L'infertilité masculine est une préoccupation croissante dans les sociétés modernes. Parmi les différentes causes d'infertilités masculines, certaines ont une origine génétique. C'est le cas de la globozoospermie de type I, une infertilité sévère caractérisée par la production exclusive des spermatozoïdes ayant une tête ronde et sans acrosome. Cette pathologie présente un phénotype complexe associant à l'absence de l'acrosome, des défauts de compaction nucléaire, des lésions de l'ADN et une déficience d'activation ovocytaire.Récemment notre équipe a montré que le gène DPY19L2 est impliqué dans 60 à 80% des cas de globozoospermie de type I et représente donc la cause majeure de la globozoospermie de type I chez l'homme. La fonction de la protéine étant complètement inconnue au moment de l'identification du gène DPY19L2, nous avons alors réalisée une étude fondamentale sur les mécanismes moléculaires expliquant la pathogénie moléculaire de cette maladie et avons démontré, grâce à l'utilisation du modèle des souris KO pour le gène Dpy19l2, que la protéine est localisée dans la membrane nucléaire interne et est nécessaire à l'ancrage de l'acrosome sur l'enveloppe nucléaire. Dans le but d'identifier d'autres acteurs impliqués dans l'attachement de l'acrosome au noyau spermatique, nous nous sommes intéressés à l'étude de la protéine Sun5 de l'enveloppe nucléaire interne située en regard de l'acrosome qui pouvait être un partenaire de Dpy19l2. On a trouvé que les deux protéines n'étaient pas des partenaires puisque Sun5 était, contrairement à ce qui a été décrit dans la littérature, du côté postérieur opposé à l'acrosome. En deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la compréhension des principales causes moléculaires de l'absence de fécondation ou du très faible taux de réussite lors d'ICSI réalisées avec des spermatozoïdes globozoospermiques.Pour ce faire, nous avons recherché la protéine PLC ζ, le principal facteur spermatique activateur de l'ovocyte, dans les spermatozoïdes humains provenant de patients délétés pour le gène DPY19L2 et murins (de souris KO Dpy19l2-/-) et avons montré qu'effectivement cette protéine est absente tant chez les patients que dans le modèle d'étude murin. Nous avons également réalisé une étude comparative des principales étapes de la compaction du génome spermatique entre les souris mâles WT et Dpy19l2-/- et nous avons montré que la compaction du génome des spermatozoïdes globozoospermiques était défectueuse avec un défaut de protamination et une rétention des histones. Ainsi, la déficience en PLC ζ, les défauts de compaction et le taux élevé de fragmentation de l'ADN sont susceptibles d'expliquer l'échec de la fécondation après ICSI, et le développement très réduit des embryons issus des patients déficients pour le gène DPY19L2 ainsi que des souris Dpy19l2-/-. La compréhension de cette physiopathologie devrait permettre la proposition de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d'améliorer le taux du développement embryonnaire en AMP. / Male infertility is a growing concern in modern societies. Among the various causes of male factor infertility, some have a genetic origin. This is the case of type I globozoospermia, a severe infertility characterized by the presence in the ejaculate of a majority of round spermatozoa devoid of acrosome. This pathology presents a complex phenotype associating to the absence of the acrosome, sperm nuclear compaction defects, DNA damage and failure in egg activation.Recently our team identified the DPY19L2 gene as responsible for a large majority of pure globozoospermia cases (>80%) and therefore represents the major cause of type I globozoospermia in humans. The function of the protein was completely unknown at the time of identification of DPY19L2 gene, we then performed a fundamental study of the molecular mechanisms underlying the molecular pathogenesis of the disease and have shown, through the use of knockout mice model for the Dpy19l2 gene, that the protein is localized in the inner nuclear membrane and is necessary for the anchoring of the acrosome to the nuclear envelope. In order to characterize new actors of acrosome attachment, we assessed the importance of Sun5 (also called Spag4l) in acrosome attachment which was previously shown to be expressed in NE of spermatogenic cells, facing the acrosome and that could be a partner of Dpy19l2. Interestingly we demonstrate that Sun5 and Dpy19l2 are not partners and that Sun5, is not as initially reported, facing the acrosome but is in fact excluded from this zone. We were also interested in understanding the main molecular causes of the poor fertilization ability or the very low success rate in ICSI when performed with globozoospermics sperm.Therefore we have searched the PLC ζ protein, the sperm factor thought to induce the Ca2+ oscillations responsible for egg activation, in human spermatozoa from patients with DPY19L2 deleted gene and in murine spermatozoa from Dpy19l2 Knock-Out mice and showed that actually this protein is absent both in patients and in KO mice. We also made a comparative study of the main stages of genome compaction of sperm from both WT and Dpy19l2 KO mice and we showed that Dpy19l2 deficient sperm displays defective genome condensation and DNA alterations. Thus, PLC ζ deficiency, the compaction defects and the high rate of DNA fragmentation may explain the failure of fertilization after ICSI, and the poor development of embryos from patients deficient for the gene DPY19L2 as well as Dpy19l2 KO mice.Understanding the physiopathology of globozoospermia should allow the proposal of new therapeutic strategies that improves the rate of embryonic development in ART.

L'infertilité masculine concerne plus de 20 millions d'homme à travers le monde et représente un véritable enjeu de santé public. Bien que multifactorielle, l'infertilité masculine a une composante génétique importante qui jusqu'à présent n'a été que peu étudiée. L'objectif de mon travail a été d'initier et de poursuivre les investigations génétiques sur trois phénotypes de tératozoospermie: les spermatozoïdes macrocéphales, la globozoospermie et les anomalies morphologiques multiples des flagelles (AMMF).Pour le premier phénotype, nous avons étudié 87 patients, dont 83 cas-index, présentant un phénotype de macrozoospermie. Nous avons trouvé la mutation c.144delC dans le gène AURKC chez 82% des patients (68/83) confirmant qu'il s'agit de l'évènement génétique prépondérant pour ce phénotype. Une nouvelle mutation récurrente, p.Y248*, entrainant la dégradation totale du transcrit anormal par nonsense-mediated mRNA decay, a été retrouvée chez 10 patients non‐apparentés. L'identification de deux mutations ancestrales dans AURKC maintenues au cours de l'évolution malgré leur effet délétère sur la reproduction chez l'homme homozygote, ouvre la question d'un potentiel avantage sélectif procuré par l'haplo-insuffisance d'AURKC.Pour le second phénotype, nous avons analysé une cohorte de 34 patients globozoospermiques par séquençage et MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Au total, la délétion homozygote de DPY19L2 a été retrouvée chez 22 patients sur 30 cas non apparentés (73.3%) et 3 nouvelles mutations ponctuelles ont été identifiées. Ces résultats indiquent que l'analyse moléculaire de DPY19L2 des patients globozoospermiques ne devrait pas être limitée à la recherche de la délétion homozygote de DPY19L2. Dans un second temps, nous avons démontré que la délétion récurrente de DPY19L2 était médiée par le mécanisme de recombinaison homologue non allélique (NAHR) entre deux séquences répétées homologues (LCR) de 28kb situées de chaque côté du gène. La très grande majorité des points de cassure surviennent dans une région de 1,2 kb située dans la partie centrale des LCRs. Cette région minimale de recombinaison est elle‐même centrée sur une séquence consensus de 13 nucléotides reconnue par PRDM9, une protéine à doigts de zinc qui favorise la survenue des cassures doubles brins initiant les processus de recombinaisons. Les modèles théoriques prédisent que, lors de la méiose, le mécanisme NAHR génère de novo plus d'allèles recombinés délétés que dupliqués. Étonnamment, dans la population générale les allèles DPY19L2 dupliqués sont trois fois plus fréquents que les allèles délétés. Nous avons développé une PCR digitale sur le sperme afin de mesurer le taux de délétions et de duplications de novo à ce locus chez des témoins. Tel qu'il était prédit par le modèle de NAHR, nous avons identifié un taux de délétions supérieur à celui des duplications. Ce paradoxe peut s'expliquer par la sélection qui s'opère à l'encontre des hommes infertiles porteurs de la délétion homozygote et potentiellement des hommes porteurs d'une délétion hétérozygote.Enfin pour le troisième phénotype, nous avons réalisé l'analyse par cartographie par homozygotie de 20 patients infertiles, dont 18 cas-index, présentant des anomalies morphologiques du flagelle. Cinq mutations homozygotes ont été identifiées dans le gène DNAH1 parmi les 18 patients non-apparentés (28%). Ce gène code pour une chaine lourde des bras internes de dynéine exprimée dans le testicule. Des analyses d'immunofluorescence et de RT-PCR ont confirmé le caractère pathogène d'une de ces mutations situées sur un site donneur d'épissage. Les analyses par microscopie électronique ont révélé une désorganisation générale de l'axonème incluant une disparition des doublets centraux et des bras internes de dynéine suggérant que DNAH1 est une protéine clé dans la biogenèse du flagelle du spermatozoïde. / Male infertility affects more than 20 million men worldwide and represents a major health concern. Although multifactorial, male infertility has a strong genetic basis which has so far not been extensively studied. The objectives of my thesis were to initiate and conduct some genetic investigations on three specific phenotypes of teratozoospermia: macrozoospermia, globozoospermia and multiple morphological abnormalities of the flagella (MMAF).For the first phenotype, we studied 87 patients with macrozoospermia, including 83 index cases, and identified c.144delC, a pathogenic mutation in the AURKC gene in 82% of patients (68/83) confirming that this variant is the main cause of macrozoospermia. A new recurrent mutation, p.Y248*, leading to degradation of the mutant transcripts by non-sense mediated mRNA decay was identified in 10 unrelated patients. Patients with no identified AURKC mutation have a decreased rate of spermatozoa with a large head and multiple flagella. Identification of two ancestral mutations in AURKC maintained during evolution despite their negative effect on reproduction in homozygous men, raises the question of a potential selective advantage provided by the AURKC haploinsufficiency.For the second phenotype, we first analyzed 34 patients presenting with globozoospermia using MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) and Sanger sequencing. In total, 22 of the 30 unrelated patients where homozygous for the DPY19L2 deletion (73.3%) and 3 novel point mutations were identified. These results suggest that the molecular investigation of the DPY19L2 gene in globozoospermic patients should not be limited to the detection of the DPY19L2 genomic deletion and open interesting perspectives for the identification of DPY19L2 partners during acrosome biogenesis. Subsequently, we demonstrated that the genomic deletion was mediated by Non-Allelic Homologous Recombination (NAHR) between two homologous 28-Kb Low Copy Repeats (LCRs) located on each side of the gene. The vast majority of genomic breakpoints fell within a 1.2-Kb region central to the 28-Kb LCR. A 13-mer consensus sequence is located in the centre of that 1.2-Kb region recognized by PRDM9, a multi-unit zinc finger binding protein that promotes the formation of double-strand breaks (DSBs) initiating the homologous recombination process. The accepted theoretical NAHR model predicts that during meiosis, NAHR produces more deleted than duplicated alleles. Surprisingly, array-CGH data show that, in the general population, DPY19L2 duplicated alleles are approximately three times as frequent as deleted alleles. In order to shed light on this paradox, we developed a sperm-based digital PCR to measure the de novo rates of deletions and duplications at this locus. As predicted by the NAHR model, we identified an excess of de novo deletions over duplications. These discording results may be explained by the purifying selection against sterile, homozygous deleted men. Heterozygous deleted men might also suffer a small fitness penalty.Lastly, for the third phenotype, homozygosity mapping was carried out on a cohort of 20 North African individuals, presenting with primary infertility resulting from impaired sperm motility caused by a mosaic of multiple morphological abnormalities of the flagella (MMAF). Five unrelated subjects out of 18 (28%) carried a homozygous variant in DNAH1, which encodes an inner dynein heavy chain and is expressed in testis. RT-PCR and immunostaining studies confirmed the pathogenic effect of one of these mutations located on a donor splice site. Electronic microscopy revealed a general axonemal disorganization including mislocalization of the microtubule doublets and loss of the inner dynein arms suggesting that DNAH1 plays a critical role in sperm flagellum biogenesis and assembly.

Près de 15% des couples sont confrontés à des problèmes d'infertilité. Dans près de la moitié des cas, une composante masculine est retrouvée, avec souvent une anomalie des paramètres du spermogramme montrant une diminution de la qualité du sperme. L'étiologie de la grande majorité des infertilités masculines reste inconnue et une origine génétique est probablement responsable d'une proportion importante des troubles de la spermatogénèse. Ce travail comporte deux parties: dans la 1ère partie, l'analyse d'une large cohorte de patients (n=87), nous a permis d'identifier deux nouvelles mutations du gène AURKC. La mutation [c.36-2A>G] a été identifiée uniquement à l'état hétérozygote chez deux frères et le 2ème variant identifié [p.Y248*]: est une mutation récurrente retrouvée chez 11 patients non apparenté d'origine maghrébine et européenne. La 2ème partie de notre étude a été réalisée sur 20 patients infertiles présentant un phénotype homogène d'anomalies flagellaire de type flagelles courts, absents et de calibre irrégulier associé a une asthénozoospermie. Nous avons appliqué la stratégie d'homozygotie par filiation qui a permis de mettre en évidence deux régions d'homozygoties communes: la 1ère région, située sur le chromosome 3, est commune à 9/20 patients et la 2ème sur le chromosome 20 commune à 13/20 patients. Trois gènes candidats présents dans ces régions ont été sélectionnés : les gènes KIF9, SPAG4 et DNAH1. Le séquençage du gène DNAH1 a permis de mettre en évidence des mutations de type faux-sens [c.3877G>A], run-on [c.12796 T>C] et d'épissage [c.5094+1G>A] [c.11958-1G>A]. L'absence de la protéine DNAH1 a pu être mise en évidence par immunomarquage sur les spermatozoïdes d'un patients porteur de la mutation [c.11958-1G>A] et confirme la dégradation du transcrit muté par NMD également observé. Les analyses par microscopie électronique sur les spermatozoïdes d'un patient de la cohorte ont permis de mettre en évidence des anomalies de la structure de l'axonème. Cette étude précise le diagnostic d'infertilité masculine et élargit les connaissances sur les gènes impliquées dans la spermatogenèse. / About 15% of couples are confronted with infertility problems. In half of the cases, a male factor component is found, often with abnormal semen parameters. The etiology of the large majority of male infertility remains unknown and genetic origin is probably responsible of a significant proportion of spermatogenesis disorders. This work comprises two parts: in the first part, the analysis of a large cohort of patients (n = 87), allowed us to identify two new mutations in AURKC gene. A splice site mutation [c.36-2A> G] was identified in only two brothers and the second variant identified [p.Y248*] is a recurrent mutation found in 11 unrelated patients. The second part of our study was carried out on 20 infertile patients with flagellar abnormalities associated with asthenozoospermia. We have applied the strategy of homozygosity by descent who has bring out two regions of homozygosity: the first region, located on chromosome 3, is common for 9/20 patients and the second one, located on chromosome 20, is common for 13/20 patients. Three candidate genes present in these regions were selected: KIF9, SPAG4 and DNAH1. Sequencing of DNAH1 gene has bring out three type of mutations: missense mutation [c.3877G> A], run-on mutation [c.12796 T> C] and splice site mutation [c.5094 +1 G> A] [c.11958-1G> A]. The absence of dnah1 protein has been shown by immunostaining of spermatozoa of a patient carrier the mutation [c.11958-1G> A] and confirms the degradation of the mutated transcript by NMD. An electron microscopic analysis of spermatozoa of one patient of the cohort reveals axoneme abnormalities. This study clarifies the diagnosis of male infertility and broadens the knowledge of the genes involved in spermatogenesis.

La spermatogenèse est le processus par lequel les cellules germinales se différencient pour former les spermatozoides. Elle se déroule à l’intérieur des tubes séminifères. Pendant la période embryonnaire, les précurseurs des cellules germinales adultes constituent un pool de cellules appelées cellules germinales primordiales (Primordial Germ Cells, PGCs), qui vont migrer pour aller coloniser les gonades (Durcova-Hills and Capel, 2008; Surani et al., 2008). Au cours de leur migration, les PGCs vont subir une reprogrammation épigénétique de l’ensemble de leur génome, qui leur sera nécessaire pour passer de l’état somatique à l’état de totipotence (Ohinata et al., 2005). Durant cette reprogrammation, l’ADN est massivement démethylé, entrainant l’activation de plusieurs gènes qui sont importants pour le développement des PGCs, mais également l’activation des éléments transposables (ETs) (Hajkova et al., 2008; Sasaki and Matsui, 2008; Surani and Hajkova, 2010). Ces derniers constituent environ 50% du génome des mammifères. Ils sont subdivisés en deux classes et sont connus par leur capacité à être mobilisés dans le génome (Zamudio and Bourc'his, 2010). Cette mobilisation se fait au hasard et constitue ainsi un risque considérable de mutations, qui peuvent provoquer des tumeurs, des pathologies de développement et une infertilité (Zamudio and Bourc'his, 2010). Pour cela, leur expression doit être contrôlée pour maintenir l’intégrité du génome de la lignée germinale. Pour toutes ces raisons, les PGCs ainsi que les cellules germinales en cours de méiose ont développé des stratégies de défenses pour contrôler la mobilisation et l’expression des ETs basées entre autre sur la voie des piwi-interacting RNA (piRNA) (Chuma and Pillai, 2009; Pillai and Chuma, 2012b). Dans le laboratoire du Pr. Stéphane Viville, mes travaux de thèse se sont concentrés sur l’étude d’un gène nommé Tex19 pour Testis Expressed gene chez la souris. Nous avons démontré que ce gène est spécifique des mammifères et est dupliqué chez le rat et la souris en deux paralogues nommés Tex19.1 et Tex19.2. Deux domaines hautement conservés ont été identifiés par alignement multiple des protéines TEX19 et nommés MCP et VPTEL. Ces domaines ne présentent aucune homologie avec des domaines déjà caractérisés, prévenant ainsi toute prédiction de leurs fonctions (Kuntz et al., 2008). L’étude du profil d’expression de Tex19.1 et Tex19.2 a montré que ces deux gènes sont exprimés dans l’ectoderme et les PGCs. Ils sont aussi co-exprimés dans le testicule de l’âge embryonnaire à l’âge adulte. Néanmoins, seul Tex19.1 est exprimé dans les ovaires et le précurseur du placenta appelé cône ectoplacentaire (Celebi et al., 2012). Le knockout (KO) de Tex19.1 provoque une infertilité masculine chez la souris avec un arrêt de la spermatogenèse au stade pachytène, accompagnée d’une surexpression d’un rétrotransposon, MMERVK10C (Ollinger et al., 2008). Récemment, il a été démontré que Tex19.1 joue aussi un rôle dans le développement du placenta (Reichmann et al., 2013). Au cours de mes trois années de thèse, nous avons approfondie l’étude du KO de Tex19.1dans le testicule, les cellules embryonnaires souches (Embryonic Stem Cells, ESCs) et le placenta (Tarabay et al., 2013). Nous avons également étudié le phénotype observé suite au double KO de Tex19.1 et Tex19.2. [...] / We recently characterized two new mammalian specific genes, Tex19.1 and its paralog Tex19.2. Both genes are expressed in pachytene spermatocytes in adult testes. In addition, Tex19.1 is expressed in pluripotent cells (ES, EG, iPS and PGC cells), the inner cell mass of the blastocysts and the placenta. In order to decipher Tex19 functions, we generate three types of knockout (KO): i) KO of Tex19.1 ii) KO of Tex19.2 iii) double KO (DKO) of both genes. All Tex19.1-/- KO animals are growth-retarded and half of them die just after birth. This phenotype is probably linked to placenta defects. Surviving adults Tex19.1-/- KO males display a variable spermatogenesis phenotype, associated with an up-regulation of one endogenous retrovirus, MMERVK10C. Tex19.2 KO mice exhibit a subtle phenotype. Few seminiferous epitheliums are degenerated while the rest appear normal. DKO show a fully penetrant phenotype similar to the most severe Tex19.1-/- phenotype. DKO males exhibit small testes. Despite the presence of spermatogonia and spermatocytes, spermatogenesis is blocked at the pachytene stage. By RNA deep-sequencing on 10 days old DKO and WT testes, prior to histological phenotype, 114 genes are significantly up-regulated and 320 genes significantly down-regulated in the DKO compared to the WT. Gene ontology analyses show that among of these genes, two essential pathways are altered: meiosis and the piRNA pathway. Consistent with that, GST-pulldown and immunoprecipitation experiments demonstrate that MIWI, MILI, MAEL and MVH are partners of TEX19. Considering PIWI proteins function in the silencing of transposable elements through the piRNA pathway, we checked if TEX19 paralogs bind piRNA. By immunoprecipitation using WT and KO testes, we show that both TEX19.1 and TEX19.2 bind small RNA of 30 nucleotides through their VPTEL domain. This study highlights the pivot role of Tex19 paralogs in three essential functions of mammalian life cycle, i.e. pluripotency, placenta-supported in utero growth and fertility. The functional similarities of both paralogs, through the expression control of one endogenous retrovirus and the binding of piRNAs, lead us to propose that Tex19 paralogs are new members of the piRNA pathway.

Malgré les progrès réalisés en procréation médicalement assistée, les patientes ayant une infertilité utérine (IU) ne peuvent à ce jour mener une grossesse, contrairement aux patientes présentant une infertilité d’origine ovarienne ou tubaire. La transplantation utérine (TU) pourrait être une alternative à l’adoption et à la gestation pour autrui (GPA). Objectifs : Réalisation d’études expérimentales, translationnelles et cliniques.Méthodologie : Au cours de cette thèse, des travaux expérimentaux chez la brebis ont compris l’évaluation de l’IRM pelvienne, la réalisation d’allo-transplantation utérine, l’étude d’un modèle d’immunosuppression et l’évaluation originale de la tolérance à l’ischémie froide de l’utérus utilisant la membrane chorio-allantoïdienne d’embryon de poulet (CAM). Les études translationnelles et cliniques ont compris l’évaluation du prélèvement utérin (PU) au sein d’un prélèvement multi-organe (PMO) avec analyse de la tolérance à l’ischémie froide de l’utérus humain, l’évaluation de l’expression HLA par immunohistochimie du tissu utérin et l’évaluation de l’intérêt vis-à-vis de la TU.Résultats : L’IRM semble être l’examen de choix pour l’évaluation du greffon utérin. L’allo-transplantation utérine chez la brebis est complexe notamment en raison de la difficulté d’obtenir une immunosuppression optimale. L’administration de ciclosporine à travers une gastrostomie optimise l’exposition au traitement mais n’est pas envisageable à moyen terme. La greffe de tissu utérin sur CAM a révélé la capacité de l’endomètre à proliférer après 24 heures d’ischémie froide suggérant une tolérance à l’ischémie supérieure à celle du myomètre. La réalisation d’un PU au sein d’un PMO semble reproductible. L’exposition des tissus utérins à 24 heures d’ischémie froide n’a pas révélé de modifications histologiques majeures ni de majoration du signal apoptotique par TUNEL ou Caspase 3 clivée. L’expression forte HLA I et II par l’endomètre suggère l’utilisation, en cas de TU, d’un protocole d’immunosuppression optimal et d’un appariement HLA. Enfin, la population de patientes ayant une IU, peu connue jusque-là, est majoritairement représentée par les femmes atteintes du syndrome MRKH. L’intérêt pour la TU semble réel, l’adoption voire la GPA ne semblant satisfaire ces patientes. Perspectives: Nous prévoyons d’évaluer la TU à partir de donneuses en état de mort encéphalique dans le cadre d’un PHRC national. Par ailleurs, nous continuons un entrainement chirurgical chez l’animal avec l’étude de la tolérance à l’ischémie reperfusion de l’utérus de brebis selon une période courte ou prolongée d’ischémie froide. / In case of uterine infertility, uterus transplantation could be an alternative to adoption or surrogacy. We performed different experimental, translationnal and clinical studies in the field of uterus transplantation. We assessed surgery of uterus retrieval, resistance of the uterus to cold ischemia, the HLA expression from the uterus and the demand from patients with uterine infertility for uterus transplantation.

Depuis plus de 30 ans, de nombreuses publications se sont attachées à expliquer la physiopathologie des anomalies morphologiques du spermatozoïde humain et ont mis en évidence des corrélations entre le pourcentage de formes normales et certaines anomalies fonctionnelles et des relations avec certains facteurs d'exposition. Le caractère physiologique de la plupart des " traits " morphologiques du spermatozoïde humain rend très difficile l'interprétation du spermocytogramme en dehors des syndromes d'anomalies monomorphes. A ces difficultés d'interprétation, viennent se rajouter le manque cruel de fiabilité analytique des techniques actuelles pour l'évaluation de la morphologie du spermatozoïde humain rendant très difficile l'utilisation de seuil décisionnel pour le choix d'une technique d'Assistance Médicale à la Procréation. Cette morphologie est classiquement observée sur lame après coloration (de Schorr le plus souvent). Il a récemment été développé une technique d'observation des spermatozoïdes mobiles associant un contraste interférentiel de Nomarski et un fort grossissement numérique et optique de x6000 au total permettant de mieux déceler certaines anomalies et notamment des vacuoles au niveau de la tête des spermatozoïdes. Cette technique est appelé MSOME (Motile Sperm Organelle MorphologyExamination). L'origine de ces vacuoles reste controversée, sont-elles d'origine nucléaire ou acrosomique ? Certains auteurs ont mis en évidence une relation entre la présence de larges vacuoles et des anomalies de condensation de la chromatine. De plus, beaucoup de questions subsistent quant au réel intérêt diagnostic du MSOME. Au cours d'un premier travail j'ai essayé d'amener un argument supplémentaire à l'origine des vacuoles. J'ai étudié le cas de deux patients atteints de globozoospermie totale (patients porteurs de spermatozoïdes sans acrosome confirmé par microscopie électronique). Au cours de ce travail, outre l'analyse morphométrique des vacuoles avec le MSOME, j'ai utilisé des techniques d'immunofluorescence (lectines PNA et anticorps anti-CD46) pour analyser le statut acrosomique et des techniques TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end labelling assay) et SCSA (spermchromatin structure assay) pour le statut nucléaire du spermatozoïde. Les deux patients avaient un nombre et une surface vacuolaire (6,3% et 5%) très similaires à celles de 12 témoins fertiles (5%) permettant d'exclure une origine acrosomique de la plupart de ces vacuoles. Je me suis ensuite intéressé à l'impact de la congélation du sperme (très utilisé en pratique clinique) sur l'apparition de ces vacuoles. Après analyse morphométrique précise à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image de plus de 2000 spermatozoïdes avant et après congélation (27 individus) je n'ai retrouvé aucune différence statistiquement significative en termes de nombre, surface et position de ces vacuoles entre avant et après congélation. De nombreux auteurs plaident en faveur d'une utilisation en pratique clinique de cette évaluation des vacuoles à fort grossissement sans qu'il n'y ait aucune donnée sur la présence de ces vacuoles dans une population de référence (témoins fertiles). J'ai donc réalisé une analyse morphométrique précise de ces vacuoles dans une population de 50 témoins fertiles. La très grande fréquence de ces vacuoles (95,8 %) dans cette population souligne le caractère physiologique de la plupart d'entre elles. / For over 30 years, many publications have sought to explain the pathophysiology of human sperm morphological abnormalities and showed correlations between the percentage of normal forms and functional defect and some relationships with some exposure factors. The physiological nature of most of the "features" of human sperm morphology makes the interpretation of human sperm morphology very difficult except for monomorphic defects. To these difficulties of interpretation, come to add the lack of analytical reliability of current techniques for assessing human sperm morphology making very difficult the use of threshold of normal forms for the choice of medical treatment of infertile couple in Assisted Reproductive Treatment. Recently a new aspect of sperm morphology, the head vacuoles, has shown to be of interest. The vacuoles can be easily observed using Nomarski interference contrast microscopy at high magnification: ×6000 to 10000 (optical magnification ×1000 associated with digital enhancements that achieves a final magnification up to 6000) even on motile spermatozoa (MSOME: Motile Sperm Organellar Morphology Examination). The origin of these vacuoles raises many questions. Several studies have found a link between chromatin condensation defects and the presence of sperm head vacuoles and clinical interest of MSOME is still somewhat debated. To add new arguments concerning the origin of the sperm-head vacuoles observed under high magnification with interference contrast microscopy, we carried out in two patients with total globozoospermia confirmed using transmission electron microscopy (TEM), a detailed sperm morphometric analysis with MSOME, an acrosomal status analysis (using fluorescent labelling with peanut agglutinin (PNA) lectins and anti-CD46 antibodies) and a nuclear status analysis (using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labelling assay TUNEL, sperm chromatin structure assay SCSA and aniline blue staining). Our two patients with globozoospermia had relative sperm vacuole areas of 6.3% and 5%, similar to those observed in a reference population of 12 fertile men (5.9%). This study provides further information on the non-acrosomal origin of the sperm-head vacuoles. Since the development of MSOME for observing the cephalic vacuoles at high magnification, no study as yet assessed the effect of cryopreservation on these vacuoles, although sperm freezing-thawing procedures are known to affect sperm quality. In 27 sperm samples from fertile men, morphological analysis at high magnification (·6000) using image analysis software was performed before freezing and after thawing, there was no evidence for any difference in any vacuolar criteria (relative vacuole area, total vacuole area, vacuole area in the anterior, median and basal parts of the head, percentage of spermatozoa with a vacuole area < 6.5% and percentage of spermatozoa with a vacuole area >13%). Freezing-thawing procedures have no effect on human sperm vacuoles. In order to establish reference values concerning sperm vacuoles and to know if the assessment of sperm vacuoles at high magnification can contribute to the explanation of idiopathic infertility, I investigated the number, position and area of sperm head vacuoles using an image analysis software in 50 fertile men and 50 infertile men were within couples who had unexplained infertility and were consulting in our centre. After analysis, the characteristics of sperm head vacuoles (number, area, position) are no different between fertile controls and patients with unexplained infertility.

La spermatogenèse est un processus complexe qui dépend de la coopération de nombreux gènes. Son produit final le spermatozoïde, est un sujet d’étude idéal car il renferme à la fois des indices d’événements passés ainsi que des informations qui seront transmises à l'ovocyte lors de la fécondation. L'identification de nouveaux acteurs de la spermatogenèse, des modifications spécifiques de l'ADN du sperme ou la présence de transcrits spécifiques pourraient servir comme biomarqueurs dans le diagnostic de l’infertilité. Cette thèse avait pour but d’analyser le génome, le transcriptome et l’épigénome de spermatozoïdes dans le contexte de l'infertilité masculine. Nous avons identifié de nouvelles causes génétiques et confirmé la présence d'anomalies de méthylation dans le sperme d'hommes infertiles. Nous avons découvert 20 mutations dans le gène SOX8, chez des patients atteints de trouble du développement sexuel ou d'infertilité masculine ou féminine, qui apparaît comme un régulateur du développement et de la fonction gonadique. Par séquençage d’exome, une mutation dans le gène ATAD2 modeleur de la chromatine spécifique de la lignée germinale mâle fut également identifiée. Par RNA-seq et MeDIP-chIP du sperme d’hommes fertiles et infertiles, nous avons caractérisé la signature transcriptionnelle du sperme. La majorité des ARNs spermatiques humain est remarquablement conservée chez les mammifères placentaires suggérant des fonctions ancestrales importantes. Enfin, nos données transcriptomiques et épigénétiques tendent à indiquer qu’une expression et une régulation adéquates des gènes impliqués dans le remodelage de la chromatine constituent un facteur clé pour la fertilité masculine. / Spermatogenesis is a complex process which depends on the cooperation of many genes. The end-product, the spermatozoon, is an ideal subject for study since it carries both clues of the past events and information which will be transmitted to the oocyte at fertilization. The identification of main actors of spermatogenesis, specific modifications of sperm DNAs or sperm specific isoforms could improve our understanding of a such complex mechanism and could serve as a determination of biomarkers or diagnostic tools for fertility. The aim of the project was to go further three omes: genome, epigenome and transcriptome of mature human sperm in the context of male infertility. We identified new genetic causes of male infertility and confirmed the presence of methylation abnormalities in sperm cells of infertile men. Firstly, SOX8 gene was found mutated in a cohort of 20 patients with disorder of sex development and male or female infertility. Similarly, to NR5A1, SOX8 appears to be a novel regulator of gonadal development and function. Then by exome-sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in the male germline-specific chromatin modeler ATAD2. Furthermore, RNA-seq and MeDIP-chIP of sperm from fertile and infertile men along with bioinformatics analyzes of the generated data, enabled us to characterize more deeply the normal sperm transcriptional signature. We also found that the majority of human sperm RNAs are remarkably preserved in placental mammals suggesting crucial ancestral functions. Finally, proper expression and regulation of chromatin remodelers seem to be critical for male fertility, as revealed by both the transcriptomic and the epigenetic data.

L’infertilité masculine est actuellement considérée comme un problème majeur qui pose une situation alarmante sur la santé publique. L’oligozoospermie, l’asthénozoospermie et la tératozoospermie sont les trois anomalies les plus connues des spermatozoïdes. Elles affectent, respectivement, la densité, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes. Un spermatozoïde anormal est très souvent corrélé à des altérations génétiques et épigénétiques qui peuvent affecter considérablement le transcriptome. Dans ce sens, le séquençage aléatoire du transcriptome entier des spermatozoïdes ou RNA-seq constitue un outil puissant pour caractériser ces maladies. Jusqu’à présent, il n’existe aucune étude exploitant des données RNA-seq chez des hommes présentant de telles anomalies spermatiques. L’objectif principal de notre étude fût d’identifier des profils distincts des modifications du transcriptome de chaque phénotype d’infertilité pour ainsi révéler des gènes-signatures qui tamponnent une spermatogenèse pathologiquePour ce faire, les transcriptomes des spermatozoïdes de 60 sujets infertiles atteints soit d’oligozoospermie, d’asthénozoospermie ou de tératozoospermie ont été comparés à ceux de 20 patients fertiles. Ces analyses supervisées nous ont conduit à identifier: (i) les gènes clés spécifiques aux différentes anomalies des spermatozoïdes (ii) les voies de signalisation associées, (ii) les différents longs ARNs non codants dérégulés dans ces anomalies. Au niveau de l’oligozoospermie, les transcrits de spermatozoïdes dérégulés étaient associées à divers stades de la spermatogenèse, y compris le cycle cellulaire méiotique, l’assemblage du complexe synaptonémal, la cohésion des chromatides sœurs, les processus métaboliques de piRNA, le processus catabolique protéique dépendant de la voie de l’ubiquitine, à la réponse aux dommages de l'ADN et particulièrement le processus de fécondation. Quant à l’asthenozoospermia, la spermatogenèse, l’assemblage du cil, des voies métaboliques reliées à la spermatogenèse, la chimiotaxie et la physiologie des cellules immunitaires ont été significativement dérégulés. De plus, ce qui nous a intéressé au plus était l’analyse des transcrits sous-exprimés qui a permis l’identification de nombreux transcrits associées aux modifications des histones. Nous avons aussi mis en évidence une sous expression des gènes différentiellement exprimés qui définit la tératozoospermie. Cette sous expression est associée au système ubiquitine-protéasome, à l’organisation du cytosquelette, au cycle cellulaire, à la SUMOylation en réponse aux dommages de l'ADN et aux protéines de réparation ainsi qu’à de nombreux modulateurs épigénétiques. Les gènes signature de l'oligozoospermie ont été liés au processus de fécondation et les composants de la matrice extracellulaire, tandis que ceux de la tératozoospermie sont liés à la spermatogenèse et la morphogenèse cellulaire, alors que les gènes signature de l'asthénozoospermie sont impliqués dans l'assemblage du ribosome et du flagelle. En complément de cette étude, nous avons réalisé une étude très globale du paysage épigénétique du sperme des hommes infertiles. Nous avons, ainsi comparé les niveaux des espèces réactives de l’oxygène (ERO), de méthylation de l’ADN, ainsi que l’intégrité de la chromatine dans les spermatozoïdes de 30 individus infertiles avec ceux de 33 individus fertiles. Nos analyses montrent des niveaux élevés d’ERO chez les individus infertiles. Ces niveaux sont d’une part négativement corrélés avec les niveaux de méthylation globale de l’ADN et d’autre part négativement corrélés avec ceux de la 5-hydroxyméthylcytosine et de la 5-formylcytosine (intermédiaire dans le processus de déméthylation active). Ces derniers suggèrent qu’une infertilité associée au stress oxydatif conditionne l’épigénome du sperme. En conclusion, l’ensemble de notre travail apporte des ressources précieuses et originales dans la compréhension des pathologies de sperme. / Male infertility is actually considered as a public alarming health problem. The sperm pathologies spectrum ranges between different phenotypes including oligozoospermia, asthenozoospermia and teratozoospermia depending on the sperm conventional parameters abnormalities. Abnormal sperm is characterized by genetic alterations and epigenetic alterations which can affect the transcriptome extensively. These alterations in RNA profiles are retrospectively indicative of aberrant spermatogenic events. RNA-seq is a powerful tool for comprehensive characterization of whole transcriptome. To date, RNA-seq analysis of sperm from infertile men has not been reported. Our objectives are: (i) recognize key clusters, key pathways and specific gene transcripts for different sperm abnormalities; (ii) catalog the spermatozoal lncRNAs in different sperm pathologies; (iii) identify signature genes which are mechanistically important in the cascade of events driving a pathological spermatogenesis; (iii) portray the global epigenetic landscape in sperm from infertile men. Expression data from 60 sperm samples from 3 groups of infertile men (oligozoospermia, asthenozoospermia, and teratozoospermia) were generated on Illumina HiSeq platform, compared to 20 fertiles, and the resulting gene expression patterns were analyzed for functional enrichment. Our supervised analyses identified numerous differentially expressed genes between fertile and infertile men. In oligozoospermia, the deregulated spermatozoal transcripts were associated with various stages of spermatogenesis including meiotic cell cycle, synaptonemal complex assembly, sister chromatid cohesion, piRNA metabolic process, ubiquitin-dependent protein catabolic process, cellular response to DNA damage stimulus and interestingly fertilization. As for asthenozoospermia, spermatogenesis, cilium assembly, metabolic-related pathways, chemotaxis and immune cell physiology were most significantly differentially expressed. Interestingly, numerous transcripts associated with histone modifications were highly down-regulated. With regards to teratozoospermia, we evidenced sperm-specific differentially expressed genes which are involved in the ubiquitin-proteasome, cytoskeleton organization, the cell cycle pathway, SUMOylation of DNA damage response and repair proteins, as well as many putative epigenetic modulators of gene expression.. We also attempted to identify distinct patterns of gene expression changes that were definite to the different abnormal sperm phenotypes in infertile men relative to controls. Signature genes of oligozoospermia were over-enriched by genes involved in fertilization and extracellular matrix components, while signature genes of teratozoospermia were enriched by genes involved in spermatogenesis and cellular components involved in morphogenesis, whilst signature genes of asthenozoospermia were enriched by genes implicated in ribosome and cilium assembly.We complemented this work by a parallel epigenetic analysis of the global epigenetic landscape in infertile men. We compared the levels of reactive oxygen species (ROS), DNA integrity and global epigenetic parameters in sperm from 33 infertile subjects with abnormal semen parameters compared to fertile individuals. We pointed out that infertile men are characterized by strikingly high levels of reactive oxygen species (ROS) which were in part negatively correlated with the global DNA methylation, and positively correlated with the levels of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine (active demethylation intermediates). These findings suggest that male infertility associated with oxidative stress shapes the sperm epigenetic landscape. In summary, this original work yielded a transcriptional portrait of sperm abnormalities and provided valuable resources that would further elucidate sperm pathologies.

La présente thèse vise à vérifier, auprès de personnes infertiles, la relation entre la sévérité contextuelle des stresseurs et l'évaluation subjective dans la détresse émotionnelle. Cette problématique s'inscrit dans le cadre des modèles socio-cognitifs du stress. Les sujets, composés de 60 couples infertiles consultant une clinique de fertilité sont interviewés individuellement à l'aide d'une entrevue semi-structurée qui vise à identifier et évaluer la sévérité contextuelle des événements de vie et des difficultés chroniques. Les sujets complètent une grille d'évaluation subjective pour chaque événement et difficulté identifiés au cours de l'entrevue; ils répondent également à des questionnaires sur leur état psychologique. A partir de ces données, quatre articles relatent les résultats obtenus. Le premier article atteste de la validité et de la fidélité des mesures. Le deuxième article rapporte les liens entre plusieurs variables socio-médicales liées à l'infertilité et la détresse émotionnelle, allant à l'encontre de plusieurs écrits qualitatifs ou théoriques. Le troisième et le quatrième articles traitent directement de l'association entre les stresseurs et la détresse émotionnelle. Les patrons d'association se révèlent différents pour les hommes et les femmes, et varient en fonction des types de stresseurs. Cependant, les résultats concordent avec une approche cognitive du stress, axée sur une interaction entre l'environnement et les perceptions individuelles

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.