monitoring antimicrobial treatment. For enrollment, the newborn (NB) should present, at least, two signs/symptoms suggestive of sepsis, and two abnormal laboratory parameters. Blood samples were collected on day zero (suspected sepsis), 48 hours and 7 days after the initiation of antibiotic therapy. Seventy-three newborns with suspected sepsis were recruited (21 term NB and 52 preterm NB), blood culture was positive in 32 (43.8% - confirmed sepsis) and negative in 41 (56.2% - clinical sepsis), while qPCR was positive in 65 (89.0%) and negative in 8 cases (11.0%). Considering the group of 32 NB with confirmed sepsis (11 TNB and 21PTNB), qPCR was positive in 30 (30/32 - 93.7%). Neutrophilia was found in 22 NB (68.75%), elevated CRP in 21 (65.62%), thrombocytopenia in 15 (46.87%) and leukopenia in 14 (43.75%). Of the 73 cases, taking into account the three collected samples (day zero, 48h and 7 days), 200 samples were analyzed, with 36 positive blood culture (18.0%) and 135 positive qPCR (67.5%). Of the 36 positive blood cultures, there were 38 bacterial isolations. Gram-positive bacteria were found in 32 samples (84.21%) and Gram-negative in 6 (15.78%). Coagulase-negative Staphylococcus was predominant in the Grampositive group (75.0%). In 14 cases, qPCR anticipated the diagnosis when compared with blood culture, and was positive in 22 cases on day zero (68.75%), whereas blood culture was positive in 11. Among the 41 cases of clinical sepsis, qPCR was positive in 35 (85.4%); of these 26 (74.3%) on day zero. McNemar test found discordance between the results of blood cultures and qPCR (p < 0.0001, CI of 95%), indicating superiority of qPCR. There were nine deaths in the casuistic, all with positive blood culture and qPCR. In six of the nine deaths only the third blood culture was positive, while qPCR was positive in five cases already on day zero, and was still positive in the third sample in 6 cases. The qPCR employed the touchdown technique, with annealing temperatures decreasing from 66 to 62oC, detection threshold between 1-10 CFU/ml. Bacterial loads were generally low ( < 50 CFU/ml), even in those cases with confirmed sepsis and deaths, however when bacterial load medians on day zero were compared between confirmed (37.1 CFU/ml) and clinical (24.49 CFU/ml) sepsis groups, a statistically significant difference was found (p = 0.0402). The study concluded that qPCR can detect more cases of neonatal sepsis than blood culture, anticipating the diagnosis in most of them. Regarding the monitoring of treatment, qPCR was associated with success or treatment failure, became negative in cases that progressed favorably, remained positive in the majority of the deaths, however these data need to be confirmed

Quarenta e nove amostras EPEC típica (tEPEC) e atípica (aEPEC) pertencentes a diferentes sorotipos, isoladas de humanos e animais (cães, gatos, bovinos, ovinos, coelhos e sagüis) foram investigadas quanto ao perfil de virulência pela PCR e similaridade clonal por Multilocus Sequence Typing (MLST) e Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). O objetivo deste estudo foi verificar se animais atuam como reservatório e fonte infecção de aEPEC para humanos. Os marcadores de virulência analisados revelaram que cepas aEPEC isoladas de animais possuem potencial para causar diarréia em humanos. As técnicas MLST e PFGE revelaram que amostras isoladas de animais e humanos compartilham relações clonais próximas ou idênticas. Estes resultados indicam que os animais estudados atuam como reservatório de aEPEC e representam fonte de infecção para humanos. Pelo fato de humanos, também atuarem como reservatório de aEPEC, ciclos de infecção cruzada animal-humano não podem ser descartados, pois a dinâmica de transmissão entre reservatórios de aEPEC não é muito bem compreendida. / Forty-nine typical and atypical EPEC strains belonging to different serotypes, isolated from humans, pets (cats and dogs), farm (bovines, sheep and rabbits) and wild animals (monkeys) were investigated for virulence markers and clonal similarity by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). The virulence markers analyzed revealed that atypical EPEC strains isolated from animals have the potential to cause diarrhea in humans. Close clonal relationship between human and animal isolates was found with MLST and PFGE. These results indicate that these animals act as atypical EPEC reservoirs and may represent sources of infection for humans. Since humans also act as a reservoir of atypical EPEC strains, the cycle of mutual infection of atypical EPEC between animals and humans, mainly pets and their owners, cannot be ruled out, since the transmission dynamics between the reservoirs are not yet clearly understood.