<p>Apoptosis or programmed cell death is crucial for the resolution of inflammation, and phagocytosis of apoptotic cells initiates the release of actively anti-inflammatory responses from the phagocytes. Eosinophils are one of the most potent inflammatory cells in the body and is involved in a number of diseases, most commonly associated with parasitic infections and allergic diseases. Apoptosis in eosinophils is therefore one of the most important systems to avoid inflammation. This aim of the present investigation was to examine the mechanisms behind, and the consequences of this process in eosinophils. Apoptotic eosinophils have a unique surface receptor expression that indicates abilities to communicate with T-, B- and antigen presenting cells. They have a novel expression of CD49f, indicating an importance for binding to laminin or unknown functions of the VLA-6 receptor, possibly in the concept of phagocytosis of the apoptotic cell. </p><p>In apoptotic eosinophils the granules are translocated to the periphery of the cell, probably through a disruption of the cytoskeleton. This translocation makes the granules easily accessible and the apoptotic eosinophil can release considerable amounts of granule proteins in response to specific stimuli. The spontaneous release however, is decreased as compared with living cells. </p><p>Furthermore, the survival of eosinophils in response to an allergen challenge is increased in healthy subjects, but not in allergic patients. Mechanistically, this needs further investigation, but one theory is that it is due to the presence of specific IgE in patients in combination with differences in the response from the epithelial cells.</p>

Apoptosis or programmed cell death is crucial for the resolution of inflammation, and phagocytosis of apoptotic cells initiates the release of actively anti-inflammatory responses from the phagocytes. Eosinophils are one of the most potent inflammatory cells in the body and is involved in a number of diseases, most commonly associated with parasitic infections and allergic diseases. Apoptosis in eosinophils is therefore one of the most important systems to avoid inflammation. This aim of the present investigation was to examine the mechanisms behind, and the consequences of this process in eosinophils. Apoptotic eosinophils have a unique surface receptor expression that indicates abilities to communicate with T-, B- and antigen presenting cells. They have a novel expression of CD49f, indicating an importance for binding to laminin or unknown functions of the VLA-6 receptor, possibly in the concept of phagocytosis of the apoptotic cell. In apoptotic eosinophils the granules are translocated to the periphery of the cell, probably through a disruption of the cytoskeleton. This translocation makes the granules easily accessible and the apoptotic eosinophil can release considerable amounts of granule proteins in response to specific stimuli. The spontaneous release however, is decreased as compared with living cells. Furthermore, the survival of eosinophils in response to an allergen challenge is increased in healthy subjects, but not in allergic patients. Mechanistically, this needs further investigation, but one theory is that it is due to the presence of specific IgE in patients in combination with differences in the response from the epithelial cells.

Des études récentes ont montré que le microbiote participe à l’homéostasie intestinale en contribuant au développement morphologique, à l’éducation du système immunitaire, aux mécanismes de défense de l’hôte et à la régulation du métabolisme. Une dysbiose de ce microbiote ainsi qu’une réduction de la diversité bactérienne a été observé dans diverses pathologies chroniques telles que les maladies inflammatoires chroniques (MICI) et l’obésité. Le microbiote constitue donc une cible thérapeutique de choix dans la prise en charge de ces maladies chroniques. Les probiotiques, microorganismes bénéfiques pour l’hôte représentent une alternative intéressante, mais dont les critères de sélection nécessitent d’être améliorés.Dans une première étude, nous avons pu mettre en évidence les propriétés bénéfiques d’un mélange de deux probiotiques comprenant un bifide et un lactobacille dans un modèle murin d’obésité résultant d’une alimentation riche en graisses (Alard et al, 2016). Ce mélange probiotique a réduit significativement la prise de poids, amélioré les paramètres inflammatoires et métaboliques dont l’insulino-résistance, et augmenté l’expression intestinale des récepteurs aux acides gras à chaine courte (AGCC). Il a également favorisé dans un système d’intestin artificiel la production de butyrate et propionate ; principaux AGCCs. Les effets protecteurs ont été associés à l’amélioration de la dysbiose du microbiote, notamment la restauration de l’abondance d’Akkermansia muciniphila.L’objectif principal de cette thèse a été ensuite de sélectionner au sein d’une collection de 23 souches bactériennes provenant de la société PiLèJe, une ou plusieurs souche(s) probiotique(s) possédant des propriétés protectrices contre les MICI et l’obésité. Les propriétés immuno-modulatrices des souches ainsi que leur capacité à renforcer la barrière intestinale ont été étudiées in vitro à l’aide cellules mononuclées sanguines humaines, puis dans un modèle in vitro de perméabilité membranaire, induite par la sensibilisation d’une monocouche de cellules Caco-2 par de l’eau oxygénée. Six souches ont été sélectionnées, cinq souches induisant de forts niveaux de la cytokine anti-inflammatoire IL-10 et capables de restaurer la barrière intestinale et une souche capable de renforcer fortement cette barrière. Ces souches ont été ensuite évaluées en modèles in vivo de colite chronique et aigüe induite par du TNBS (2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid). De façon intéressante les souches protégeant en colite aigüe ne protègent pas aussi efficacement en colite chronique et inversement.Nous avons poursuivi la sélection de souches ou mélanges de souches dans le contexte de l’obésité et des maladies métaboliques associées. Nous avons utilisé les mêmes critères que précédemment (capacités anti-inflammatoires et à restaurer la barrière intestinale) complétés par l’étude de la capacité des souches à limiter l’accumulation des lipides dans un modèle in vitro de différenciation adipocytaire basé sur l’utilisation de la lignée 3T3-L1 et à induire la sécrétion de peptides entéro-endocrines impliqués notamment dans la satiété par l’utilisation de la lignée murine de cellules entéro-endocrine STC-1. Trois mélanges de souches et une souche seule ont été sélectionnées et évaluées dans un modèle murin d’obésité induite par un régime hyperlipidique à 45% de gras. Nous avons pu mettre en évidence des capacités positives d’un mélange de deux souches et d’une souche seule à réduire la prise de poids, ainsi que l’inflammation dans le tissu adipeux.Ces résultats indiquent que des criblages in vitro basés sur l’étude des propriétés immunomodulatrices, des capacités à restaurer la barrière, à diminuer l’accumulation des lipides et à induire des peptides de satiété, permettent une pré-sélection de souches ou mélanges de souches ayant un effet protecteur et démontrent à nouveau que les capacités bénéfiques des probiotiques sont souche-dépendantes et spécifiques des modèles ciblés. / Recent studies have reported that the microbiota is involved in intestinal homeostasis by contributing to the morphological development, the education of the immune system, the mechanisms of defense, and to metabolic regulation. Dysbiosis of this microbiota as well as reduction in bacterial diversity has been observed in various chronic pathologies such as chronic inflammatory diseases (IBD) and obesity. The microbiota thus constitutes a therapeutic target of choice in the management of these chronic diseases. Probiotics, which are beneficial microorganisms for the host represent therefore an interesting alternative, however their selection criteria need to be improved.In a first study, we were able to highlight the beneficial properties of a mixture of two probiotics comprising a bifidobacteria and a lactobacilli, in a murine model of high fat diet (HFD)-induced obesity (Alard et al., 2016). This probiotic mixture significantly reduced weight gain, improved inflammatory and metabolic parameters including insulin resistance, and increased intestinal expression of receptors involved in short-chain fatty acid (AGCC) recognition. It also promoted in an artificial intestinal system the production of butyrate and propionate, the two main AGCCs. The protective effects were associated with the improvement of microbiota dysbiosis, in particular the restoration of the abundance of Akkermansia muciniphila.The main objective of this thesis was then to select within a collection of 23 bacterial strains provided by PiLèJe, one or more probiotic strain (s) possessing protective properties against IBD and obesity. Immunomodulatory properties of the strains and their ability to strengthen the intestinal barrier were studied in vitro using human mononuclear blood cells and an in vitro model of epithelial permeability induced by the sensitization of a Caco-2 cells monolayer with hydrogen peroxide. Six strains were selected, five strains inducing high levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and capable of restoring the intestinal barrier and a strain capable of strongly reinforcing this barrier. These strains were then evaluated in in vivo models of TNBS (2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid)-induced chronic and acute colitis. Interestingly, strains able to rescue mice from acute colitis did not protect as efficiently in chronic colitis and vice versa.The selection of strains or mixtures was then pursued in the context of obesity and associated metabolic diseases. We used the same criteria as previously (anti-inflammatory capacities and to restore the intestinal barrier) in addition with the capacity of the strains to limit the accumulation of lipids in an in vitro model of adipocyte differentiation based on the use of the 3T3-L1 cell line and to induce the secretion of entero-endocrine peptides, notably involved in satiety, by the use of the murine STC-1 entero-endocrine cell line. Three mixtures and one single strain were selected and evaluated in a mouse model of obesity induced by 45% HFD diet. We demonstrated the positive capacities of a mixture composed of two strains and the single strain to reduce weight gain, as well as adipose tissue inflammation.These results indicate that in vitro screenings based on the immunomodulatory properties, the capacity to restore the gut barrier, to decrease lipid accumulation and to induce gut peptides allow pre-selection of strains or mixtures exhibiting protective effects and demonstrate that the beneficial capacities of probiotics are strain-dependent and specific to the targeted models.

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Introduction: Bone is a highly active tissue throughout life and is a subject to constant remodelling. Main cells responsible for continuous resorption and de novo synthesis of bone matrix are osteoclast, osteoblasts and osteocytes. Osteoclasts are the only known type of cells able to resorb bone. These cells are formed by fusion of precursor cells in bone marrow or peripheral blood in a process called osteoclastogenesis. Formation of osteoclasts may be of importance concerning chronic inflammatory diseases that are linked with higher risk of developing osteoporosis during lifespan. Celiac disease is one of those diseases, which is characterized by destruction of intestinal mucosa after ingestion of gluten by susceptible individuals followed by induction of chronic inflammation. In this work, we focused on the potential role of osteoclastogenesis in the development of osteoporosis in patients with celiac disease and we studied roles of selected inflammatory agents (TNF-α, IL-6, IFN-γ a cfDNA) with supposed or hypothesised effects on osteoclastogenesis. Material & Methods: We obtained plasma and serum samples from newly diagnosed patients with celiac disease, patients on gluten free diet and healthy controls and analysed concentrations of cfDNA and inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IFN-γ in...

Les anticorps monoclonaux anti-cytokine ont constitué une révolution dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques, mais leur utilisation présente des inconvénients (non réponse, résistance, effets secondaires, coûts élevés).Notre équipe développe une stratégie alternative originale, l’immunisation active à base de peptides de cytokines. Elle a pour but de faire synthétiser, par l’organisme même du patient, des anticorps neutralisant les effets pathogènes dus à l’excès de cytokines.Durant ma thèse, j’ai montré que l’immunisation active contre un peptide dérivé de l’IL-6 murine est protectrice dans un modèle murin de sclérodermie systémique. L’immunisation de singes avec l’équivalent humain entraîne une réduction significative des réactions inflammatoires locales suite à l’induction d’une réaction d’HSR. De plus, l’immunisation active contre deux peptides dérivés de l’IL-1β et de l’IL-23 conduit à la réduction de la sévérité de l’EAE.Ces résultats confortent l’intérêt de cibler les cytokines par l’approche d’immunisation active à base de peptides, qui pourra permettre de diversifier l’offre thérapeutique actuellement disponible. / Monoclonal antibodies have been a revolution for the treatment of chronic inflammatory diseases, but their use shows major drawbacks (non-response, resistance, side effects and prohibitive costs).Our team develops an original alternative strategy: anti-cytokine peptide-based active immunization.The aim of the approach is to make the patient’s own organism produce antibodies capable of neutralizing the pathogenic effects of cytokine overproduction.During my PhD, I have demonstrated that active immunization against an IL-6 murine peptide confers clinical protection in a murine model of systemic sclerosis. Monkeys immunized against the human peptide also showed a significant decrease of local inflammatory reactions following a delayed-type hypersensitivity reaction. Moreover, active immunization against an IL-1β and an IL-23 murinepeptide led to a reduction of the severity of the EAE in mice.These results comfort the interest of anti-cytokine peptide-based active immunization, which should eventually widen the choice of therapeutics available for the patients.

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Les maladies immunitaires chroniques incluant les maladies auto-immunes et inflammatoires touchent 20 à 25% de la population des pays occidentaux. La comparaison des taux de concordance chez les jumeaux ou l’histoire familiale de sujets atteints de la maladie cœliaque (maladie auto-immune de l’intestin) ou de l’œsophagite éosinophilique (maladie inflammatoire de l’œsophage) indiquent que des facteurs génétiques et environnementaux interviennent dans la susceptibilité à ces maladies. Cependant, ces études ne distinguent pas de manière claire la prédisposition génétique selon l’hétérogénéité clinique (enfants versus adultes) ou ethnique (stratification des populations). Méthodes. Les haplotypes HLA de prédisposition à la maladie cœliaque et les polymorphismes des gènes candidats IL-13 (R130Q), IL-5 (-746 T/G) et IL-5R (-80A/G) impliqués dans la physiopathologie de l’œsophagite éosinophilique, ont été caractérisés par la technique PCR-SSP sur l’ADN génomique. Résultats: Nos études familiales et cas-contrôles réalisées chez une population Québécoises avec un fond génétique très homogène nous a permis : i) d’éviter le problème de stratification des populations, ii) de confirmer que les gènes HLA sont également associés à la maladie cœliaque (enfants et adultes) au Québec comme dans les autres populations Caucasiennes, iii) de mettre en évidence le rôle du gène IL-13 dans la prédisposition à l’œsophagite éosinophilique (garçons et filles) et d’exclure les gènes IL-5 et IL-5R comme facteurs de susceptibilité dans notre population. Conclusion: Ce travail confirme pour la première fois l’impact des gènes HLA dans la prédisposition à la maladie cœliaque et le rôle du facteur génétique dans l’œsophagite éosinophilique chez une population Canadienne Française avec un fond génétique ayant un fort effet fondateur. / Chronic immune diseases including autoimmune and inflammatory diseases affect 20 to 25% of Western country population. The higher concordance of disease in twins or in first-degree relative of patients with celiac disease (bowel autoimmune disease) or eosinophilic esophagitis (inflammatory disease of the esophagus) indicate that genetic and environmental factors are involved in susceptibility to these diseases. However, these studies do not distinguish clearly genetic predisposition according to clinical heterogeneity (children versus adults) or ethnicity (population stratification). Methods: HLA haplotypes predisposing to celiac disease and polymorphisms of candidate genes IL-13 (R130Q), IL-5 (-746 T / G) and IL-5R (-80A / G) involved in physiopathology of eosinophilic esophagitis, have been evaluated by PCR-SSP on genomic DNA. Results: Our familial and case-control studies performed in populations having a very similar genetic background with a strong founder effect, allowed us: i) to avoid the problem of population stratification, ii) to confirm that HLA genes are also associated with celiac disease in Quebec (children and adults) as in other Caucasian populations, iii) to identify the role of IL-13 gene in susceptibility to eosinophilic esophagitis (boys and girls) and to exclude IL-5 and IL-5R genes as susceptibility factor in our population. Conclusion: This study confirms for the first time the impact of HLA genes in predisposition to celiac disease and the role of genetic factors in eosinophilic esophagitis in a French Canadian population with a strong founder effect.

Les cellules lymphoïdes innées (ILCs) sont des populations cellulaires d’identification récente, mais leur rôle in vivo chez l’homme reste mal connu. Dans une 1ère étude, nous avons pu montrer qu’un déficit sévère en NK au cours de déficits immunitaires communs variables est associé à un risque accru de manifestations non infectieuses et infectieuses bactériennes sévères, suggérant un rôle protecteur non redondant des cellules NK lorsque le système immunitaire adaptatif n’est pas fonctionnel. Dans une 2ème étude, nous avons montré que des patients atteints de déficits immunitaires combinés sévères ɣc et JAK3 déficients n’ont pas d’ILCs. Après allogreffe de moelle osseuse, le nombre d’ILCs circulantes reste indétectable, sans manifestation clinique notable associée. Ces résultats sont en faveur d’une redondance des fonctions des ILCs chez l’homme, lorsque les fonctions T et B sont conservées. Nous avons ensuite étudié les modifications phénotypiques et fonctionnelles des cellules NK au cours du purpura thrombopénique immunologique, et observé un défaut de production d’interféron-ɣ par les cellules NK circulantes et une augmentation de la cytotoxicité dépendante des anticorps des cellules NK spléniques. Une inhibition des fonctions des cellules NK par les immunoglobulines polyvalentes est également mise en évidence. Enfin, une étude des ILCs circulantes au cours de la maladie associée aux IgG4 ainsi qu’une revue de la littérature sur l’étude des ILCs au cours des pathologies inflammatoires sont rapportées. En conclusion, l’apparente redondance des ILCs chez l’homme ainsi que leur implication en pathologies inflammatoires en font de potentielles cibles thérapeutiques. / Innate lymphoid cells (ILCs) are recently identified components of the immune system, but their functions in vivo in humans are still elusive. In a first study, we show in patients with common variable immunodeficiency that non-infectious inflammatory complications and severe bacterial infections were more frequent in patients with severe NK cell lymphopenia, indicating potential non-redundant immune functions of NK cells when the adaptive immune response is not optimal. In a second study, we observe that in patients with ɣc and JAK3 severe combined immunodeficiencies, all ILC subsets are absent. After hematopoietic stem cell transplantation, ILCs remain indetectable with no susceptibility to disease, suggesting that ILCs might be redundant and dispensable in humans, if T and B cells functions are preserved. In the second part of this thesis, we study phenotypic and functional modifications of NK cell compartment in primary immune thrombocytopenia. Interferon gamma production by the peripheral blood NK cells of ITP patients is decreased. In contrast, splenic NK cells of ITP patients tend to be more efficient in antibody-dependent cell cytotoxicity. Intravenous polyvalent immunoglobulins lead to the inhibition of blood NK cell activation. Finally, we present the preliminary results of a study investigating the modifications of circulating ILCs in IgG4-related disease, and present an extensive litterature review concerning the role of ILCs in inflammatory diseases. In conclusion, the apparent redundancy of ILCs for protective immunity and their pathogenic role in inflammatory diseases make their targeting in humans for therapeutic purposes particularly promising.

Peptiderge Mediatoren sind neben ihrer Funktion bei der Aufrechterhaltung der körpereigenen Homöostase unter physiologischen Bedingungen auch bei der Regulation pathopysiologischer und pathobiochemischer Prozesse chronisch-entzündlicher Erkrankungen maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde diese Rolle durch Untersuchung des Expressionsprofils peptiderger Mediatoren und ihrer Rezeptoren unter normalen Bedingungen charakterisiert und auf dieser Grundlage Veränderungen des Mediatorstoffwechsels bei entzündlichen Erkrankungen erfasst. Aufgrund der geringen Kenntnisse bezüglich der Rolle anti-inflammatorischer Mediatoren wurde dabei insbesondere die Expression und Genregulation des Mediators VIP und seiner Rezeptoren untersucht. Dabei wurden molekularbiologische Methoden verwandt, um definierte Rezeptoren für VIP und verwandte Mediatoren in den Atemwegen und der Haut zu identifizieren. Im Anschluss daran wurde anhand verschiedener entzündlicher Erkrankungen der oberen Atemwege nachgewiesen, dass sich das peptiderge Mediatorprofil krankheitsspezifisch ändert und diese Subgruppen-spezifischen Änderungen nicht als ein universelles Epiphänomen der Entzündungsreaktion zu sehen sind. Ebenso konnte die Veränderung der Genexpression von Rezeptoren für peptiderge Mediatoren untersucht werden, wobei am Beispiel der Hypoxie die Induktion eines in den Atemwegen exprimierten Rezeptors nachgewiesen wurde. Am Beispiel der atopischen Dermatitis konnte darüber hinaus bewiesen werden, dass die Expression von VIP-Rezeptoren im Rahmen einer allergischen Erkrankung vermindert sein kann. Letztlich wurden ebenfalls mit VIP interferierende Transduktionsmechanismen untersucht, wobei die genauen Interaktionen peptiderger Mediatoren mit diesen intrazellulären Molekülen im Rahmen entzündlicher Erkrankungen noch aufzuschlüsseln sind. Die Ergebnisse der vorliegenden kumulativen Arbeit weisen in ihrer Gesamtheit auf eine wesentliche Bedeutung neurogener Mediatoren für pathophysiologische Mechanismen allergisch-entzündlicher Erkrankungen der Atemwege und Haut hin und lassen zukünftige therapeutische Ansätze auf Basis neuro-immunmodulierender Mechanismen sinnvoll erscheinen. / Peptidergic mediators participate next to their physiological role for numerous aspects of systemic and local homeostasis also in the regulation of pathophysiological and pathobiochemical processes in chronic inflammatory diseases. In the present study this role was investigated by assessing the expression profiles of peptidergic mediators and their receptors under physiological conditions. Basing on these findings differences of the mediator expression in inflammatory diseases were examined. Due to the relatively little knowledge on the role of potentially anti-inflammatory mediators the expression and gene regulation of the mediator VIP und its receptors were analysed. In this respect molecular techniques were used to assess distinct receptors for VIP and related mediators in the airways and skin. IN a next Step inflammatory diseases of the upper respiratory tract were examined and it was shown that the peptidergic mediators profile changes in relation to the disease entity and that this disease subtype-specific change is not a universal epiphenomenon of the ongoing inflammation. Also, alterations in the gene expression of peptidergic mediator receptors were analysed. Using hypoxia as an example the gene induction of airway-expressed receptors was demonstrated in relation to this stimulus. In further studies involving atopic dermatitis tissues a down-regulation of VIP receptor expression was demonstrated for allergic inflammatory conditions. In a last step VIP interfering signal transduction mechanisms were examined and future studies need to be carried out to fully assess the regulation of these interactions in relation to chronic inflammatory processes. The present results demonstrate an important role of neurogenic mediators in the pathophysiology of allergic inflammatory diseases of the airways and the skin and point to a potential use of neuro-immunomodulation in the future therapy of these diseases.